孔雀绿是一种带有金属光泽的绿色晶体，是有毒的三苯甲烷类人工合成有机化合物，是杀真菌剂，可致癌，孔雀绿作为染色剂通常用于皮革、纸张、丝绸的染色[1]。近年来，孔雀绿染料废水的处理受到越来越多研究者的关注，一般的处理方法并不能彻底解决染料废水的问题。一种新型的真菌菌丝球处理染料废水方法得到了广泛研究[2-3]，已有大量文献报道，但是大多数都停留在生物吸附阶段[4-6]，而染料被吸附后是否降解鲜有报道。锰过氧化物酶(MnP)是一种依赖于Mn2+的含血红素的过氧化物酶，已有的木质素真菌中都有MnP，目前已从多种白腐真菌中分离纯化得到MnP[7]。MnP是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，含有一系列的糖基化同工酶，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢、氧化酚类、胺类化合物和烃类氧化产物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类、醛类、苯类毒性的双重作用[8-9]。作者以实验室分离筛选的2株高效降解木质素的菌株——真菌烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和细菌荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)制备复合菌丝球，初步研究了复合菌丝球在不同培养时间、初始pH值、投加量、培养温度下对孔雀绿染料液脱色的影响，同时研究了MnP对孔雀绿染料液脱色的影响。

1 实验

1.1 试剂、菌种及培养基

孔雀绿(最大吸收波长λmax=617 nm),上海中秦化学试剂有限公司;其余试剂均为国产分析纯。

烟曲霉、荧光假单胞杆菌，实验室保藏。菌种保藏用PDA培养基，活化用LB培养基。

菌丝球成球培养基(g·L-1)：葡萄糖10，NH4Cl 2，KH2PO4 2，MgSO4·7H2O 2，加蒸馏水配成1 000 mL，pH值自然，121 ℃灭菌20 min。

技术转移办公室要向更为专业的技术转移公司发展，分步骤、分阶段建立可以覆盖科研成果转化全链条的专业机构，以专业机构为主体统筹配置资源，将政府、高校、企业、科研人员等多个主体有效链接起来。政府拨款、制定相关政策，支持技术开发和转化，企业专注于市场和销售，科研人员专注于科学研究、追求更好更新的科研成果，各方各司其职，整个转化链高效运营。借鉴国外先进经验，采用现代公司化管理方式，根据科研成果转化全链条的需求设立相应岗位和部门。

管道的运行温度为60 ℃，无保温层且所处环境较温和，查表5得碳钢外部腐蚀速率为0.05 mm/a，在该腐蚀速率的基础上，需要进一步考虑管道实际情况，修正腐蚀速率。综合考虑管道无涂层、无支管、有管托和无界面补偿，最终得到腐蚀速率Cr=0.05×1.0×2.0×1.0=0.1 mm/a，进而得到Art=0.03，最后得到

1.2 方法

1.2.1 种子液的制备

取培养液以8 000 r·min-1离心2 min,在617 nm处测定上清液的OD值。以未投加复合菌丝球的孔雀绿染料液作为对照。按下式计算孔雀绿的脱色率：

在无菌环境下将保藏的烟曲霉与荧光假单胞杆菌用接种环挑取少许放入LB培养基中，35 ℃培养24 h，即得种子液。

该含水岩组主要分布于挠力河低平原，含水岩组由中更新统浓江组、上更新统别拉洪河组及全新统的砂、砂砾石组成。含水层厚度一般为20～30 m，从山前向低平原中部方向由薄变厚，最厚达68.65 m。地下水类型大多属弱承压水或潜水，富水性从弱到强，按单井涌水量大小可分为水量极丰富区、水量丰富区、水量中等区、水量贫乏区等4个富水区。

式中：OD0为未投加复合菌丝球的孔雀绿染料液的OD值；ODt为投加复合菌丝球t时刻孔雀绿染料液的OD值。

1.2.3 锰过氧化物酶活性的测定

粗酶液的制备：发酵液在6 000 r·min-1、4 ℃下离心10 min。

锰过氧化物酶活性的测定：4 mL反应体系中含3.4 mL 50 mmol·L-1(pH=4～5)的乙酸钠缓冲液、 0.1 mL 1.6 mmol·L-1的硫酸锰溶液、0.4 mL粗酶液,预热至37 ℃，加入0.1 mL 1.6 mmol·L-1的H2O2溶液。在240 nm下测定3 min内的吸光度差值。在对照组中，以灭活的粗酶液代替原酶液，蒸馏水代替H2O2，其它反应物不变。

1 min使1 μmol·L-1的Mn2+转化为Mn3+所需的酶量为一个酶活单位(U)[11]。

1.2.4 复合菌丝球对孔雀绿染料液的脱色实验

液体产酶培养基(g· L-1)：NH4Cl 1 ，KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 0.5，蔗糖10，加蒸馏水配成1 000 mL，pH值自然，121 ℃灭菌20 min[10]。

用双层纱布过滤已培养好的复合菌丝球，并将复合菌丝球用生理盐水冲洗3次。洗脱复合菌丝球的碎屑，过滤，用滤纸吸干复合菌丝球表面水分[12]。将一定量的复合菌丝球投加到装有50 mL 100 mg·L-1孔雀绿染料液的250 mL锥形瓶中，在30 ℃、160 r·min-1下培养24 h，所有操作均在无菌条件下进行。

1.2.2 复合菌丝球的制备

复合菌丝球投加量为10 g·L-1，研究在30 ℃、160 r·min-1的恒温振荡器中培养的复合菌丝球对孔雀绿染料液的脱色效果，结果如图1所示。

1.2.5 脱色率的测定[13-15]

临床教学目标是从学生转向临床医师的重要途径，是评价学生学习治疗的重要指标。妇产科学因实践性、专业性较强，女性患者对患病部位敏感性较高，在临床诊疗过程中增加妇产科临床教学难度。在有限时间内完成教学目标并且实现教学目的是现阶段妇产科学临床教学中重点探究的内容[1]。目标管理从现代教育理论出发，分解教育目标，通过目标控制提升学生学习积极性。临床路径作为一种新兴的质量效益型管理模式，在医院临床教学模式中使用广泛，规范医疗流程效果显著[2]。本次实验联合目标管理与临床路径，探究其在妇产科学临床教学中的应用效果，现将实验过程总结汇报如下。

2018年11月，第二十六届世界计量组织大会将在巴黎召开，届时将对我们所熟知的基本计量单位做出重大调整。千克作为国际单位制中质量的基本单位，将基于普朗克常数进行重新定义，而沿用了129年的国际千克原器也将退出历史舞台。

脱色率

（3）种植大户用于稻麦种植的土地租金约为900元/667 m2，养殖用地租金约为1 100元/667 m2。其中杂交稻育种大户与种子公司合作，由种子公司提供技术和销售途径，整个生产过程已基本实现机械化，并利用无人机进行监测与农药的喷施。稻麦种植大户更愿意选用熟悉稳妥的高产稻麦品种，除了部分地区水稻仍为人工插秧，生产过程基本实现机械化。农业保险与商业保险普及率较高，政府提供农业保险补贴与秸秆还田补贴（25元/667 m2）。产品价格受市场调控，波动较大，近年价格偏低，种植大户收益较低，甚至出现亏损现象。

在250 mL锥形瓶中加入100 mL成球培养基，121 ℃灭菌20 min。将烟曲霉种子液2 mL、荧光假单胞杆菌种子液4 mL接入成球培养基中，放入恒温振荡器，在30 ℃、160 r·min-1下培养3 d，形成直径为5～6 mm的复合菌丝球，放入4 ℃冰箱，备用。

2 结果与讨论

2.1 培养时间对孔雀绿脱色率的影响

西班牙著名思想家加塞特说过：志向远大方能进步，目光长远才能前行。从刚入行的懵懂青年到现在掌管一家企业，已到不惑之年的汪宗星在人生的每一个阶段都有着清晰的目标，并全力去实现着。岁月打磨掉了他曾经的青涩和不羁，换来的是如今的睿智与成熟。

  

图1 培养时间对孔雀绿脱色率的影响Fig.1 Effect of culture time on decolorizationrate of Malachite Green

从图1可以看出，培养时间为2～6 h时，随着培养时间的延长，脱色率迅速增大；培养时间为12 h时，脱色率达到最大，为99.43%，随后脱色率保持稳定。这是因为，在初期，复合菌丝球表面的吸附位点尽可能多地与染料液接触，从而迅速吸附染料，当培养时间为12 h时，复合菌丝球的吸附位点已经全部利用完。据文献[10]报道，烟曲霉单一菌丝球对孔雀绿的吸附率仅为64.32%。可见复合菌丝球在染料废水处理方面有着极大的应用前景。考虑到能源的损耗，后续实验中培养时间以12 h为宜。

2.2 初始pH值对孔雀绿脱色率的影响(图2)

  

图2 初始pH值对孔雀绿脱色率的影响Fig.2 Effect of initial pH value on decolorization rateof Malachite Green

初始pH值会影响染料的化学性质及菌丝球表面的结构。从图2可以看出，当初始pH值为2～5时，随着初始pH值的增大，孔雀绿脱色率迅速增大，并在初始pH值为5时达到最大；之后随着初始pH值的增大，脱色率缓慢减小。这是因为，复合菌丝球本身产酸，适应了在酸性环境中的生长，复合菌丝球活性较高，因而具有较高的吸附能力，不会因为酸性而影响复合菌丝球表面的结构；在碱性环境中，多糖溶解度升高，复合菌丝球表面的聚合物变得不稳定，复合菌丝球出现自溶现象，溶液变得浑浊。但是研究发现，复合菌丝球在处理结晶紫染料液时在碱性环境中脱色率较大，这可能跟染料液本身有一定的关系，随着pH值的变化，复合菌丝球表面的正负电荷也相应变化，在碱性环境中，当染料液是阴离子时，复合菌丝球与染料液间的静电排斥作用增大，脱色率减小；当染料液是阳离子时，复合菌丝球与染料液间静电排斥作用减小，脱色率增大。因此，初始pH值以5为宜。

2.3 复合菌丝球投加量对孔雀绿脱色率的影响(图3)

  

图3 复合菌丝球投加量对孔雀绿脱色率的影响Fig.3 Effect of dosage of composite mycelialpellets on decolorization rate of Malachite Green

从图3可以看出，投加量为5 g·L-1、10 g·L-1时，孔雀绿的脱色率几乎没有差别，而投加量为20 g·L-1时，孔雀绿的脱色率明显低于5 g·L-1、10 g·L-1时的脱色率。这是因为，当投加量为5 g·L-1、10 g·L-1时，复合菌丝球能够尽可能多的与染料液接触，碰撞几率增加；当投加量为20 g·L-1时，复合菌丝球增多，在现有的空间内与染料液接触越难，碰撞几率下降，从而导致脱色率不理想。因此，考虑到成本与脱色率，选择复合菌丝球投加量为5 g·L-1，培养时间为12 h。

2.4 培养温度对孔雀绿脱色率的影响(图4)

  

图4 培养温度对孔雀绿脱色率的影响Fig.4 Effect of culture temperature ondecolorization rate of Malachite Green

从图4可以看出，培养温度为20～45 ℃时，孔雀绿的脱色率呈先增大后减小的趋势，在35 ℃时达到最大。这是因为，培养温度对复合菌丝球的生长有着重要的作用，在35 ℃下，复合菌丝球的直径、干湿比、弹性最好，最有利于对染料液的处理。因此，培养温度以35 ℃为宜。

辨证施治:视病情辨证分成三型:气虚血瘀型:半身不遂,口眼歪斜,言语謇涩,神疲物力,面白少华,头晕心悸,舌质淡或有瘀点,苔薄白,脉沉细或弦细。治宜益气活血,祛瘀通络,药方为补阳还五汤加减;肝阳上亢型:有高血压史,常头痛,眩晕,心烦易怒,口干口苦,失眠多梦,偏瘫者血压变高,以上症状加剧,口眼歪斜,言语謇涩,脉弦滑或弦数,苔薄黄或黄腻。治宜育阴潜阳,平肝熄风。药方为镇肝熄风汤加减;心肾阳虚型:意识朦胧或痴呆,记忆力差,舌强语謇,肢体不遂,畏寒肢冷,心悸气短,眩晕耳鸣,血压偏低,舌红干或胖嫩,苔白,脉沉细。治则滋阴补阳,熄风开窍。药方为地黄饮子加减。1剂/d,煎熬取汁,早晚温服。治疗3个月。

2.5 初始pH值对MnP酶活的影响(图5)

  

图5 初始pH值对MnP酶活的影响Fig.5 Effect of initial pH value on MnP activity

从图5可以看出，随着初始pH值的增大，MnP酶活呈先增大后减小的趋势，在初始pH值为5时，酶活达到最大，为85.11 U·L-1，此时孔雀绿脱色率也达到最高，为99.43%。说明适宜的pH值有利于产酶，尤其是在酸性环境中。因为由烟曲霉与荧光假单胞杆菌建立的共固定化复合菌丝球产酸，有利于在酸性环境下产酶。复合菌丝球在处理孔雀绿染料液时，在酸性环境下更具脱色能力，同时MnP有一定的降解和脱毒能力。

复合菌丝球在处理孔雀绿染料液12 h之后，溶液清澈，复合菌丝球几乎将所有的染料都吸附在复合菌丝球里。复合菌丝球易于固液分离，沉降速度快，用量少，培养方式简单，在脱色过程中不污染环境，不产生有毒代谢物，还能够重复利用。

3 结论

将由烟曲霉与荧光假单胞杆菌制备的复合菌丝球用于孔雀绿染料液的处理。结果表明，初始pH值对孔雀绿的脱色率影响最大，不但影响复合菌丝球的生长，还对产锰过氧化物酶有一定的影响。复合菌丝球在初始pH值为5、投加量为5 g·L-1、35 ℃、160 r·min-1的条件下振荡培养12 h，对孔雀绿的脱色率可达到99%以上，同时锰过氧化物酶对染料液有一定的降解及脱毒能力，几乎能够达到处理污水的目的。

复合菌丝球作为新型的绿色吸附剂为染料废水的处理提供了新的途径与方法。

参考文献：

[1] 王国惠.霉菌菌丝球WL对孔雀绿染料脱色性能研究[J].微生物学杂志,2008,28(6):19-23.

WANG G H.Malachite green decolorization performance of mold hyphal pellet WL[J].Journal of Microbiology,2008,28(6):19-23.

[2] 王明霞.海洋微紫青霉菌丝球的制备及其对染料吸附性能的研究[D].杭州：浙江大学,2014.

WANG M X.Preparation of marine Penicillium janthinellum pellet and its application in biosorption of dyes[D].Hangzhou:Zhejiang University,2014.

[3] 陈慧英.由高产木质纤维素酶的海洋微生物组成的双菌种固定化体系的构建及应用[D].杭州：浙江大学,2014.

CHEN H Y.Construction of a novel two-specie whole-cell immobilization system by marine-derived fingi and its application[D].Hangzhou:Zhejiang University,2014.

[4] BUFFO M M,CORRA L J,ESPERANÇA M N,et al.Influence of dual-impeller type and configuration on oxygen transfer，power consumption,and shear rate in a stirred tank bioreactor[J].Biochemical Engineering Journal,2016,114:130-139.

[5] 范天黎,席宇,姚东升,等.土曲霉M11菌丝球对结晶紫的吸附脱色研究[J].化学与生物工程,2010,27(3):77-79.

FAN T L,XI Y,YAO D S,et al.Study on biosorption of crystal violet by mycelial pellets of Aspergillus terreus M11[J].Chemistry & Bioengineering,2010,27(3):77-79.

[6] 陆涛.海洋黑曲霉菌丝球的形成机理及其对含染料废水的脱色作用[D].杭州：浙江大学,2016.

LU T.The pellet-formation mechanism of marine-derived Aspergillus niger and its application in dye-wastewater treatment[D].Hangzhou：Zhejiang University,2016.

[7] 胡明,卢雪梅,高培基.锰过氧化物酶的结构与功能[J].中国生物工程杂志,2003,23(3):30-34.

HU M,LU X M,GAO P J.Structure and function of manganese peroxidase[J].Journal of Chinese Biotechnology,2003,23(3):30-34.

[8] 王蓓,王圆,周晓云,等.锰过氧化物酶(MnP)的研究进展[J].化工技术与开发,2005,43(4):28-31.

WANG B,WANG Y,ZHOU X Y,et al.Study advance of manganese peroxidase(MnP)[J].Technology & Development of Chemical Industry,2005,43(4):28-31.

[9] 余梅,阮小文,谭丽泉,等.白腐真菌产锰过氧化物酶的研究[J].化学与生物工程,2014,31(11):40-44.

YU M,RUAN X W,TAN L Q,et al.Study on impact factors of manganese-dependent peroxidase produced by white rot fungi[J].Chemistry & Bioengineering,2014,31(11):40-44.

[10] 国巍.木质素降解真菌菌丝球自固定化细胞体系的建立[D].哈尔滨：哈尔滨理工大学,2017.

GUO W.Construction of mycelial pellet by self-immobilized cell-free system for lignin degradation[D].Harbin:Harbin University of Science and Technology,2017.

[11] 丁洪雪,张志才,施德富,等.米曲霉固态发酵产锰过氧化物酶的条件优化[J].饲料研究,2015(16):57-61.

[12] WANG M X,ZHANG Q L,YAO S J.A novel biosorbent formed of marine-derived Penicillium janthinellum mycelial pellets for removing dyes from dye-containing wastewater[J].Chemical Engineering Journal,2015,259:837-844.

[13] LIU Y X,HU T T,ZHAO J,et al.Simultaneous removal of carbon and nitrogen by mycelial pellets of a heterotrophic nitrifying fungus-Penicillium sp.L1[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2016,123(2):223-229.

[14] LU T,ZHANG Q L,YAO S J.Efficient decolorization of dye-containing wastewater using mycelial pellets formed of marine-derived Aspergillus niger[J].Chinese Journal of Chemical Engineering,2016,25(3):330-337.

[15] 邹炎,蒲生彦,薛圣炀,等.土壤霉菌菌丝球制备及其吸附Pb(Ⅱ)性能[J].工业水处理,2017,37(3):30-33.

ZOU Y,PU S Y,XUE S Y,et al.Preparation of mycelial pellet from soil mould and its biosorption capacity for Pb (Ⅱ) [J].Industrial Water Treatment,2017,37(3):30-33.