灰霉病是一种世界性分布的植物病害，其病原为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，主要为害幼果以及成熟的果实、花序、叶片、果柄等，常导致花序、果实大量脱落，已成为严重影响我国大田和温室作物产量和品质的重大病害。目前，灰霉病的防治仍以化学防治为主，但由于灰葡萄孢具有遗传变异大、繁殖速度快、适应性强以及具有多次再侵染等特点，使其对多种不同作用机制的杀菌剂产生了抗药性，导致杀菌剂的使用量逐年增大，并对农产品的安全性造成了严重威胁。因此，挖掘植物抗灰霉病基因，深入研究其抗病分子机制，为培育抗灰霉病的作物新品种具有重要意义。近年来，从拟南芥中克隆得到的抗病基因以及抗性相关基因一直是人们研究的热点。目前，大部分植物抗病基因及抗性相关基因是从拟南芥中获得的，如RPS2[1-2]、RPS5、RPS6[3]、RPM1[1，4-5]、RPP4[6-7]、RPP7[8]、RPW8[9-12]等，其中部分抗病基因已经应用到生产上。研究显示，植物产生抵抗死体病原菌灰葡萄孢的侵染时，水杨酸(SA)信号途径发挥了重要作用，SA的积累可以增加植物对灰葡萄孢的局部抗性[13]。通过高通量转录组分析，已经鉴别了大量植物抵抗灰葡萄孢侵染起作用的转录因子TFs(Transcription factors)[14-17]。拟南芥T1N6_22基因编码的蛋白为NAD(P)结合Rossmann-折叠蛋白家族的成员，具有葡萄糖脱氢酶活性和短链氧化还原酶活性，参与植物体内各种催化反应和新陈代谢过程，已经确定其通过参与SA和茉莉酸(JA)信号途径调控拟南芥对灰葡萄孢的抗性[18]。河北农业大学真菌毒素与植物分子病理学实验室前期获得了一株对灰葡萄孢敏感的拟南芥突变体，确定了其突变基因为T1N6_22；通过互补回复试验，明确了T1N6_22基因在拟南芥抗灰霉病过程中起正调控作用，在拟南芥抗丁香假单胞杆菌(Pst DC3000)过程中起负调控作用；利用酵母双杂交技术，以T1N6_22蛋白为诱饵筛选拟南芥的酵母cDNA文库，获得了T1N6_22蛋白的候选互作蛋白[19]。但是，T1N6_22蛋白的互作蛋白及其调控拟南芥抗病的分子机制尚未明确。

1.3.6 标准曲线的制备 精密吸取橙皮苷对照品溶液（浓度为 150 μg／mL）2、5、8、10、12、15 μL 注入液相色谱仪，以峰面积和进样量（μg）分别为纵坐标和横坐标，绘制标准曲线并计算回归方程。

本研究利用酵母双杂交技术，对拟南芥抗病相关基因T1N6_22的互作蛋白进行鉴定，旨在为进一步明确T1N6_22基因调控拟南芥抗病的分子机制奠定基础。

通过城市开发边界与生态红线的“两线合一”，实现通州规划建设北京城市副中心新型城镇化示范区、国际一流和谐宜居之都示范区以及京津冀区域协同发展示范区的带动作用[3]。将通州与北三县衔接，加强跨界地区的统一管控和规划，共同开展生态红线和城市开发边界划定工作，并与京津冀协同发展示范区相结合，带动区域的协调发展。解决通州建设的历史问题，在实施单元上实现管控“两张皮”到管控一体的突破，并在全区层面协调乡镇的发展问题，落实发展和生态方面的重点项目。

1 材料和方法

1.1 供试材料

酵母双杂交载体PGADT7(AD)和PGBKT7(BD)、酵母菌株AH109、拟南芥Columbia生态型(Col-0)均由河北省植物生理与分子病理学重点实验室、河北农业大学真菌毒素与植物分子病理学实验室提供；酵母转化试剂和酵母培养基购于美国Clontech公司；pCR8克隆试剂盒(K2520-20)和LR克隆试剂盒(11791020)购于美国Invitrogen公司。

1.2 T1N6_22基因及其候选互作蛋白基因的扩增

提取拟南芥Columbia生态型(Col-0)植株的总RNA，总RNA提取方法参照提取试剂盒OMEGA Plant RNA Kit的说明书。以提取的总RNA为模板，反转录合成cDNA，cDNA的合成方法参照宝生物反转录试剂盒的说明书。以cDNA为模板，使用T1N6_22基因和AT1G06050、AT1G21400、AT2G19480基因的特异引物进行PCR扩增(表1)。PCR反应体系为MgSO4 2 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)1 μL、引物各1 μL、模板cDNA 2 μL、Taq酶0.2 μL，最后加ddH2O至50 μL。PCR程序为94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

 

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

  

基因名称Genename引物序列(5′-3′)PrimersequenceT1N6＿22ATGGCAGACCCAAGAGTTGCAGTTCAAAAGTTGGAGACATTGGCGCAT1G06050ATGGCTGGCTCTGTTGGTGTTACTGCTTCTGTACATGTTCATCCAT1G21400ATGGCGATCTGGTTTGCTAGTCAAACATGAAAGCCAGGAGAT2G19480ATGAGCAACGACAAGGACAGCTCACTGCTGCTTACATTCCGG

1.3 T1N6_22基因及其候选互作蛋白基因的克隆

将T1N6_22基因及其候选互作蛋白基因的PCR扩增产物进行回收，胶回收方法参照全式金胶回收试剂盒的说明书。将回收的基因扩增产物分别与Gateway克隆载体pCR8进行连接。连接体系为1 μL回收的PCR产物、盐溶液0.5 μL、ddH2O 1 μL、pCR8 Topo载体0.5 μL，室温23 ℃反应5 min。连接后转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆进行PCR鉴定和测序验证。

1.4 T1N6_22基因及其候选互作蛋白基因的酵母双杂交载体构建

利用质粒提取试剂盒，提取经测序正确的pCR8-T1N6_22、pCR8-AT1G06050、pCR8-AT1G21400和pCR8-AT2G19480质粒；利用LR重组试剂盒，将4个基因的入门载体分别与酵母双杂交载体PGADT7(AD)和PGBKT7(BD)进行重组反应，反应体系为质粒pCR8-T1N6_22(或者pCR8-AT1G06050、pCR8-AT1G21400、pCR8-AT2G19480)3 μL、AD/BD载体1 μL、LR克隆酶Ⅱ 1 μL，25 ℃连接2 h。2 h后在连接体系中加入蛋白酶K 1 μL，37 ℃ 10 min。将所得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆进行PCR检测，将PCR检测正确的克隆进行进一步的测序鉴定。

1.5 T1N6_22基因及其候选互作蛋白基因的自激活活性检测

将1 μg AD质粒分别与1 μg BD-T1N6_22、BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480组合共同转化酵母感受态细胞AH109，室温孵育1～2 h，42 ℃热激30 min后，冰浴1～2 min。将酵母细胞涂布于二缺(-Leu/-Trp)培养基上，30 ℃培养2～3 d。挑取二缺培养基上生长良好的酵母单克隆，用100 μL无菌水稀释，吸取10 μL点于三缺-Leu/-Trp/-His和添加3-AT的-Leu/-Trp/-His培养基上，30 ℃继续培养2～3 d，观察酵母生长情况。

1.6 酵母双杂交

张留庄水文站资料显示，1958年没有发生较大洪峰，但从7月16日开始来水明显高于历年同期平均值，直到1959年7月才恢复正常。由于张留庄站上游12 km处即是伍姓湖，因此可以确定7.16特大洪水在进入伍姓湖后蓄积，之后用一年的时间缓慢排出。

2 结果与分析

2.1 T1N6_22基因及其候选互作蛋白基因的酵母双杂交载体构建

酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system)是分析蛋白与蛋白之间相互作用的有效、快速的方法，可以精确地测定蛋白质之间微弱的相互作用，由于其操作水平是在核酸水平，不需要纯化大量的蛋白，因此，操作简单容易。但是，酵母双杂交技术存在一些自身缺陷，很明显的一个缺陷就是存在假阳性。因此，酵母双杂交验证的蛋白质相互作用往往还需要其他的试验证据进一步支持。本研究中，利用酵母双杂交技术确定了T1N6_22蛋白与AT1G06050、AT1G21400和AT2G19480存在互作关系。基于酵母双杂交系统自身的局限性，后续试验中可以采用其他技术对其互作关系进行进一步的验证。

  

A.T1N6_22的PCR扩增；B.pCR8-T1N6_22的PCR扩增；C.AD-T1N6_22的PCR扩增；D.BD-T1N6_22的PCR扩增。A.PCR amplification of T1N6_22；B.PCR amplification of pCR8-T1N6_22；C.PCR amplification of AD-T1N6_22；D.PCR amplification of BD-T1N6_22.

 

图1 T1N6_22基因酵母双杂交载体的构建Fig.1 Construction of the T1N6_22 gene yeast two-hybrid vector

  

A.AT1G06050的PCR扩增；B.pCR8-AT1G06050的PCR扩增；C.AD-AT1G06050的PCR扩增；D.BD-AT1G06050的PCR扩增。A.PCR amplification of AT1G06050；B.PCR amplification of pCR8-AT1G06050；C. PCR amplification of the AD-AT1G06050；D. PCR amplification of BD-AT1G06050.

 

图2 AT1G06050基因酵母双杂交载体的构建Fig.2 Construction of the AT1G06050 gene yeast two-hybrid vector

  

A.AT1G21400的PCR扩增；B.pCR8-AT1G21400的PCR扩增；C.AD-AT1G21400的PCR扩增；D.BD-AT1G21400的PCR扩增。A.PCR amplification of AT1G21400；B.PCR amplification of pCR8-AT1G21400；C.PCR amplification of AD-AT1G21400；D.PCR amplification of BD-AT1G21400.

 

图3 AT1G21400基因酵母双杂交载体的构建Fig.3 Construction of the AT1G21400 gene yeast two-hybrid vector

  

A.AT2G19480的PCR扩增；B.pCR8-AT2G19480的PCR扩增；C.AD-AT2G19480的PCR扩增；D.BD-AT2G19480的PCR扩增。A.PCR amplification of AT2G19480；B. PCR amplification of pCR8-AT2G19480；C. PCR amplification of AD-AT2G19480；D. PCR amplification of BD-AT2G19480.

 

图4 AT2G19480基因酵母双杂交载体的构建Fig.4 Construction of AT2G19480 gene yeast two-hybrid vector

2.2 T1N6_22基因及其候选互作蛋白基因的自激活活性检测

将AD空载体分别与BD-T1N6_22、BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480质粒组合共转化酵母感受态细胞，检测各基因的自激活活性。结果发现，共同转化AD与BD-T1N6_22、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480载体的酵母菌落均不能在三缺培养基-Leu/-Trp/-His和-Leu/-Trp/-His 3-AT上生长，共同转化BD-AT1G06050和AD载体的酵母菌落能在三缺(-Leu/-Trp/-His)培养基上正常生长，添加3-AT的三缺培养基-Leu/-Trp/-His 3-AT能够抑制其生长(图5)。表明T1N6_22、AT1G21400、AT2G19480基因无自激活活性，AT1G06050基因有自激活活性。

  

图 5 T1N6_22及其可能互作蛋白自激活活性的鉴定Fig.5 Self-activating activity of T1N6_22 and its candidate interacting protein

2.3 T1N6_22互作蛋白的酵母双杂交鉴定

[12] Kim H，O′connell R，Maekawa-Yoshikawa M A，et al. The powdery mildew resistance protein RPW8.2 is carried on VAMP721/722 vesicles to the extrahaustorial membrane of haustorial complexes[J]. Plant Journal，2014，79(5)：835-847.

利用同样的方法，检测T1N6_22与AT1G21400、AT2G19480之间在酵母中的互作关系，结果发现，共转化AD-T1N6_22+BD-AT1G21400、BD-T1N6_22+AD-AT1G21400、AD-T1N6_22+BD-AT2G19480、BD-T1N6_22+AD-AT2G19480组合的酵母菌落在三缺培养基(-Leu/-Trp/-His和-Leu/-Trp/-His 3-AT)和四缺培养基(-Leu/-Trp/-His/-Ade)上均能生长，而阴性对照组合除BD+AD-AT1G21400和AD+BD在三缺培养基(-Leu/-Trp/-His)上有微弱生长外，其余阴性对照组合均不能在三缺和四缺培养基上正常生长(图7-8)。表明T1N6_22与AT1G21400、AT2G19480能在酵母细胞中直接互作。

根据本次固镇GZ01-C孔、五河WH01-B孔钻探取芯岩性剖面，结合区域地层工程地质特征，划分出其岩性土及砂性土压缩层，两孔压缩层特征与北部区域及沿淮两地区是一致的，其中沿淮地带五河WH01-B孔缺失A4-A6压缩层。

  

图 6 T1N6_22 和AT1G06050酵母双杂交Fig.6 Results of T1N6_22 and AT1G06050 yeast two-hybrid

  

图7 T1N6_22 和AT1G21400酵母双杂交Fig.7 Results of T1N6_22 and AT1G21400 yeast two-hybrid

  

图8 T1N6_22 和AT2G19480酵母双杂交Fig.8 Results of T1N6_22 and AT2G19480 yeast two-hybrid

3 讨论

利用T1N6_22基因的特异性引物扩增得到T1N6_22基因的全长(888 bp)(图1-A)，将其与入门载体pCR8连接后转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR扩增检测发现获得了单一的目的条带(图1-B)，进一步对其进行测序验证，获得T1N6_22基因入门载体pCR8-T1N6_22。将pCR8-T1N6_22与酵母双杂交载体AD、BD进行重组反应，反应产物转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR鉴定获得了单一的目的条带(图1-C、D)，进一步对重组载体进行测序鉴定，最终获得T1N6_22基因酵母双杂交载体AD-T1N6_22和BD-T1N6_22。利用同样的方法，分别获得AT1G06050、AT1G21400和AT2G19480基因的酵母双杂交载体AD-AT1G06050、BD-AT1G06050、AD-AT1G2140、BD-AT1G2140、AD-AT2G19480、BD-AT2G19480(图2-4)。

除了酵母双杂交之外，还有多种检测蛋白互作的方法。如双分子荧光互补技术(BiFC)和免疫共沉淀技术(Co-IP)。其中，BiFC技术是一个在活细胞中检测蛋白互作的非常好的工具[20-23]；Co-IP技术是一种在细胞非变性条件下研究蛋白之间直接互作的方法，可以在体内直接确定它们之间相互作用方式的动态变化[24]。

学生是学习的主人，尤其是在新时期学生在学习中占据着主导地位，学生要充分认识到这一点，在学习中积极主动的参与到教学之中，利用教学便利，以及教学中出现的新理念和新方法，积极转变学习态度，掌握新的学习方法，养成良好的学习习惯，在英语阅读教学中，勇敢的将短文读出来，不断提高自身“读”能力，实现个人的全面发展。

参考文献：

3）出现085故障时，检查EBV控制节点上黄灯。如果稳定或者闪烁，重装程序或者更换EBV；如果断电恢复后红灯仍亮，更换EBV。

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采用美国麦克公司Au-toPoreⅣ9510型全自动压汞仪，将实验样品在110℃条件下真空脱气2h后进行压汞实验，汞的表面张力为485.0mN/m，汞与煤样的接触角为140°，仪器的压力范围为0.1～60000Pa，测量的孔径范围为3.0nm～1000μm。

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通常情况下，谷物原料如玉米需经过粉碎加工后用于配制饲料，主要是可以增加饲料与消化液的接触面积[8]，提高饲料的利用率，从而提高动物的生产性能。本试验在蛋鸡产蛋期极显著改善了产蛋率,平均蛋重,平均采食量，料蛋比和不合格蛋率。饲料营养均衡，有效促进蛋鸡消化与提高生产性能。

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化学是以实验为主的学科，如果没有实验学生仅仅从教材中获得书面上的知识，学生是不能很好地理解所学知识的，只能在抽象中感知化学知识，无法直观地感受到化学知识的形成，但是做化学实验又有很多的限制条件，比如仪器设备、场地等.但是，如果引进了微课进行做实验，就可以不受这些条件的限制，可把事先录制好的有关实验的微课播放给学生观看，学生在看的过程中就会直观形象地了解化学知识的形成过程，就容易理解和掌握化学知识，进而提高化学学习的效率.

[14] Ferrari S，Galletti R，Denoux C，et al. Resistance to Botrytis cinerea induced in Arabidopsis by elicitors is idependent of salicylic acid，ethylene，or jasmonate signaling but requires PHYTOALEXIN DEFICIENT3[J]. Plant Physiology，2007，144(1)：367-379.

将AD-T1N6_22与BD-AT1G06050、BD-T1N6_22与AD-AT1G06050组合进行酵母双杂交试验，同时设AD-T1N6_22+BD、AD+BD-AT1G06050、BD-T1N6_22+AD、BD+AD-AT1G06050、AD+BD组合作为阴性对照。结果发现，共转化AD-T1N6_22与BD-AT1G06050、BD-T1N6_22与AD-AT1G06050组合的酵母菌落在三缺培养基(-Leu/-Trp/-His和-Leu/-Trp/-His 3-AT)和四缺培养基(-Leu/-Trp/-His/-Ade)均能生长，共转化阴性对照AD与BD-AT1G06050组合的酵母菌落在三缺培养基(-Leu/-Trp/-His)上能够生长，而共转化其他阴性对照组合的酵母菌落在三缺培养基(-Leu/-Trp/-His和-Leu/-Trp/-His 3-AT)和四缺培养基(-Leu/-Trp/-His/-Ade)上均不能生长(图6)。表明T1N6_22与AT1G06050能在酵母细胞中直接互作。

[13] Si-ammour A，Mauch-Mani B，Mauch F.Quantification of induced resistance against Phytophthora species expressing GFP as a vital marker：β-aminobutyric acid but not BTH protectspotato and Arabidopsis from infection[J]. Molecular Plant Pathology，2003，4(4)：237-248.

将1 μg AD-T1N6_22质粒分别与1 μg BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480质粒组合，将1 μg BD-T1N6_22质粒分别与1 μg AD-AT1G06050、AD-AT1G21400和AD-AT2G19480质粒组合，同时设对照组合AD-T1N6_22+BD、BD-AT1G06050+AD、BD-AT1G21400+AD、BD-AT2G19480+AD、BD-T1N6_22+AD、AD-AT1G06050+BD、AD-AT1G21400+BD和AD-AT2G19480+BD。将不同组合分别转化酵母感受态细胞(200 μL)，涂布二缺(-Leu/-Trp)培养基上，30 ℃培养2～3 d。挑取二缺培养基上生长良好的酵母单克隆，用100 μL无菌水稀释，分别吸取10 μL点于二缺-Leu/-Trp、三缺-Leu/-Trp/-His、添加3-AT的三缺-Leu/-Trp/-His 3-AT和四缺-Leu/-Trp/-His/-Ade培养基上，30 ℃继续培养2～3 d，观察酵母生长情况。

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本研究利用酵母双杂交技术确定了T1N6_22蛋白的互作蛋白AT1G06050、AT1G21400和AT2G19480，下一步工作可以对AT1G06050、AT1G21400和AT2G19480的功能进行深入研究，明确其在拟南芥抗病中的功能及其与SA和JA信号途径之间的关系，深入探讨T1N6_22基因及其互作蛋白基因调控拟南芥抗病的分子机制奠定基础。

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接下来是张兴良。张兴良在法院工作，或许受工作性质影响，讲段子时仍然满脸严肃：京九铁路通车那会，沿线农民路边观看，车上一缺德女来例假，换纸后将其扔出车窗外，纸迎面贴一老农脸上，老农拿下后惊道：乖乖，是快！飘张纸都能把俺鼻子砸出血来！

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由于中小企业制定管理制度采取模仿方式，甚至于有些企业直接套用相关企业或同行业企业的管理制度，这使得管理制度在形式上是标准的，但在具体内容上并没有更多地结合自己的实际情况去进行调整。其次，中小企业由于规模小，往往采取集中制的组织形式，决策权集中化，领导权利至高无上，这导致在制定管理制度的时候集权性质比较明显，采用自上而下的制定方式，一方面制度内容有可能不全面和缺乏科学论证行；另一方面，容易让员工产生不理解或不满的情绪，影响组织成员的自尊心和工作热情。