干旱、高盐、低温、高温等极端条件，是植物生长过程中所面临的主要逆境胁迫因子。在逆境条件下，与植物抗逆相关基因被诱导表达，从而产生胁迫响应。植物响应非生物胁迫的基因可分为两类：①功能基因，如编码与胁迫有关的LEA蛋白、抗冻蛋白、渗透调节因子合成酶以及逆境胁迫产生的ROS等清除系统的相关酶基因[1]；②编码与抗逆相关参与信号传递蛋白激酶和调控基因表达的转录因子，如MYB、bZIP、WRKY、AP2/EREBP和NAC等[2]。WRKY转录因子是植物中发现最早的一类转录调控因子，根据WRKY结构域的数目和锌指纹结构的类型，WRKY蛋白可分成3组[3]：第Ⅰ组含2个WRKY结构域，锌指纹结构模式为C-X4-5-C-X22-23H-X-H，如SPF1、ABF1、PcWRKY1和AtWRKY33[4-7]等；第Ⅱ和Ⅲ组均含1个WRKY 结构域，第Ⅱ组锌指纹结构模式与第Ⅰ组相同，如AtWRKY18(NP_567882)等；第Ⅲ组仅在组成锌指纹的氨基酸有变化，为C-X7-C-X22-23-H-X-C，如AtWRKY70(NP_191199)等。

Ishiguro 和Nakamura[4]在甘薯中发现了第一个WRKY转录因子SPF1。随后，其他研究者又相继在水稻、拟南芥、棉花、烟草、大麦、小麦和豆类[8-14] 等植物中克隆得到WRKY转录基因。WRKY转录因子不仅参与植物抗病与非生物胁迫的响应，而且在植物生长发育、次生代谢等过程中起重要作用[15-20]。拟南芥AtWRKY22和AtWRKY29是MAPK通路中重要的下游组成成分[21]，对拟南芥抵抗真菌和细菌等抗性具有调节作用。李立芹 [22]研究发现，烟草WRKY12基因受4 ℃低温胁迫诱导表达。在拟南芥中过表达AtWRKY25和AtWRKY33 基因，能够显著增强转基因植株对高温和高盐的耐受性[23-25]；过表达OsWRKY47能提高水稻的抗旱性[26]。拟南芥AtWRKY28基因受ABA、高盐、机械损伤和低磷胁迫诱导表达[27-28]。大豆基因组中大约有300个WRKY基因(http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php?sp=Gma)，但目前仅有少数第Ⅱ组成员的功能被鉴定，如GmWRKY111[29]、GmWRKY13、GmWRKY21和GmWRKY54[15] 参与盐、干旱和冷害等多种非生物逆境胁迫的应答反应，它们过量表达，能增强植物对盐、干旱和冷害的适应性。

大豆(Glycine max)是我国最重要的油料作物之一，干旱、盐害、低温和低磷等非生物胁迫严重影响大豆的产量和品质。已有研究表明，大豆很多WRKY参与非生物胁迫的转录调控，然而关于WRKY Group Ⅲ成员参与非生物胁迫响应及功能分析的研究较少。Yang等[30]研究发现，大豆WRKY家族第Ⅲ组的GmWRKY58和GmWRKY76在大豆发育过程中具有重要作用。过量表达GmWRKY58和GmWRKY76基因的拟南芥比野生植株开花早，这种提早开花的表型与几个促进开花基因的表达增加有关；病毒诱导大豆GmWRKY58和GmWRKY76基因沉默导致植物叶片扩展减少和茎生长停止等不良现象，但GmWRKY58在响应非生物逆境胁迫的表达模式还未见报道。本研究采用荧光定量方法，分析不同非生物逆境胁迫下GmWRKY58基因的表达水平，明确其响应的非生物逆境胁迫因子，为进一步探究GmWRKY58基因在非生物胁迫应答中的功能奠定基础。

本研究小组常使用的药物为:2%利多卡因5ml+曲安奈德20mg+生理盐水至40ml。静脉点滴常用:奥扎格雷80mg+银杏达莫40ml。因颈源性头痛患者常常合并脑供血不足、焦虑抑郁症,应同时给予治疗。

1 材料和方法

1.1 试验材料及处理

本研究所用大豆材料为科丰1号，由江苏省农业科学院豆类作物研究室提供。采用改良的Zhang等[31]的方法于2015年6月大豆长到两叶一心时，取整齐度一致的幼苗放置在1/2 Hoagland营养液中生长2 d，换至正常营养液中生长，营养液pH调至6.0。2 d以后将大豆幼苗分别于含200 mmol/L NaCl 和2% PEG8000的Hoagland 营养液中进行高盐、干旱胁迫处理，分别在0，6，12，24，48 h取根、茎、叶样；于4 ℃培养箱进行低温处理，用2 mmol/L水杨酸(SA)喷施，分别取0，6，9，12，24，48 h叶片样；低N(75.8 mmol/L)、低P(5 μmol/L)、低K(96.5 mmol/L)和缺Fe(0 mmol/L)处理0，6，12，24，48 h取根、叶样，对照组分别采用正常营养液。

挑选籽粒饱满、大小一致的科丰1号种子种植于土壤中，待真叶自然展开后，于2015年5月19日取根、茎、叶，2015年6月19日取花，2015年7月3日取幼荚，2015年8月8日取幼嫩种子。每处理3 次重复。将样品迅速置于液氮中，-80 ℃保存备用。

1.2 大豆总RNA 提取与cDNA合成

采用RNA提取试剂盒(RNA plant plus Reagent，TIANGEN)提取大豆不同组织、不同处理时间点样品的总RNA，按照反转录试剂盒(M-MLV reverse transcriptase，TaKaRa)操作说明书合成cDNA第一链[32]。

1.3 基因克隆

从Phytozome(http：//www.phytozome.net/)网站下载大豆GmWRKY58 核酸序列，采用Premier 5 设计特异引物，上游引物为GmWRKY58 F：5′-ATGA

GTATTCTCTTCCCAAGAAG-3′，下游引物为GmWRKY58 R：5′-CTAAAGCAATTGGCTTTCATC-3′。

以大豆cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环；最后72 ℃再延伸10 min。25 μL的PCR反应体系中包括10×Taq缓冲液3.0 μL，Taq聚合酶0.5 μL，2.5 μL的dNTPs (2.5 mmol/L)，MgCl2 (25 mmol/L) 2.0 μL，cDNA模板2.0 μL，上下游引物各1 μL (10 pmol/L)，最后用ddH2O补至25 μL。PCR 产物电泳后，切胶纯化回收。回收片段与pGEM-T easy载体连接，连接产物进行热激转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。经鉴定后的阳性克隆送Invitrogen公司测序。

1.4 生物信息学分析

使用在线软件Compute pI/Mwtool、ExPASy (http：//expasy.org/tools/pi_tool.html)预测蛋白的分子量和等电点；通过SignalP (http：//cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析GmWRKY58蛋白质的信号肽；由DNAMAN软件完成多序列比对；以MEGA 6 软件构建进化树；选取GmWRKY58 基因ATG上游1.5 kb的碱基序列，在 PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)网站预测顺式作用元件。http：//www.genscript.com/wolf-psort.html进行亚细胞定位分析。二级结构预测使用http：//www.biogem.org/tool/chou-fasman/完成。

1.5 实时荧光定量(qRT-PCR)分析

以单链cDNA序列设计实时荧光定量PCR引物：F：5′-CATGCATGGAGAAAGTACGG-3′；5′-GTTG

CACTTGTTTGGTTGCT-3′。以大豆组成型表达 β-Tubuin 基因(GenBank 登录号为AK286413)为内参基因(F：5′-GGAGTTCACAGAGGCAGAG-3′；R：5′-C

[24] Li S J，Fu Q T，Chen L G，et al. Arabidopsis thaliana WRKY25，WRKY26，and WRKY33 coordinate induction of plant thermotolerance[J]. Planta，2011，233(6)：1237-1252.

周武燕等[20]报道，游离龈的L值最大；附着龈的L值最小，b值也相对偏小；龈乳头的a值和 b值均最大。由于游离龈包绕于牙颈部且较薄，牙体的反光可能会导致其L值增大；而附着龈因缺乏黏膜下层，且其下方含有丰富的胶原纤维并直接粘附在骨膜上，加之其周围血管较少，因此其L值最小。王少海等[21]认为，与边缘龈相比，附着龈的L值、 a值和b值均较大。而许丽娟[12]的研究则表明，与边缘龈相比，附着龈的a值和b值均更大，但两者的L值无显著差异(P>0.05)。

1.6 亚细胞定位

通过不同物种WRKY氨基酸序列同源性分析和 Blast 比对，结果表明GmWRKY58与大豆WRKY70之间序列一致性最高，其次为绿豆、鹰嘴豆、巨桉、毛果杨、胡杨、苹果、麻风树、可可，说明GmWRKY58在相同物种中保守性比在不同物种间保守性高；GmWRKY58基因在物种间进化过程中经受不同选择压力的选择。

获得的重组质粒35S∷GmWRKY58∷GFP转入TOP10克隆菌株。参照文献[34]，在3.0 mL LB液体培养基(含50 mg/L Kam，17 mg/L Rif )中培养含双元载体的农杆菌，28 ℃，200 r/min 过夜培养，室温下3 000 r/min离心10 min后收集菌体，加1.0 mL注射培养基悬浮菌体，室温3 000 r/min离心10 min后弃上清，重复一次，最后用注射培养基悬浮。测600 nm吸光值(OD)，当农杆菌菌液浓度(OD600)为0.1～0.2时，用无针头的注射器将农杆菌菌液注射到3～4周龄的本氏烟叶片。然后在温室中培养(27 ℃光照16 h，22 ℃黑暗8 h) 24～72 h，在激光扫描电镜下观察荧光蛋白的发光情况。

2 结果与分析

2.1 GmWRKY58 克隆及序列分析

从Phytozome(http：//www.phytozome.net/)网站下载大豆GmWRKY58 核酸序列，根据CDS序列设计引物，以科丰1号大豆叶片cDNA为模板进行PCR，扩增出单一的条带。将测序得到的结果与大豆基因组数据库(http：//www.phytozome.net/)进行序列比对，结果显示与大豆Williams 82.a2.v1的Glyma.04G223300(NP_001237638)基因序列完全一致 (图1)。目的片段大小为954个核苷酸，具有一个完整的开放阅读框。序列分析发现，氨基酸序列N端具有WRKYGQK的保守结构域，C端具有C-X7-C-X22-23-H-X-C保守结构域(图1)，系WRKY家族基因GroupⅢ成员。

  

方框为WRKY结构域和锌指蛋白结构域。Boxes stands for the WRKY domain and zinc finger protein domain，respectively.

 

图1 GmWRKY58 蛋白保守结构域 Fig.1 Conservation domains of GmWRKY58

2.2 氨基酸序列及理化性质分析

GmWRKY58基因编码一个含有317个氨基酸，分子量为35.855 6 ku蛋白质，等电点为5.46。GmWRKY58为稳定在组织中的表达特性蛋白，无信号肽。GmWRKY58编码蛋白的整条肽链都位于细胞核。二级结构预测结果表明，在GmWRKY58蛋白中，螺旋结构占60.60%，肽链占59.0%，无规则卷曲占17.7%。

[27] 钟贵买，伍林涛，王健美，等. 转录因子AtWRKY28亚细胞定位及在非生物胁迫下的表达分析[J]. 中国农业科技导报，2012，14(5)：57-63.

 

Pe.胡杨；Pt.毛果杨；Jc.麻疯树；Tc.可可；Gr.雷蒙德氏棉；Vv.葡萄；Eg.巨桉；Ca.鹰嘴豆；Vr.绿豆；Gm.大豆；Md.苹果；Nn.莲；Fv.野草莓亚种；Mn.桑树；Cm.甜瓜；Nt.烟草；Si.芝麻。

PeWRKY70.Populus euphratica，XP_011014496；PtWRKY70.Populus trichocarpa，XP_002319879；JcWRKY70.Jatropha curcas，XP_012091128；TcWRKY70.Theobroma cacao，XP_007011367；GrWRKY70.Gossypium raimondii，XP_012460911；VvWRKY70.Vitis vinifera，XP_002275401；EgWRKY70.Eucalyptus grandis，XP_010067621；CaWRKY70.Cicer arietinum，XP_004502820；VrWRKY70. Vigna radiata var.，XP_014500012；GmWRKY70.Glycine max，XP_003526799；MdWRKY70.Malus domestica，XP_008369379；NnWRKY70.Nelumbo nucifera，XP_010252044；FvWRKY70.Fragaria vesca subsp.，XP_004305079；MnWRKY70.Morus notabilis，XP_010093537；CmWRKY70.Cucumis melo，XP_008442314；NtWRKY70.Nicotiana tomentosiformis，XP_009586653；SiWRKY70.Sesamum indicum，XP_011085118.

图2 大豆GmWRKY58与其他植物WRKY蛋白的系统演化分析 Fig.2 Phylogenetic analysis of the deduced amino acid sequence between GmWRKY58 and other WRKY proteins

2.3 组织表达特性

GmWRKY58基因在根、茎、叶和花等器官中均有表达，在不同器官基因表达水平从高到低的顺序依次为：叶、根、茎、花、荚，在营养器官根、茎、叶中的表达量显著高于花和荚生殖器官中的表达量(图3)。其中，叶片中的表达量为根的2.16倍；在根和茎中的表达量相差不大，花和荚中的表达量较低。这可能是由于植物根茎叶在感知逆境信号和激素信号中起重要作用。

2.4 GmWRKY58 在非生物胁迫下的表达特性

用高盐、干旱、低温、SA、低N、低P、低K和缺Fe处理大豆幼苗，以qRT-PCR分析其表达动态(图4-6)。

结果表明，高盐胁迫能强烈诱导GmWRKY58表达，200 mmol/L的NaCl处理下(图4-A)，GmWRKY58基因在根和茎中的表达呈先升高后下降的变化趋势，根和茎中上调表达至最高值分别出现在12，24 h，为相对表达量为0 h时的187.4，13.1倍；

  

不同小写字母表示在新复极差法分析中0.05水平上存在显著性差异。图4-6同。Bars superscripted by different lowercase letters are significantlydifferent at the 0.05 probability level.The same as Fig.4-6.

 

图3 大豆GmWRKY58基因的组织表达 Fig.3 Expression analysis of GmWRKY58 gene in different tissues in soybean

叶中表达呈下降趋势，在叶中的表达量则始终低于对照。2% PEG8000干旱处理后，在根、茎和叶中的诱导表达模式不尽相同，根中GmWRKY58表达量高于茎和叶。根和茎中最高表达量均出现在处理后48 h，分别是0 h时的15.1，18.4倍，表现为先升后降再升的趋势和上升趋势；叶中总体表现为先升后降的趋势，最高表达量出现在处理后12 h，是0 h时的10.0倍(图4-B)。低温(4 ℃)和水杨酸(SA)处理(图5)没有明显的上调或下调表达趋势，上调表达至最高值分别出现在处理后12 h 和24 h，相对表达量为0 h时的2.7，1.7倍。

低N、低P、低K和缺Fe处理后，GmWRKY58诱导表达模式存在差异。低N和缺Fe处理后，GmWRKY58基因在根中相对表达量高于叶片，最高表达量分别出现在处理后24，6 h，是0 h时的4.9，3.4倍(图6-A、D)。低P和低K处理后，GmWRKY58在叶中的相对表达量高于根，最高表达量均出现在叶中0 h，表现为先降后升的趋势(图6-B、C)。

  

图4 盐胁迫(A)和干旱(B)处理条件下GmWRKY58基因的表达Fig.4 Expression of GmWRKY58 under salt stress (A) and drought (B) treatments

  

图5 低温4 ℃(A)和SA(B)诱导大豆叶片GmWRKY58表达 Fig.5 Expression of GmWRKY58 in leaf of soybean induced by cold (4 ℃，A) and SA (B) treatments

2.5 GmWRKY58 蛋白的亚细胞定位

通过PSORTII(http://www.genscript.com/wolf-psort.html) 网站对GmWRKY58蛋白进行亚细胞定位预测，结果定位于细胞核中。为了从试验上进一步证明其亚细胞定位，将瞬时表达载体35S∷GmWRKY58∷GFP转化到本氏烟叶片，温室培养24～72 h后，通过共聚焦激光扫描显微镜观察绿色荧光蛋白的信号。结果显示(图7)，转pCambia1302-GFP 载体的绿色荧光分布在整个细胞膜、细胞核和细胞质中，转35S∷GmWRKY58∷GFP载体的绿色荧光分布在细胞核中，说明GmWRKY58定位在细胞核中，这与GmWRKY58基因序列上含有一个核定位信号(NLS)区域的特征相符，也与生物信息学预测结果相同，说明GmWRKY58是转录因子，定位在细胞核内调控下游相关基因的表达。

  

图6 低N(A)、低P(B)、低K(C)和缺Fe(D)诱导GmWRKY58表达 Fig.6 Expression of GmWRKY58 in soybean induce by low nitrogen (A)，low phosphorus (B)，low potassium (C) and iron deficiency (D) treatments

  

A、D.紫外激发的荧光信号；B、E.可见光的信号；C、 F. A和B叠加，D和E叠加。 A，D.UV-excited fluorescence signals；B，E.Signals under bright field；C，F.Merged image of A and B,D and E.

 

图7 GmWRKY58蛋白和GFP蛋白在本氏烟叶片细胞中的定位 Fig.7 Subcellular localization of GmWRKY58 protein and GFP in leaves of Nicotiana benthamiana

2.6 GmWRKY58的启动子分析

上述表达分析结果表明，转录因子GmWRKY58在非生物胁迫下存在一定功能，猜测其启动子序列上可能含有响应非生物胁迫的应答元件。在PlantCARE网站上预测GmWRKY58启动子的顺式作用元件，结果表明(表1)，GmWRKY58基因的启动子序列中含有多个响应逆境和植物激素的顺式作用元件，例如：ACE类似序列、MBS核心序列、HSE核心序列、富含TC的重复序列、TGA盒和TATA盒等。这些调控元件暗示GmWRKY58在植物响应抗逆方面可能具有重要作用。

 

表1 GmWRKY58启动子上的顺式作用元件预测 Tab.1 The cis-acting elements in the promoter sequence of GmWRKY58

  

调控元件Regulatoryelements序列Sequence调控元件可能的作用Theeffectofregulatoryelements数量QuantityACEACGTGGA参与光响应1AE⁃boxTGGTTT对厌氧诱导至关重要1Box4ATTAAT参与光响应6CAAT⁃boxCAAT在启动子和增强子区18CGTCA⁃motifCGTCA参与甲基茉莉酸响应5G⁃boxCACGTC参与光响应1GAG⁃motifAGAGATG光响应元件的一部分1GARE⁃motifAAACAGA赤霉素反应元件2GT1⁃motifGGTTAAT光反应元件1HSEAGAAAATTCG参与热激反应5MBSCAACTG参与干旱诱导的MYB结合位点2Skn⁃1＿motifCC(G/A)CCC光反应元件2TATA⁃boxTTTTA转录起始上游30bp的TATA盒119TC⁃richrepeatsATTTTCTCCA参与防御和逆境响应1TGA⁃boxTGACGTAA生长素响应元件的一部分1TGACG⁃motifTGACG参与甲基茉莉酸响应5

3 讨论与结论

转录因子调控类基因可以较快响应逆境胁迫[35]。本研究结果显示，大豆GmWRKY58基因受高盐、干旱、低N和缺Fe等多种逆境胁迫后在其根部强烈诱导表达，但表达模式不同，说明GmWRKY58基因在不同胁迫环境下可能具有不同的响应机制。根部组织对这几种胁迫更敏感，这可能与其最早受水分胁迫或渗透胁迫导致较快脱水有关。大豆GmWRKY75和GmWRKY6基因在低P、低N、低K和缺Fe胁迫下表达趋势基本一致，都呈先微弱下调再明显上调，但不同处理达到最高表达量的时间点不同[36]，与本研究中GmWRKY58基因的表达模式存在着很大差异，这可能是由于它们基因结构和氨基酸序列的差异导致WRKY转录因子具有多种基因功能。

3.确定各级指标权重并进行一致性检验。使用EXCEL或MATLAB等软件对判断矩阵进行归一化处理，计算出各级指标的权重。同时为避免由于教学质量评价要素的复杂性以及考评人员认识的多样性、主观性等造成的问题，需对判断矩阵一致性进行检验，避免出现偏差。

本研究中，GmWRKY58基因在大豆的根、茎、叶、花和荚中均有表达，根、茎、叶中的表达量显著高于花和荚，这与前人的研究结果一致[30]，说明GmWRKY58对于大豆的营养与生殖器官发育都有一定的作用，但其发挥作用的大小、调控方式可能存在不同。

以GmWRKY58基因的ORF正确的克隆提取质粒，经Nco Ⅰ和Spe Ⅰ双酶切，同时pCambia1302质粒用Nco Ⅰ和Spe Ⅰ双酶切，分别回收小片段和大片段，将二者用T4-DNA连接酶进行连接，从而得到35S∷GmWRKY58∷GFP融合表达载体，转入DH5α大肠杆菌。用菌落PCR、酶切方法筛选阳性克隆，并测序验证。

蛋白质在细胞中的定位决定了其行使功能的部位。生物信息学预测GmWRKY58定位在细胞核中，本试验结果证实了这一预测，该结果与已报道的WRKY转录因子的亚细胞定位结果一致[30]，同时也与GmWRKY58作为转录因子参与调控基因的表达相吻合。

[6] Rushton P J，Torres J T，Parniske M，et al. Interaction of elicitor-induced DNA-binding proteins with elicitor response elements in the promoters of parsley PR1 genes[J]. The EMBO Journal，1996，15(20)：5690-5700.

大豆GmWRKY58基因开放阅读框长度为954 bp，编码317个氨基酸。GmWRKY58转录因子定位于细胞核中。GmWRKY58基因在根、茎、叶、花和荚等组织均有表达，种子中不表达，根茎叶中的表达量显著高于花和荚。该基因明显受高盐、干旱、低N和缺Fe胁迫诱导表达，说明GmWRKY58在大豆的抗盐、抗旱、低N和缺Fe等非生物胁迫响应中起到重要的作用。

参考文献：

5．中国在研究时间上整体较日本滞后，研究成果较少，层次不是很高，尤其系统性、整体性研究较日本相差很多。

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在实际通信过程中，由于网络限制流量、数据传输间隔短等因素，会出现数据拥堵现象，即模块发送的数据不能及时传送到远程终端，而是堆积在网络上，从而引起接收端数据延时或者接收不到数据。本文采用软件编程的方法(如图4所示)成功地解决了该问题，如数据传输流程图所示，在发送数据前应根据调试经验设置合适的定时时间(本测试确定为3s),发送完数据后，立即进入接收中断同时开启定时器，如果在定时时间内接收到正确的反馈信息，则发送下一组数据;否则，定时时间到后，则关闭当前连接，重新请求连网。经测试，该方法能够解决数据拥堵问题，且重新连网的时间达到3～4s(如图5所示)，有3次连网出现，且数据是连续的。

WRKY通过结合启动子上保守的W box 顺式元件来调节目标基因的表达[37]。通过分析GmWRKY58基因上游1 500 bp的启动子片段，发现其含有多个与干旱、光响应、热激等逆境胁迫和生长素、赤霉素、茉莉酸等激素相关的诱导元件。GmWRKY58的启动子区域含有2个干旱应答的顺式元件MBS，推测该基因在大豆响应抗旱胁迫，调节干旱的抗性方面具有一定的功能，本试验也证实了这一点，如PEG处理下，大豆根中的GmWRKY58在短时间内即受到强烈的诱导，表达量提高近20倍。同时，在启动子区域还含有1个参与防御和逆境响应的顺式元件TC-rich repeats，当外界环境存在如高盐、低N和缺Fe时，通过这个诱导元件，与逆境相关转录因子可以激活GmWRKY58基因和蛋白质的表达，GmWRKY58转录因子又可以调控下游与逆境胁迫相关的功能基因表达，从而降低不良环境对植物造成的伤害。

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类别Ⅳ：此类别共包含12个省市，分别是浙江、江苏、广东、海南、天津、黑龙江、辽宁、山东、山西、甘肃、西藏、重庆。该类别的特点是第一产业占比较低，75%的省市第一产业占比不到10%，而绝大部分省市第三产业占比高于50%。12个省市中有8个位于东部沿海地区，进出口贸易繁荣，地理位置优越，对人才的吸引力较强，为第三产业的发展贡献了劳动资源。其中，甘肃、西藏、重庆三省均位于丝绸之路经济带；山西省占据万里茶道国际商路的核心位置，是承接东西，连接南北的重要地理位置，这四个省份近年来文化旅游业发展迅速，为第三产业的发展提供了强大的动力。

[10] Zhou L, Wang N N, Gong S Y, et al.Overexpression of a cotton(Gossypium hirsutum)WRKY gene, GhWRKY34, in Arabidopsis enhances salt-tolerance of the transgenic plants [J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2015, 96:311-320.

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1.2.4 评价标准 生长发育评价根据2006 年WHO推荐的Z 评分进行评价：年龄别体质量(WAZ)<-2为低体质量；年龄别身长(HAZ)<-2 为生长迟缓。按照世界卫生组织和联合国儿童基金会推荐的标准，6～59个月龄儿童贫血的诊断标准为Hb<110 g/L。

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卢一平实施的第一步,是说服郝桂芹。说服郝桂芹的困难,在上次包“9”后,郝桂芹已经说过,她心脏不好,再也不买了。

[16] Suttipanta N，Pattanaik S，Kulshrestha M A，et al. The transcription factor CrWRKY1 positively regulates the terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus[J]. Plant Physiology，2011，157(4)：2081-2093.

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ACTTACGCATCACATAGCA-3′)。采用ABI PRISM7500实时荧光定量系统进行基因表达分析。反应体系为：模板cDNA 1.0 μL(10 ng/μL)，2×SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)10.0 μL，Rox Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA 1.0 μL，Primer F 0.8 μL、Primer R 0.8 μL，补ddH2O至20.0 μL。反应程序为：95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，40个循环。采用2-ΔΔCT[33]法分析数据，计算GmWRKY58基因相对表达量。每个取样点设3次生物学重复，qRT-PCR为3次技术重复。

综上所述，饮食护理应用于精神分裂症并2型糖尿病患者中，可更好对患者的血糖水平控制，且可提高其对护理服务的满意程度，以此提高精神分裂症并2型糖尿病患者的生活质量，改善其预后。

[25] Li S J，Fu Q T，Huang W D，et al. Functional analysis of an Arabidopsis transcription factor WRKY25 in heat stress[J]. Plant Cell Reports，2009，28(4)：683-693.

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为了研究GmWRKY58的进化情况，笔者构建了GmWRKY58的系统进化树(图2)。结果显示：GmWRKY58与大豆WRKY70(XP_003526799)序列一致性最高，为91%；其次为绿豆WRKY70(XP_014500012)、鹰嘴豆WRKY70(XP_004502820)、巨桉WRKY70 (XP_010067621)、毛果杨WRKY70 (XP_002319879)、胡杨WRKY70 (XP_011014496)、苹果WRKY70 (XP_008369379)、麻风树WRKY70 (XP_012091128)和可可WRKY70 (XP_007011367)，序列一致性为43%～74%；而与野草莓亚种WRKY70(XP_004305079)、桑树WRKY70(XP_010093537)、甜瓜WRKY70(XP_008442314)、烟草WRKY70(XP_009586653)和芝麻WRKY70(XP_011085118)的一致性较低。

[28] 张飞萃. 拟南芥WRKY28和WRKY42调控磷吸收和转运的机制研究[D]. 北京：中国农业大学，2015

[9] Guan Y, Meng X, Khanna R, et al. Phosphorylation of a WRKY transcription factor by MAPKs is required for pollen development and function in Arabidopsis [J]. PLoS Genetics, 2014, 10(5):e1004384.

对于轨道列车的发展趋势，梁建英透露，中车集团正在研制时速600 km的高速磁浮列车。它是个什么概念？时速350 km是高铁的商业运营速度，时速800 km是大型民航飞机的巡航速度。中车集团研制的时速600 km高速磁浮列车就是为了填补这两者之间的速度空白。该项工程的样车预计在2020年下线。还有智能高铁、车-车通信技术、快速货运动车组、新材料车辆(如2018年9月在柏林国际轨道交通技术展上中车青岛四方机车车辆股份有限公司正式发布的新一代碳纤维地铁车辆)、上下层单轨立体交通等都在研究开发中。创新没有止境，我们的奋斗也没有止境。

[30] Yang Y，Chi Y J，Wang Z，et al. Functional analysis of structurally related soybean GmWRKY58 and GmWRKY76 in plant growth and development[J]. Journal of Experimental Botany，2016，67(15)：4727-4742.

学生分组实验，教师巡回并组织交流：先小组尝试拼装5分钟，暂停一下，请一些小组来谈体会，然后再小组继续拼装。（在分享时，学生又出现了争论）

[31] Zhang G，Chen M，Li L，et al. Overexpression of the soybean GmERF3 gene，an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt，drought，and diseases in transgenic tobacco[J]. Journal of Experimental Botany，2009，60(13)：3781-3796.

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充分保障农民土地处分权是保护农民土地产权的重要途径之一。中国农民的土地产权问题在法律规定上含糊不清，需要进一步详细阐述农民土地处置权和农民土地产权的具体规定。政府可以通过不断完善信访制度，充分了解农民的意愿，充分把农民的意愿落实在政策的每一个方面；并通过对农村干部的政治修养和规范管理水平的不断提高，加强干部们的党性建设水平，坚持走群众路线，进一步保障农民的土地财产权。

[34] Sparkes I A，Runions J，Kearns A，et al. Rapid，transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants[J]. Nature Protocols，2006，1(4)：2019-2025.

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5.乡镇居民基本养老保险和基本医疗保险的缴费。针对税务部门收缩乡镇征收机构，对乡镇居民基本养老保险和基本医疗保险的征缴带来一定程度影响的现实情况，可考虑平移现有的征缴措施，如继续委托村委会或街道办进行缴费审核和确认，继续委托原来的商业银行代扣缴社会保险费。商业银行扣款成功后将扣款明细数据返回社会保险经办机构记账，同时将各险种的扣款总额向税务部门申报入库。

[36] 徐 影. 大豆耐低磷相关转录因子GmWRKY75和GmWRKY6的克隆及功能分析[D]. 南京：南京农业大学，2014.

[37] Brand L H，Kirchler T，Hummel S，et al. DPI-ELISA：a fast and versatile method to specify the binding of plant transcription factors to DNA in vitro[J]. Plant Methods，2010，6(1)：25.