羊肚菌，又叫羊肚菜、羊肚蘑等，营养丰富，风味独特，肉质脆嫩，味道鲜美，必需氨基酸和维生素含量特别丰富，还具有抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、抗诱变的作用[1～3]。因此，羊肚菌在医药、食品、保健品、化妆品等领域具有广阔的应用前景。

自治区人民政府副秘书长周光华、自治区住房城乡建设厅厅长周家斌，以及各市、县（市、区）人民政府分管领导，各市住房城乡建设部门主要负责人，广西乡村风貌提升三年行动厅际联席会议成员单位主要负责人200多人参加会议。

羊肚菌属于子囊菌界(Aacomycota)，盘菌门(Pezizomycotina)，盘菌纲(Pezizomycetes)，盘菌目(Pezizales)，羊肚菌科(Morchellaceae)，羊肚菌属(Morchella)[4]。按形态学分类，羊肚菌分为黄色羊肚菌类群(Yellow Morel Group)、黑色羊肚菌类群(Black Morel Group)、半开羊肚菌类群(Half-free Morel Group)和变红羊肚菌类群(Red-brown Morel Group)4个类群。依据分子系统发育学进行分类，羊肚菌可分为黑色羊肚菌支系(Elata Clade)、黄色羊肚菌支系(Esculenta Clade)和变红羊肚菌支系(Rufobrunnea Clade)等3个支系[4,7]。冀东山区野生羊肚菌资源丰富，但目前还没有相关研究报道。笔者采用形态学和分子生物学相结合的方法对采集于秦皇岛地区的2种野生羊肚菌和2种羊肚菌栽培菌种分类鉴定，以便确定4种羊肚菌的种类，为选育适于冀东地区干燥、多风和低温气候栽培的羊肚菌品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集信息

采集于秦皇岛山区的2株野生羊肚菌CTZ和SZZ以及2株羊肚菌栽培品种FN和ZSZ信息见表1。采用GPS定位法获取羊肚菌分布地区的准确地理坐标并拍摄照片。调查区域植物类型、地貌类型、海拔等生境情况，逐项填记在调查表中。

 

表1 野生羊肚菌样品采集地信息

  

样品编号采集地经度纬度海拔/mCTZ青龙县陈台子村119°19′40.08"40°23′40.2"627SZZ青龙县苏杖子村119°02′14.28"40°25′6.24"256

1.2 形态学观察

参照《中国大型真菌原色图鉴》[5]，观察子实体菌盖和菌柄的颜色、着生方式和大小等形态特征。

野生羊肚菌CTZ子囊果中等(图2c，图2d)。菌盖卵形或圆锥形，高5.0～6.5 cm，粗3.5～4.5 cm，表面具似羊肚状的近圆形或不规则形的凹窝，大而浅，淡黄色；菌柄长4.5～6.0 cm，粗2.0～3.5 cm，白色至淡黄色，表面被覆白色颗粒，内部空心，基部膨大成球形并带有皱褶。

1.3 ITS序列分析

高职项目式教学要打破传统的专业(学科)教学模式，按照高等职业教育的本质要求，从职业岗位的实际出发，依据工作的典型任务，选择和安排学习项目，使得课程的学习内容与工作任务一致、学习过程与工作过程一致[6]。

栽培羊肚菌ZSZ子囊果中型偏大(图2e，图2f)。菌盖圆锥形至宽圆锥形，偶见卵圆形，高3.5～9.0 cm，宽3.0～5.5 cm；表面具纵向棱纹及横脉连结，呈梯子状，幼嫩时深灰色，随着成熟逐渐变为深灰棕色至近乎黑色；菌柄长3.0～8.5 cm，宽1.0～2.5 cm，白色至浅棕色，中空，基部有不规则沟槽。

野生羊肚菌SZZ多为单生，子实体生长在山林阴坡水沟旁的湿润壤土上，地上植被为杨树等阔叶树木以及草本植物，土壤中腐殖质含量丰富，表面覆盖有阔叶树枯叶，表层以下5 cm左右有杨树根系、枯叶和腐木(图1a,图1b,图1c)。

2 结果与分析

2.1 野生羊肚菌的生境调查

1.3.3 系统发育树构建 利用羊肚菌专用数据库(Morchella MLST)进行序列比对，并下载相关序列，将序列编辑后采用MEGA7.0中Maximum-parsimony法构建系统发育树，经bootstrap法进行1 500次循环检验系统发育树的可靠性。

野生羊肚菌SZZ子囊果偏小(图2a，图2b)。菌盖高2.5～4.0 cm，宽2.0～3.5 cm，椭圆形至近圆锥形；菌盖初为灰黑色，成熟后为淡黄色或灰黄色，表面覆有形似海绵状的深而不规则的凹坑，凹坑内的颜色较深；菌柄长2.0～3.0 cm，粗1.0～2.0 cm，白色至淡黄色，内部空心，基部膨大，且有不规则沟壑。

  

图1 野生羊肚菌的生境a,b,c：野生羊肚菌SZZ的生境；d,e,f：野生羊肚菌CTZ的生境

2.2 形态学观察

将采集到的羊肚菌样品，参照《中国大型真菌原色图鉴》，按照子实体颜色、形状、大小和脉棱等特征进行形态学分类、鉴定，初步确认野生羊肚菌属于黄色羊肚菌类群，羊肚菌栽培品种属于黑色羊肚菌类群，其主要生物学特性如下：

野生羊肚菌CTZ多为簇生，子实体生长在山林阳坡水沟旁的湿润壤土上，周围有杨树枯树桩，地上植被为杨树等阔叶树木以及草本植物，土壤中腐殖质含量丰富，表面覆盖有大量杨树枯叶，表层以下5 cm左右有杨树根系、枯叶和腐木(图1d,图1e,图1f)。

随着城市化和工业化进程的加快，农村大量年轻劳动力涌向城镇，常住居民中老年人口数量相对较多，人口老龄化现象严重。尤其是丘陵山区村庄，常住人口以老年人为主，亟待建设养老设施［8］。此外，村级日间照料中心设置较少，没有形成一定的规模。

另外，青海探索将缴存住房公积金事宜纳入劳动合同、聘用合同文本正式条款，为自主缴存人员依法缴存住房公积金提供有力保障。同时，建立健全不缴、欠缴住房公积金“黑名单”制度，将未按规定建立住房公积金制度或拖欠缴纳住房公积金的单位予以曝光，并纳入人民银行征信系统和政府信用信息平台，对失信主体实施联合惩戒。

1.3.1 DNA提取 取子实体加液氮使用ThmorganCK1000D组织研磨机进行研磨，使用天根生物试剂盒提取DNA。通过20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 ITS序列扩增及测序 序列扩增引物为ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)。PCR采用25 μL体系：10×PCR buffer 2.5 μL，模板DNA 1.5 μL，ITS1 1.0 μL，ITS4 1.0 μL，dNTP mixtures 0.5 μL，Taq酶 0.2 μL/2.5 U，ddH2O补齐至25 μL。反应程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，34个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

栽培羊肚菌FN子囊果中型偏大(图2g，图2h)。菌盖圆锥形至宽圆锥形，深灰棕色至近乎黑色，高4.0～10.0 cm，宽3.0～5.5 cm；表面具纵向棱纹，大多较短，并有次生脊和下沉的横脊；菌柄长3.5～9.5 cm，宽2.0～4.0 cm，白色至浅棕色，中空，基部有不规则沟槽。

All animal procedures were conducted in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals,and the animal protocol was approved by the Animal Care and Use Committee at the Institute of Nanjing University of Chinese Medicine.

  

图2 羊肚菌子实体 a,b：野生羊肚菌SZZ的菌盖和菌柄；c,d：野生羊肚菌CTZ的菌盖和菌柄 e,f：栽培羊肚菌ZSZ的菌盖和菌柄；g,h：栽培羊肚菌FN的菌盖和菌柄

2.3 ITS序列分析

利用ITS序列在Morchella MLST数据库进行比对，野生羊肚菌SZZ(Genbank ID：MG431336)与Morchella spongiola(GenBank ID：JQ691480)相似度为99.61%，野生羊肚菌CTZ(Genbank ID：MG431335)与Morchella crassipes(GenBank ID：JQ691496)的相似度为98.55%，栽培羊肚菌ZSZ(Genbank ID：MG431337)与Morchella conica(GenBank ID：AJ544194)的相似度为99.59%，栽培羊肚菌FN与Morchella sextelata(GenBank ID：KM587991)的相似度为99.85%。同时，利用相似度高的可靠羊肚菌ITS序列及物种信息，采用MP法构建系统发育树(图3)。整个系统发育树可分为黑色羊肚菌支系(Elata Clade)、黄色羊肚菌支系(Esculenta Clade)和变红羊肚菌支系(Rufobrunnea Clade)等3个支系；野生羊肚菌SZZ与黄色羊肚菌支系中Morchella spongiola归为一类，结合形态学观察可以确定野生羊肚菌SZZ为小海绵羊肚菌(M. Spongiola)；野生羊肚菌CTZ与黄色羊肚菌支系中Morchella crassipes归为一类，结合形态学观察可以确定野生羊肚菌CTZ为粗柄羊肚菌(M. Crassipes)；栽培羊肚菌ZSZ与黑色羊肚菌支系中Morchella conica归为一类，结合形态学观察可以确定栽培羊肚菌ZSZ为尖顶羊肚菌(M. Conica)；栽培羊肚菌FN与黑色羊肚菌支系中Morchella sextelata归为一类，结合形态学观察可以确定栽培羊肚菌FN为六妹羊肚菌(M. sextelata)。

  

图3 采用MP法构建的基于ITS序列的羊肚菌系统发育树

3 讨 论

本次研究利用形态学和分子生物学相结合的方法对采集于冀东地区2株野生羊肚菌以及2株羊肚菌栽培品种进行了分类鉴定。其中，野生羊肚菌SZZ和CTZ分别为黄色羊肚菌支系中的小海绵羊肚菌和粗柄羊肚菌，羊肚菌栽培品种ZSZ和FN分别为黑色羊肚菌支系中的尖顶羊肚菌和六妹羊肚菌，小海绵羊肚菌为河北省新纪录种。这不仅为野生羊肚菌资源的开发及利用奠定了基础，也为选育适于冀东地区干燥、多风和低温气候及砂质含量较高土壤栽培的羊肚菌品种提供了技术支撑。

羊肚菌传统的形态学分类方法主要是依据子实体宏观和微观的形态特征，暴增海等[8]和王仲勇等[9]分别于1996年和2009年对燕山山脉的野生羊肚菌进行了形态鉴定，发现该地区存在尖顶羊肚菌、羊肚菌、褐赭色羊肚菌和粗腿羊肚菌。然而，由于子实体在不同的生态环境和不同的生长阶段都存在形态差异，这样会产生同物异名、异物同名的现象[10]。真菌的分子鉴定和系统发育分析广泛采用基于核糖体DNA转录间隔区ITS序列和Genbank数据库的序列分析技术。然而，GenBank中约66%的羊肚菌ITS序列都被给予了错误的物种名称，从而会影响ITS序列分析的鉴定结果[9]。为更准确地对羊肚菌进行分类鉴定，我国科研机构联合荷兰皇家艺术与科学研究院真菌培养中心(CBS-KNAW)构建了一个羊肚菌多基因序列模标数据库Morchella MLST[12]。由于该数据库准确度高，越来越多的科研人员进行了基于Morchella MLST数据库的羊肚菌分类鉴定[6,13,14]。本次研究利用ITS序列在Morchella MLST数据库进行比对，获得可靠的羊肚菌ITS序列及物种信息，选取相似度靠前的序列构建系统发育树，从而得到形态学与分子生物学相一致的分类结果。然而，也有研究结果表明，单一的ITS序列仅能识别出羊肚菌属中约76%的系统发育学物种，而利用ITS+ef1a+rpb1+rpb2多基因联合分析的分子生物学与形态学相结合的分类鉴定方法正在进行中[11]。

参考文献：

[1] 张广伦,肖正春.羊肚菌的营养成分及其利用[J].食用菌,1993(3):3-4.

[2] 孙晓明,张卫明,吴素玲，等.羊肚菌免疫调节作用研究[J].中国野生植物资源,2001,20(2):12-13.

[3] 葛士顺,张海信,李涛,等.羊肚菌的生物学功能及其在运动科学领域的应用展望[J].赤峰学院学报(自然科学版), 2011, 27(7):142-143.

[4] O'Donnell K,Cigelnik E,Weber N S,et al.Phylogenetic relationships among Ascomycetous truffles and the true and false morels inferred from 18S and 28S Ribosomal DNA sequence analysis[J].Mycologia,1997,89(1):48-65.

[5] 黄年来.中国大型真菌原色图鉴[M].北京：中国农业出版社,1998,17-18.

[6] 熊川,李小林,李强,等.一株采自四川南充的羊肚菌生境调查与鉴定[J].福建农林大学学报(自然科学版),2015,44(4):414-418.

[7] Kuo M，Dewsbury D R，O'Donnell K，et al.Taxonomic revision of true morels(Morchella) in Canada and the United States[J]. Mycologia,2012,104(5):1 159-1 177.

[8] 暴增海,马桂珍.张北高原尖顶羊肚菌的生境调查初报[J].中国食用菌,1996,15(2):31.

[9] 王仲勇,李彦美.河北省燕山区羊肚菌资源调查及开发利用[J].安徽农业科学,2009,37(25):11 948-11 949，11 951.

[10] Mortimer P E,Karunarathna S C,Li Q H,et al.Prized edible Asian mushrooms: ecology, conservation and sustainability[J].Fungal Diversity,2012,56:31-47.

[11] Du X H,Zhao Q,Yang Z L,et al.How well do ITS rDNA sequences differentiate species of true morels(Morchella)?[J].Mycologia,2012,104(6):1 351-1 368.

[12] 杜习慧,赵琪,杨祝良.羊肚菌的多样性、演化历史及栽培研究进展[J].菌物学报,2014,33(2):183-197．

[13] 熊川,李小林,李强,等.四川秋季发生的两种羊肚菌生境调查与鉴定[J].菌物学报,2016,35(1):29-38.

[14] 何培新,刘伟,蔡英丽,等.我国人工栽培和野生黑色羊肚菌的菌种鉴定及系统发育分析[J].郑州轻工业学院学报(自然科学版), 2015,30(3/4):26-29.