忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的花蕾入药，具有清热解毒、凉风散热、抗病毒、保肝利胆的作用［1，2］。 茎藤入药，具有清热解毒、通络的作用。忍冬的花及其茎、叶等器官富含挥发油、有机酸、黄酮、三萜、多糖等多种活性成分［3，4］。 忍冬器官中的绿原酸、咖啡酸、多糖、木犀草苷等成分具有抗菌、抗病毒、免疫调节、抗肿瘤、抗辐射、延缓衰老及抗感染等多种作用［5］。忍冬作为药食同源植物，在医药、食品、动物养殖等领域具有良好的应用前景。本研究采用 Box－Behnken 响应面法进行工艺优化［6］，分析了提取时间、温度、料液比、乙醇体积分数4种变量因素对盐碱地栽培忍冬器官综合物中咖啡酸、绿原酸、木犀草苷和多糖总量的影响，以期获取最优的提取条件。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

材料：忍冬器官综合物，为2017年5月下旬采自连云港市青口金银花种植基地，土壤pH为8.16，含盐量为0.33%，单位器官综合物中花、茎、叶的平均含量分别为 5.4%、41.4%和 53.2%。

试剂：绿原酸、咖啡酸、木犀草苷均由南京泽朗生物科技有限公司提供，2种对照品经HPLC峰面积归一化法检测质量分数均在98%以上；甲醇、乙腈为色谱纯（Merk公司）；去离子水经过Milli－Q系统纯化制备；其余试剂均为分析纯，购自国药集团。

仪器：1290HPLC型高效液相色谱仪（安捷伦公司），配有四元低压梯度泵；AB135－S型十万分之一电子分析天平（Mettler Toledo公司）；UV－1800 型紫外－可见光分光光度计（日本岛津制作所）。

秀容月明眼疾手快，一把搂住她肩头，乔瞧站稳了，脸也红了，望他一眼，把头侧过去。秀容月明也觉不好意思，把搂她的手放开。哪知他刚放开，乔瞧便在水底下把他的手牵住了。

1.2 方法

通过软件绘制出能够反映影响产物总量的4个因素交互作用的三维响应面图，结果见图2。由图2可知，若等高线图呈椭圆形则表明两个因素交互作用显著，若呈圆形则表明交互作用不显著［9－11］。 乙醇体积分数X4和另外3个因素呈椭圆形的等高线图，表明乙醇体积分数的作用显著。

Thermodynamic Analysis of Supercritical Working Fluid Brayton Cycle ZHENG Kaiyun(42)

根据预试验结果，选择显著影响咖啡酸、绿原酸、木犀草苷和多糖总含量的4个因素，即提取时间（X1，min），温度（X2，℃），料液比（X3）和乙醇体积分数（X4，%），以产物咖啡酸、绿原酸、木犀草苷和多糖总含量（Y，%）为响应值，采用 Box－Behnken 响应面法设计试验方案，其他操作条件同“1.2.4”，共设计29组试验。

Box－Behnken响应面设计与结果见表1。利用Design Expert 7.1.3软件对表1中的数据进行二次多元回归拟合并对回归模型进行方差分析，结果见表2。

1.3 Box－Behnken 响应面法

1.2.3 多糖含量测定 采用苯酚－硫酸法测定忍冬提取物中总糖含量［7，8］。 以葡萄糖为标准样品，分别取标准溶液（质量浓度为 0.8 mg／mL）0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 依次加去离子水补至 2 mL， 另取去离子水2 mL作空白试验。每支试管加6%苯酚溶液1 mL，摇匀，然后每支试管中缓慢加入浓硫酸5 mL，摇匀并放入冷水中冷却。在490 nm下比色测定，以葡萄糖质量浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，制作标准曲线， 得到方程为 A＝0.126 3C＋0.008，R2＝0.996 1。

2 结果与分析

2.1 忍冬3种化合物色谱分析

利用软件中的优化模块得到最优组合，即提取时间为 1 h，温度为 75 ℃，料液比 1∶40（g∶mL），乙醇体积分数为45%。相应总产量的模型预测值为13.05%。在最优条件下进行验证试验，操作同“1.2.4”项下，测得提取物中咖啡酸、绿原酸、木犀草苷和多糖总含量为 12.98%（RSD＝2.06%，n＝3），其中咖啡酸含量0.91%、绿原酸含量5.0%、木犀草苷含量0.05%、多糖含量7.02%，表明响应面设计得到的工艺条件是有效、可行的。

  

图1 忍冬3种化合物对照品的色谱图

2.2 响应面试验

1.2.4 工艺流程 采摘的忍冬器官综合物自然干燥后，粉碎过筛，精密称取20 g，超声提取两次，两次提取液合并后离心得到上清液。一份上清液测定咖啡酸、绿原酸和木犀草苷含量；另一份上清液加入无水乙醇使最终醇体积分数达到95%后于常温沉淀2.5 h，沉淀干燥后得到忍冬粗多糖，将上述干燥的粗多糖缓慢用去离子水溶解，并将此多糖溶液通过已活化的D101大孔树脂柱去除小极性杂质，流速8 mL／min，洗脱使用3倍柱体积的去离子水，流速10 mL／min，将此多糖洗脱溶液冷冻干燥后于4℃保存待用。

由表2可以看出，模型方程的F值是16.33，且P＝0.000 1＜0.01，说明模型方程极显著，该试验方法可靠。模型方程失拟项的 P＝0.116 8＞0.05，为不显著，表明未知因素对试验结果干扰很小。试验值与模型方程预测值的校正决定系数为0.961 6，表明该模型能解释96.16%响应值随响应因素的变化，模型拟合程度较好。对方程中各项进行显著性分析，一次项、平方项和交互作用项的P均小于0.05，说明这4个因素以及因素之间的相互作用对响应值的影响都是显著的，其中乙醇体积分数和4个有效成分的总产量的相互作用极显著（P＜0.000 1）。 因此，所得模型方程能够很好地预测产物总量随各响应因素的变化。

1.2.1 溶液的制备 精密称取对照品各 10 mg，单独以甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为1.0 mg／mL的对照品储备液；分别精密量取适量储备液混合置于容量瓶中，以甲醇稀释至刻度，制得系列混合 对 照 品 溶 液 ：1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、100.0、500.0 μg／mL 绿 原 酸 ，0.2、0.5、1.0、5.0、20.0、50.0、100.0 μg／mL 咖 啡 酸 ，0.10、0.25、0.50、1.00、5.00、20.00、50.00 μg／mL 木犀草苷，避光保存。

 

表1 Box-Behnken试验设计与结果

  

编号1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9提取时间（X 1）//m i n 2 0 6 0 4 0 2 0 2 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 2 0 6 0 4 0 6 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 6 0 2 0 6 0 2 0 6 0 4 0 4 0 4 0 4 0温度（X 2）//℃5 5 5 5 7 5 5 5 5 5 3 5 5 5 5 5 3 5 5 5 3 5 5 5 3 5 5 5 7 5 5 5 5 5 5 5 5 5 3 5 7 5 7 5 5 5 5 5 3 5 7 5 7 5 5 5 5 5料液比（X 3）5 0 3 0 5 0 3 0 1 0 3 0 5 0 1 0 3 0 3 0 3 0 5 0 1 0 1 0 1 0 1 0 3 0 3 0 3 0 5 0 3 0 3 0 3 0 3 0 3 0 3 0 3 0 5 0 3 0乙醇体积分数（X 4）//%4 0 0 4 0 0 4 0 0 0 0 8 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 8 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 8 0 8 0 4 0 0 8 0 8 0 4 0多糖总含量（Y）//%7.0 2 3.3 5 1 2.5 0 3.1 6 4.3 6 3.0 8 3.9 6 2.9 0 2.5 8 8.0 2 5.4 6 1 0.2 2 4.2 2 5.9 0 6.1 8 2.1 8 9.0 8 9.0 8 9.0 8 5.1 4 1 2.3 4 9.4 8 4.2 0 4.8 9 6.1 6 4.1 0 6.1 4 6.8 4 8.1 4

 

表2 回归方程的方差分析结果

  

注：相关系数为0.982 3，校正决定数0.961 6；P＜0.01为极显著，P＜0.05为显著

 

变量模型D f 1 4 F P X 1 X 2 X 3 X 4 X 1 X 2 X 1 X 3 X 1 X 4 X 2 X 3 X 2 X 4 X 3 X 4 X 1 2 X 2 2 X 3 2 X 4 2显著性极显著显著显著显著极显著显著显著极显著显著极显著极显著显著显著显著极显著失拟项平方和5 3.8 5 0.6 5 9.5 5 4.3 8 0.3 6 0.2 6 0.1 7 0.0 4 3 1.8 4 0.4 7 0.8 4 0.3 2 0.2 2 1.9 4 2 7.4 7 2.9 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0均方3.8 5 0.6 5 9.5 5 4.3 8 0.3 6 0.2 6 0.1 7 0.0 4 3 1.8 4 0.4 7 0.8 4 0.3 2 0.2 2 1.9 4 2 7.4 7 0.3 0 1 6.3 3 2.7 7 4 0.5 4 1 8.5 8 1.5 3 1.1 2 0.7 4 0.1 8 7.8 2 1.9 9 3.5 9 1.3 5 0.9 3 8.2 2 1 1 6.6 3 3.5 5<0.0 0 0 1 0.0 1 8 4 0.0 3 6 0 0.0 0 0 7<0.0 0 0 1 0.0 2 7 2 0.0 3 5 3 0.0 0 9 6 0.0 1 4 3 0.0 0 3 7 0.0 0 9 1 0.0 4 5 3 0.0 3 2 2 0.0 1 2 4<0.0 0 0 1 0.1 1 6 8

以化合物浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归分析，分别得到绿原酸、咖啡酸和木犀草苷回归方程为 y＝8 604x－27 048（r＝0.999 5）、y＝3 349.5x－18 397（r＝0.999 6）和 y＝57 785x－2 044（r＝0.999 6），表明各化合物在范围内线性关系良好。按照方法学相关要求进行操作，结果表明，专属性中供试品3种待测成分色谱峰的分离度均大于1.5，其他杂质峰及空白对照溶液对待测成分均无干扰，方法专属性良好（图1）。在重复性试验中（n＝6），绿原酸、咖啡酸和木犀草苷峰面积的RSD分别为 2.2%、1.7%和 1.3%，在稳定性试验中（n＝6）3 种化合物峰面积 RSD 均小于 1.4%，在精密度试验中（n＝6），3 种化合物峰面积RSD均小于0.9%，表明重复性、稳定性和精密度均良好；加样回收率为98.2%～103.7%（RSD＝2.4，n＝5），表明准确度较好。

1.2.2 色谱条件及方法学考察 色谱柱为 Zorbox SB－C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为 0.2%甲酸水溶液－乙腈，梯度洗脱：0～6 min，10%乙腈；6～15 min，10%～30%乙腈；15～30 min，30%～60%乙腈；30～40 min，60%～100%乙腈； 体积流量 1.0 mL／min；检测波长327 nm；柱温30℃；进样量10 μL。以忍冬提取物浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归分析。

  

图2 交互作用和三维响应面

3 讨论

应用超声技术同时提取忍冬器官综合物中多种成分，具有提取效率高、节约资源等优势，合适的水醇比是其关键因素。随着乙醇体积分数逐渐升高，产物的总量呈先增加后降低的趋势。绿原酸、咖啡酸和木犀草苷在乙醇中的溶解度强于在纯水中，乙醇体积分数上升使得3种化合物的提取率上升，而金银花多糖溶于水，难溶于有机溶剂，乙醇体积分数太高，则会导致多糖沉淀。经优化应用45%的乙醇提取，绿原酸、咖啡酸、木犀草苷和多糖的综合提取率最佳。在含量检测过程中以甲醇为系统各成分的分离效果并不理想，乙腈的黏度小，洗脱力大，经优化后的乙腈－甲酸水系统各成分的分离效果较好。应用超声提取技术能够在盐碱地栽培的忍冬器官综合物中同时获得一定含量的咖啡酸、绿原酸、木犀草苷、多糖等产物，而以器官综合物为收获目标则更易于实施机械化采收，这将为实现忍冬的工厂化生产及其天然产物的深度开发提供参考。

在船舶的设计和建造过程中，船舶轴系的安装及校中是轮机工程的一个关键项目。轴系安装与校中是一项工作量大、耗时长、技术复杂的系统工程。文章简要介绍了某船轴系的安装工艺过程，重点介绍该船采用直线校中方法时校中数据的测量、计算和分析，并通过系泊试验和航行试验进行验证，结果表明：轴系的运转情况良好，满足规范要求。最后对直线校中方法进行分析，提出改进措施，为提高轴系安装质量提供参考意见。

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