肿瘤是当今世界最主要的致死因素之一[1]，其中骨肉瘤已成为儿童与成人中最常见的原发性骨肿瘤[2-3]，骨肉瘤的治疗手段在过去的几十年里有了重大改进，5年生存率可达到60%～70%，但仍有很多患者一经发现就已经出现肺转移，预后较差[4-6]。microRNAs(miRNAs)是一类长约22个碱基对(base pair，bp)的非编码RNA分子，其通过靶向结合mRNA的3′-端非编码区(3′-UTR)广泛调控器官的发育、组织的分化、细胞的凋亡、肿瘤的发生发展等生命过程[7-9]。研究表明miRNAs在肿瘤的发生、增殖、分化、侵入及转移等过程中发挥着重要的作用[10]。特别是近年来有研究发现约50%的miRNA与肿瘤基因的来源接近。提示miRNA在肿瘤的发生发展中可能起着必不可少的作用。然而，miRNA-32(miR-32)在骨肉瘤中的作用尚未见报道。本研究应用人工合成的miR-32类似物及抑制剂瞬时转染MG-63细胞，观察miR-32在骨肉瘤细胞中的作用并探讨其机制，旨在为将miR-32作为骨肉瘤的治疗靶点提供依据。

1.2.6 病理形态学观察 固定后的肺组织经乙醇及二甲苯透明、石蜡包埋，切成5 μm薄片，HE染色，在光学显微镜下观察，找到完整的中小支气管横断面，观察小气道黏膜上皮、杯状细胞、腺体、纤毛及肺泡壁等结构改变及炎性细胞浸润情况。

1 资 料 与 方 法

1.1 一般资料 收集2013年1月—2016年1月河北省唐山市工人医院进行骨肉瘤手术获取的骨肉瘤组织标本10例为实验组，患者均为首次就诊，未经过化疗。收集同期进行截肢手术的正常骨组织标本10例为对照组。实验组与对照组性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 细胞株、试剂 正常人骨细胞株(hFOB1.19)、人骨肉瘤细胞株(MG-63)、人骨肉瘤细胞株(Saos-2)、人骨肉瘤细胞株(U2OS)均购于中科院上海细胞库(中国，上海)，胎牛血清及DMEM培养基购于Hyclone(美国)，miR-32及其抑制剂购于锐博生物(中国，广州)，RNA提取及分离试剂盒购于Qiagen，cDNA逆转录试剂盒购于Thermo公司，DNA marker、2×Taq MasterMi(含染料)购于北京康为世纪生物科技有限公司，GoldView Ⅰ型核酸染色剂均购于北京Solarbio公司。

1.3 主要仪器 BSC-1100-LⅡA2医用超净工作台(哈东联)，蛋白凝胶电泳仪及转膜仪(Bio-rad)，LightCycler 480 Ⅱ实时定量PCR仪(罗氏)，Biorad GelDoc XR凝胶成像系统(Rio-rad)。

而对我们家人，因为是太熟悉，说话就会很随意，就会不讲究方式方法，这样不知不觉就会伤害对方，对方如果也以其人之道，还治其人之身，就会造成父子成仇人，夫妻反目。所以在家人面前更应该像陌生人那样讲方法，懂尊重，有赞赏。这样我们的家才能真正变成一个温馨的、幸福和甜蜜的港湾，变成一个充满亲情的地方。

1.4 细胞培养 用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养(1%青-链霉素双抗)，放在5% CO2、37 ℃细胞培养箱中常规培养，每2 d换1次液；待其生长达到80%汇合度，细胞处于对数生长期时进行细胞传代及种板。

1.5 蛋白免疫印迹试验(Western blot) 待细胞处理完毕后，在细胞瓶加入1 mL PBS，刮取细胞离心收集沉淀，加入100 μL细胞裂解液冰上孵育15 min后离心取上清，加入Loading Buffer沸水煮5 min，之后进行电泳。

1.7 荧光素酶实验[11] 将MG-63细胞种到12孔板中(每孔约10 000个细胞)，分别转染PTEN的3′-UTR野生型和突变型的载体，培养24 h后收集细胞，用荧光素酶检测试剂盒检测结果。

2.4 miR-32对照组和miR-32类似物组在不同时点miR-32的表达 miR-32对照组和miR-32类似物组均有随着培养时间延长miR-32表达呈逐渐升高的趋势(P<0.05)，但miR-32类似物组增高趋势更快；在各个时点的比较中，培养36 h、48 h 和72 h时miR-32类似物组miR-32表达较miR-32对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

切胶、转膜、抗体孵育及曝光：取出并分离胶板，根据Marker和目的蛋白大小来切割胶的大小，并根据胶的大小裁剪滤纸和聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，先将膜在甲醇中激活，再在转膜缓冲液中湿透，摆放好顺序后进行转膜，电压为25 V，电流为2.5 mA，时间25 min。待转膜结束，用5%牛奶37 ℃封闭1 h，用三乙醇胺缓冲盐水溶液(tris buffered saline，TBS)对一抗按1∶1 000稀释，覆盖PVDF膜，于冰箱4 ℃孵育过夜。次日用TBS洗膜3次，每次8～10 min。接着用TBS按1: 2000稀释二抗，37 ℃避光孵育1～ 2 h。用TBS洗膜3次，每次8～10 min，最后用TBS洗膜5 min。应用Odyssey显色曝光。

2.5 野生型和突变型PTEN中荧光素酶活性在miR-32对照组与miR-32类似物组中的表达 miR-32类似物组野生型PTEN中荧光素酶活性高于miR-32对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而突变型PTEN中荧光素酶活性在miR-32对照组与miR-32类似物组中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

回顾性分析2016年9月至2017年5月间上海长海医院术前行MRI检查、术后经病理证实的14例胰腺导管腺癌患者的DWI资料。其中男性7例，女性7例，年龄44～73岁，平均59岁。肿瘤位于胰头部9例、胰体尾部5例，肿瘤最长径1.0～8.0 cm，平均2.9 cm。

1.6 RNA提取、逆转录及RT-PCR ①总RNA提取分别取对数生长期的细胞，经离心后收集细胞按照试剂盒说明书进行操作，操作过程中使用专用枪头及EP管，所用溶液均为焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocabonate,DEPC)水配置，最后在260/280 nm确定总RNA的质量并进行逆转录。②逆转录按照逆转录试剂盒说明书进行操作。③RT-PCR 分别取逆转录的cDNA为模板，加入引物及SYGR Mix进行反应，其中miR-32以U6为内参，最终结果按照2-△△Ct方法进行分析，见表1。

2.1 正常人和骨肉瘤患者组织中miR-32的表达 骨肉瘤患者组织中miR-32的表达明显高于正常人骨组织中miR-32的表达，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

 

表1 PCR反应引物序列Table 1 Primer sequence for PCR reaction

  

基因名序列退火温度(℃)PTEN上游:5′-CCAGGACCAGA GGAAACCT-3′下游:5′-GCTAGCCTCTGGATTTGA-3′60GAPDH上游:5′-ATGT CGTGGAGTCTACTGGC-3′下游:5′-TGACCTTGCCCACAGCCTTG-3′60miR-32上游:5′-CGGTATTGCACATTACTAAGTTGCA -3′下游:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′58

江苏省苏州市总面积8 488 km2，可划分为平原、水面和丘陵3种类型。其中平原4 660 km2，占全市总面积 的 54.9%； 水 面 3 607 km2，占42.5%；丘陵 221km2，占 2.6%。境内河港交织，水网纵横，湖荡众多，拥有各级河道21 454条，计2万多km，大小湖泊323个。境内主要河道有苏南运河、望虞河、太浦河、张家港、浏河、白茆塘、七浦塘、常浒河、吴淞江等，在蓄水、泄洪、灌溉、排涝、防洪、引水、航运等方面发挥着无可替代的作用。

流体的瞬变过程是指当压力管道中的流体因某些原因而产生流速的急剧变化时，由于流体的惯性作用而引起管道内流体压力急剧变化的现象。当管道中压力降低到水的汽化压力，即管路中出现气、液两相流时，由此而带来的负压和水注弥合压力都会对管路造成危害。如果预料不及或处理不当将会导致管道剧烈震动，泵阀等设备被损坏，严重时整个系统管道断裂破坏。因此，对泵站及其管路进行瞬变过程的分析计算，针对计算结果进行合理分析并采取相应的水锤防护措施以达到安全性的要求就显得尤为重要。

2.3 miR-32调控MG-63细胞增殖情况 选择骨肉瘤细胞株中表达 miR-32最高的细胞株MG-63作为研究对象，分别转染miR-32 抑制物(反义miR-32组)和空白载体(反义对照组)。在反义对照组和反义miR-32组，均有随着培养时间延长miR-32表达呈逐渐升高的趋势(P<0.05)，但反义miR-32组增高的趋势缓慢；培养72 h时反义miR-32组miR-32表达明显低于反义对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

1.9 统计学方法 应用SPSS 18.0统计软件处理数据。计量资料比较分别采用独立样本的t检验、F检验和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3)数据价值密度低。井下各种类型传感器和监测设备实时运行，严密监控生产环境和设备运行状况，不间断监测产生大量的数据与从中所要获取的知识成反比。

2 结 果

PCR反应条件设为：94 ℃预变性10 min，94 ℃变性20 s，退火20 s，72 ℃延伸20 s，40个循环，最后延伸72 ℃ 5 min。

2.2 正常骨细胞与不同骨肉瘤细胞株miR-32表达比较 骨肉瘤3个细胞株MG63、U2OS和Saos-2中miR-32表达均高于正常骨细胞株hFOB1.19的miR-32表达，Saos-2细胞株miR-32的表达低于MG63和U2OS细胞株，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

1.8 细胞增殖实验 选择骨肉瘤细胞株中表达miR-32最高的细胞株MG-63作为研究对象，在96孔板中分别转染miR-32(miR-32类似物)，miR-32抑制物(反义miR-32组)和空白载体(对照组)，分别在转染后24 h、36 h、72 h加入CCK-8后孵育1 h，在450 nm下进行检测。

表1 正常骨组织和骨肉瘤组织中miR-32的表达Table 1 Expression of miR-32 in normal bone tissueand human osteosarcoma

  

组别miR-32表达正常骨组织1.054±0.048骨肉瘤组织2.266±0.099t10.992P0.000

表2 正常骨细胞与不同骨肉瘤细胞株miR-32表达比较Table 2 Comparison of the expression of miR-32 betweennormal bone cells and different osteosarcoma cell lines

  

组别 miR-32表达正常骨细胞(hFOB1.19)1.004±0.077 人骨肉瘤细胞(MG63)1.591±0.063∗ 人骨肉瘤细胞(U2OS)1.575±0.073∗ 人成骨肉瘤细胞(Saos-2)1.378±0.063∗#△ F46.620 P0.000

*P<0.05与hFOB1.19比较 #P<0.05与MG63比较 △P<0.05与U2OS比较(SNK-q检验)

表3 反义对照组和反义miR-32组在不同时点miR-32的表达Table 3 The expression of miR-32 in antisense group and antisense miR-32 group at different time points

  

组别miR-32表达24 h36 h48 h72 hFP反义对照 0.377±0.0420.427±0.0850.653±0.0570.817±0.06727.3850.000反义miR-320.380±0.0750.400±0.0530.530±0.0700.630±0.05010.1350.000t0.0000.5052.2543.826P1.0000.6400.0870.018

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：分离胶和浓缩胶凝固后，将胶板固定于电极模块，放入垂直电泳槽中，倒入1×SDS电泳缓冲液。向加样孔中缓慢加入蛋白样品后电泳，先将电压调为80 V，待溴酚蓝移至浓缩胶和分离胶交界面，将电压调整为120 V，直至溴酚蓝距离板底部1 cm时结束电泳。

表4 miR-32对照组和miR-32类似物组在不同时点miR-32的表达Table 4 Expression of miR-32 at different time points in miR-32 control group and miR-32 analogues group

  

组别 miR-32表达24 h36 h48 h72 hFPmiR-32对照 0.448±0.0640.862±0.0721.390±0.0252.347±0.085461.9600.000miR-32类似物0.570±0.0571.412±0.0922.745±0.0905.120±0.185846.8180.000t 2.4498.35524.83022.821P 0.0710.0010.0000.000

本文介绍了一款采用集总结构的L波段小型高通滤波器。通过对馈电端口空间磁场效应的利用，使得在阻带处多了一个传输零点。文章具体描述了滤波器的设计原理、ADS仿真与实现和HFSS三维实现，最终给出了仿真与测试结果，两者一致性较好，满足了设计指标。与其它L波段高通滤波器相比，该款滤波器具有尺寸小，性能优良且易于加工的优势，在通信微波领域有着广泛的应用。

表5 野生型和突变型在miR-32类似物组与miR-32对照组中的表达Table 5 Expression of wild-type and mutant inmiR-32 analogues and miR-32 control groups

  

组别野生型PTEN荧光素酶活性组别突变型PTEN荧光素酶活性miR-32对照 0.387±0.112miR-32对照 0.970±0.551miR-32类似物1.083±0.277miR-32类似物1.063±0.245t4.035t0.267P0.010P0.803

2.6 miR-32对照组与miR-32类似物组以及反义对照组与反义miR-32组PTEN表达比较 miR-32类似物组PTEN表达水平低于miR-32对照组，反义miR-32组PTEN表达水平高于反义对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表6。

表6 miR-32对照组与miR-32类似物组以及反义对照组与反义miR-32组PTEN表达Table 6 Expression of PTEN in MiR-32 control andmiR-32 analogues, and in antisense controland antisense miR-32 groups

  

组别PTEN表达组别PTEN表达miR-32对照31.033±0.235反义对照 1.087±0.219miR-32类似物0.473±0.163反义miR-321.567±0.151t4.603t3.125P0.010P0.035

2.7 PTEN 是miR-32的靶基因 通过生物信息学软件预测得到miR-32与 PTEN 为miR-32的靶基因，本研究通过双荧光素酶实验证实了miR-32通过PI3K/Akt信号通路PTEN 3′-UTR的结合位点结合， miR-32种子序列与PTEN 3′-UTR碱基序列互补配对(图1)；通过Western Blot检测了PI3K/Akt信号通路相关标志蛋白的表达情况，显示抑制miR-32的表达之后，PTEN蛋白的表达量升高，同时pAkt的表达水平下降，但是总Akt的表达量却没有变化，PI3K的表达量基本没有变化，但磷酸化的PI3K的量却降低了；过表达miR-32时，上述蛋白表达情况正好相反(图2)。

 

图1 miR-32与PTEN结合位点

Figure 1 Binding sites of miR-32 and PTEN

 

图2 Western blot检测PTEN、pAkt的表达情况

1.反义对照组；2.反义miR-32组；3.miR-32对照组；4.miR-32类似物组

Figure 2 The expression of PTEN and pAkt detected by Western blot

3 讨 论

骨肉瘤是最常见的骨恶性肿瘤之一，它从间质细胞系发展而来[12]，肿瘤迅速由软骨组织形成肿瘤骨(样)组织，病因不明，可能由于下肢负重骨受到外界条件的影响而引起细胞突变进而发生肿瘤，骨肉瘤的典型特点为源于骨内的肿块，另有源于骨外膜和结缔组织的类型，此类型不多见，且预后较好。学者们对骨肉瘤的研究从未间断，相关研究已经从骨肉瘤细胞发生和转移[12-13]、细胞周期[14]、增殖[15]、凋亡[14-17]、骨肉瘤细胞集落形成[16]等方面进行了实验探讨，对骨肉瘤的病理机制的认识越来越深入。本研究主要从转录后水平探讨骨肉瘤病理机制。

miRNA与细胞的增殖、分化、凋亡以及体内各种生理活动有关[7]，miRNAs可能有助于癌症的发展和进展，使它们成为癌症预防和治疗的潜在靶点[18-19]，尤其是在恶性肿瘤的复发、转移及侵入等方面起着重要作用[20]。miR-224能够促进结直肠癌转移，对患者预后意义重大[21]。冀宏等[22]发现miR-221高表达与甲状腺癌的恶化过程关系密切，可为甲状腺癌术前诊断和个体化治疗提供新的思路。miRNA-21在转移的肿瘤组织中较在同一个体的原发肿瘤组织中有miR-32的高表达，已经发现在多种肿瘤细胞中miR-32的表达上调，如肾癌和前列腺癌[23-24]。有研究发现miR-32通过靶向B细胞转位基因BTG2能够减少肿瘤细胞的凋亡[25]。Gocek等[26]发现阻断miR-32的表达能够有效提高Bim的表达，并且能使急性淋巴细胞白血病细胞对化疗敏感。此外，有研究还发现miR-32过表达与结直肠癌的发生有很大关系[27]。但是目前在骨肉瘤中miR-32的作用还不清楚。

PI3K/Akt通路是细胞中重要的信号传导通路，主要参与调控细胞的增殖分化、凋亡和转移等过程，通路中上游控制基因PTEN对PI3K/Akt通路至关重要。近期杜媛鲲等[28]发现Gli蛋白表达上调通过PI3K/Akt通路促进肺腺癌细胞侵袭转移[28]。随着对癌细胞增殖、分化、凋亡机制的深入研究，人骨肉瘤细胞MG63相关的研究不断被报道。李国慧等[29]、张素领等[30]发现苦参碱、紫杉醇脂质体能诱导MG63细胞的凋亡，并呈良好的时间-剂量效应关系。

本研究探讨了miR-32在骨肉瘤中的作用及机制，结果显示骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞株中miR-32均处于高表达的状态；随后通过生物信息学预测了与miR-32相互作用的靶基因是PTEN；然后用荧光素酶实验进一步验证预测的假设，证明miR-32确实可以与PTEN的3′-UTR区靶向结合；接下来分别抑制或过表达miR-32，观察其对MG-63细胞株增殖的影响，显示抑制miR-32可以降低MG-63细胞的增殖速率，过表达miR-32时MG-63细胞增殖加快。本研究分别从蛋白质和RNA水平上观察与PTEN有关的PI3K/Akt信号通路的变化，显示过表达miR-32能够激活该通路引起下游细胞周期蛋白的表达，从而加速细胞的增殖；同时还显示miR-32调控MG-63细胞的增殖并不是靠单一分子机制完成的，PI3K/Akt可能是其分子机制之一。本研究为miR-32调控骨肉瘤的增殖提供理论参考，并提示miR-32可能作为治疗骨肉瘤的潜在靶点。

近几年，随着对于miRNA研究的深入和新的miRNA的发现，这个翻译后修饰的明星分子在其分子机制、疾病的诊断和治疗等领域均取得了初步成果[31]，在肿瘤研究领域也取得了较大进展。很多组织特异表达的miRNA可以为肿瘤的诊断提供线索，提高肿瘤预防的可能性。目前对于miRNA的研究均是进行细胞或组织的敲降或敲除，以及进行目的miRNA的过表达，检测其对生命活动如增殖、凋亡、自噬等的影响。但是生命活动并非单一而是及其复杂的，某一个miRNA可以调节多个基因，而一个基因可能同时受到多个miRNA的调节，同时现在的研究表明，表达后调控可能通过多种RNA 如LncRNA、miRNA和 mRNA形成网络式的调控[32-33]。miRNA的作用虽然有组织表达特异性，但能够单独起到较大作用的miRNA有待继续深入的研究，对miRNA的认识有助于理解肿瘤的发生发展。随着生物技术发展的进步以及对生命科学的不断探索，miRNA在肿瘤形成发展中的作用将进一步得到阐释，这些研究将为肿瘤的临床诊断和基因治疗提供新的思路[34]。

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