肺结核是由结核分枝杆菌(MTB)引起的慢性传染病，严重危害人类健康。近年来，由于艾滋病流行、人口流动频繁等因素，耐多药结核分枝杆菌日益增多，全球结核病的防治形势严峻[1]。结核菌感染患者，临床表现多样，给临床诊断带来很多困难。实验室检查对于结核病诊断和有效治疗意义重大。传统病原学检测主要是痰涂片镜检和MTB培养，前者虽简便易操作，但敏感性较差，易造成漏诊，后者检测时间过长，不能满足临床诊疗需求。如何获取快速准确的病原学诊断结果尤为重要。为提高痰液中抗酸杆菌的检出，参考相关文献[2,3]，在传统痰涂片染色基础上进行步骤改良，形成改良抗酸染色法。近年来随着分子生物学检测技术的不断发展，以免疫学和PCR技术为代表的诊断技术成为结核病快速诊断的方向[4]。本研究采用改良抗酸染色法、交叉引物恒温扩增(CPA)技术、改良抗酸染色法联合CPA技术和Xpert MTB/RIF技术同时对肺结核患者的痰标本进行检测，通过对四种方式的阳性检出率进行比较，旨在探索建立一种适合基层医疗机构肺结核的检测诊断模式。

1 资料与方法

1.1 一般资料 根据“结核病诊断和治疗指南[5]”，收集2016年7月至2017年6月石家庄市第一医院及石家庄市第五医院诊断为肺结核的患者痰标本共325份，其中男201例，女124例；年龄17～89岁；其中涂阳标本81例，涂阴标本244例。

1.2 仪器与试剂 细胞涂片离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，普通光学显微镜(日本奥林巴斯)，萋尼抗酸染液(珠海贝索生物技术有限公司)，结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(杭州优思达生物技术有限公司)，Xpert MTB/RIF检测系统与试剂盒(美国Cepheid公司)。

创新是工会工作充满活力和生机的不竭动力，创新要自觉地围绕全面深化改革的总目标，要团结和动员广大职工积极投身到全面建成小康社会、实现中华民族伟大复兴的中国梦的伟大实践中去。只有这样，才能真正增强工会工作的活力，增强工会组织的凝聚力。

1.3 方法

1.4 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2.4 4种检测方式总体阳性检出率比较 325例肺结核患者痰液标本肺结核分枝杆菌4种检测方式检出率分别为：改良抗酸染色阳性123例，阳性检出率为37.8%，交叉引物恒温扩增(CPA)技术检测阳性190例，检出率为58.5%，改良抗酸染色法联合CPA技术检测阳性211例，检出阳性率为64.9%，Xpert MTB/RIF技术检测阳性213例，检出阳性率为65.5%。改良抗酸染色法总体阳性率低于其他3组，差异有统计学意义(χ2=66.756，P=0.000),CPA技术组、改良抗酸染色法+CPA技术组、Xpert MTB/RIF技术组阳性率比较差异无统计学意义(χ2=4.284，P=0.117)。见表3。

2.2 81例涂阳标本4种检测方式阳性率的比较 涂阳标本81例，改良抗酸染色法检测阳性率为91.4%，CPA技术检测阳性率为93.8%，改良抗酸染色法联合CPA技术检测阳性率为95.1%，Xpert MTB/RIF技术检测阳性率为98.8%。4种检测方式阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

案例3：在“均值不等式的定理”一节中，可用“某商店在节前进行商品降价酬宾销售活动，拟分两次降价，有三种降价方案：甲方案是第一次打A折销售，第二次打B折销售；乙方案是第一次打B折销售，第二次打A折销售；丙方案是两次都打—样折销售，问哪一种方案降价较多？”

1.3.1 改良抗酸染色法：取约1 ml痰标本，视痰液性状加相当于2倍标本体积的10%NaOH进行前处理，涡旋振荡直至痰液完全液化，取1 ml经过前处理的痰标本，离心15 min，制片，室温晾干并用火焰固定，将固定好的待检玻片置于玻璃槽中，加0.2%的Triton-X100(现用现配)，置4℃冰箱破膜处理30 min，取出玻片，冲片(用0.01 mol/L的PBS)，自然晾干行抗酸染色，严格按照《结核病实验室标准化操作与网络建设》要求[6]进行操作。

2 结果

2.3 244例涂阴标本四种检测方式阳性率比较 涂阴标本244例，改良抗酸染色法检测阳性率为20.1%，CPA技术检测阳性率为46.7%，改良抗酸染色法联合CPA技术检测阳性率为54.9%，Xpert MTB/RIF技术检测阳性率为54.5%。改良抗酸染色法阳性率差异有统计学意义(χ2=80.099，P=0.000),进一步分析发现CPA技术组、改良抗酸染色法+CPA技术组、Xpert MTB/RIF技术组比较，差异无统计学意义(χ2=4.171，P=0.124)。见表2。

 

  

图1 传统抗酸染色(×1000)图2 改良抗酸染色(×1000)

1.3.3 改良抗酸染色法+CPA技术检测：采用改良抗酸染色法结合CPA技术检测，痰标本先行采用改良抗酸染色法检测，阴性样本再行采用CPA技术检测，统计阳性检出率。

1.3.4 Xpert MTB/RIF技术检测：取约5 ml痰液标本至50 ml离心管中，加等体积2%NALC-NaOH前处理液，涡旋振荡直至痰液充分液化，静置15 min，加PBS(pH值为6.8)至45 ml，3 000×g离心15 min，弃上清，再加3 ml PBS重悬洗涤，中和pH值为6.8，备用。取1 ml处理好的痰液加入到前处理管中，视标本性状加入2 ml SR样本处理液，旋紧管口，震荡15～30 s，室温静置15 min。打开反应盒，用专用无菌吸管吸取2 ml 处理后样本缓慢加入反应盒中，然后将反应盒放入到检测模块，仪器进行核酸提取，扩增和结果检测。反应结束后，在检测系统窗口下直接观察结果。

他潇洒地走了，颜晓晨却犹如做梦一般回了宿舍，她不知道他到底哪根神经搭错了，但真的很开心，希望他多神经错乱一段日子。

 

表1 81例涂阳标本检测结果

  

方法阳性例数阳性率(%)改良抗酸染色法7491.4CPA技术7693.8改良抗酸染色法+CPA技术组7795.1XpertMTB/RIF技术组8098.8 χ2值4.656 P值0.199

2.1 传统抗酸染色和改良抗酸染色法镜下比较结果 对同一标本应用两种方法分别制备痰涂片行抗酸染色，传统抗酸染色法痰涂片油镜下观察，蓝色背景为纤维蛋白丝和细胞成分，结核分枝杆菌较少。经改良抗酸染色后的痰涂片油镜下观察，结核分枝杆菌表现为成堆、成束或单个的细长或直或弯的红色杆菌，背景呈淡蓝色，较清晰。典型图片如下，箭头所示为结核分枝杆菌。见图1、2。

 

表2 244例涂阴标本检测结果

  

方法阳性例数阳性率(%)改良抗酸染色法4920.1CPA技术11446.7*改良抗酸染色法+CPA技术组13454.9*XpertMTB/RIF技术组13354.5* χ2值80.099 P值0.000

注：与改良抗酸染色法比较，*P<0.05

1.3.2 CPA技术检测：使用商品化结核分枝杆菌核酸检测试剂盒进行目的片段的检测，经过样本处理、DNA提取、恒温扩增及检测步骤，详细操作参照产品说明书。

 

表3 325例四种检测方式总体阳性率

  

组别阳性例数阳性率(%)改良抗酸染色法组12337.8CPA技术组19058.5*改良抗酸染色法+CPA技术组21164.9*XpertMTB/RIF技术组21365.5* χ2值66.756 P值0.000

注：与改良抗酸染色法比较，*P<0.05

3 讨论

我国是结核病高负担国家[7]，结核病的防治关键在于早期发现。结核病细菌学检查是早期发现传染源的主要途径，也是确定结核病诊断与化疗方案的重要依据[8]。传统痰涂片镜检在临床应用最为广泛，但其检出率不足30%[9]，易造成漏检，且不能区分活菌还是死菌，不能真正满足临床需求。本研究所用改良抗酸染色法是在传统痰涂片镜检的基础上进行步骤改良，首先，痰标本需经前处理，保证被包裹的结核分枝杆菌完全释放出来；其次，由于采用了玻片离心法[10,11]，使痰液中抗酸杆菌得到有效浓集；最后，在抗酸染色前用Triton-X100进行破膜处理，使被吞噬的菌体易于着色，不仅可以检测到细胞外结核分枝杆菌还可以检测到细胞内结核分枝杆菌。本研究结果表明，同一标本2种染色方法制备的涂片镜下观察，传统抗酸染色镜下结核分枝杆菌密度较小，需要看更多的视野才能定阴性阳性，而经改良抗酸染色法处理后细菌密度增大，可以减少观察视野，提高检测效率。另外，传统抗酸染色镜下由于有蛋白成分干扰，杂质较多，而改良抗酸染色法加入NaOH可以降解痰液中的蛋白成分，涂片背景清晰，呈透明的淡蓝色，便于结果观察，可以避免假阴性和假阳性结果的出现。在本研究中改良抗酸染色法其阳性率达到37.8%，但在涂阴标本中阳性率虽有提高，但与分子检测方法还有差异。

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作为发展中国家，我国结核病疫情相对严重，虽然痰涂片抗酸杆菌检查是最符合成本效益原则的细菌学检测技术[12]。但随着分子生物学技术的日新月异，越来越多的分子诊断技术开始应用于结核分支杆菌检测，CPA技术就是其中之一，它将结核分支杆菌DNA扩增、核酸杂交及核酸试纸条检测三种技术融为一体，检测结核分枝杆菌复合群特异性的插入片段IS6110[13,14]。整个检验过程在2.5 h即可完成。简单快速，不需要昂贵的PCR仪器，目测即可得到清晰的结果，只需要一恒温设备，大大降低检测成本。本研究中CPA技术检测阳性率为58.5%。Xpert MTB/RIF技术是WHO推荐的一种新的分子检测方法。在多国家的评估研究中显示出高敏感性和特异性[15]。本研究中Xpert MTB/RIF技术检测阳性率为65.5%，稍高于文献报道[16]，对于涂阳标本和涂阴标本均具有较好的检出率。目前Xpert MTB/RIF检测技术在我国的应用还处于起步阶段，昂贵的仪器及高成本检测耗材是制约该方法得以推广应用的主要阻力。本研究发现，CPA技术检测与Xpert MTB/RIF技术在涂阳还是涂阴标本中阳性率差异均无统计学意义。

刘训峰表示，华谊集团要以习近平新时代中国特色社会主义思想为指引，不忘初心，牢记使命，坚持“绿色发展、创新发展、高端发展、跨市发展、一体化发展”战略，加快“华谊制造”向“华谊创造”转型，力争早日实现营业收入1000亿元，跻身全国化工行业前3位，世界化工50强，为把华谊集团建设成为具有核心竞争力的世界一流企业、成为具有国际竞争力和影响力的企业集团而努力奋斗！

而我国的结核患者大部分在农村[17]，经济及医疗条件很差，如何利用现有农村医疗资源，建立快速、简便、阳性率高的方法意义重大。改良抗酸染色法操作简单、耗材成本低、一份标本的检测只需0.5 h。而CPA技术仅需要一恒温设备，检测投入少、成本低、应用方便。根据本研究结果提示，在基层医院，结核样本可先行采用改良抗酸法进行检测，检测阴性样本再进一步采用CPA技术进行进一步检测，两种方法联合应用，具有经济、简便、快速和高敏感度等优点，提高了诊断效率，适合在基层医院推广。

参考文献

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2 Thwaites GE,Chau TT,Farrar JJ,et al.Improving the bacteriological diagnosis of tuberculous meningitis.J Clin Microbioly,2002,42:378-379.

3 Ping Chen,Ming Shi,Guo-Dong Feng,et al.A highly efficient ziehl-neelsen stain:identifying de novo intracellular mycobacterium teberculosis and improving detecion of extracellular M.tuberculosis in cerebrospinal fluid.J Clin Microbiol,2012，50:1166-1170.

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5 中华医学会结核病学分会.肺结核诊断和治疗指南.中华结核和呼吸杂志,2001,24:5-9.

6 赵雁林,刘志敏主编.结核病实验室标准化操作与网络建设.北京：人民卫生出版社,2013.227-280.

7 何莉，赵希唯，陈刚,等.γ-干扰素释放试验在不同类型肺结核中的应用价值.第三军医大学学报，2017,39:2017-2021.

8 戴广明，曹以诚，杜正平，等.结核分枝杆菌环介导恒温扩增(LAMP)快速检测方法的评价.中国防涝杂志，2011，33：47-51.

9 齐兴峰，曾德华，郑志勇.金胺“O”染色和抗酸染色在结核病诊断中的联合应用.临床与实验病理学杂志，2010,12：26：763-764.

10 Chen P，Shi M，Feng G D，et al．Highly efficient Ziehl-Neelsenstain：identifying de novo intracellular mycobaeteriumtuberculosisand improving detection of extracellular M．tuberculosis in cerebrospinal fluid．J ClinMicrobiol，2012，50：1166-1170．

11 Feng GD，Shi M，Ma L，et al．Diagnostic accuracy of intracellular mycobaeterium tuberculosis detection for tuberculous Meningitis． Am J RespirCrit Care Med，2014，189:475-481．

12 仁增卓玛.1156份痰涂片抗酸染色镜检结果分析.青海医药杂志，2012，42：52.

13 Fang R,Li X,Hu L,et al.Cross-priming amplification for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens.J Clin Microbiol,2009,47:845-847.

14 Xu G,Hu L,Zhong H,et al.Cross priming amplification:mechanism and optimization for isothermal DNA amplification.Sci Rep,2012,2:246.

15 Creswell J,Codlin AJ,Andre E,et al.Results from early programmatic implementation of Xpert MTB/RIF testing in nine countries.BMC Infect Dis,2014,14:2.

16 李妍,张天华,鲜小萍，等.Xpert MTB/RIF 技术在MTB检测中的应用价值.检验医学杂志，2016,31：52-55.

17 初磊.肺结核病人门诊服务利用及影响因素研究.山东大学,2010.