卒中现已成为我国重大的公共卫生问题，严重威胁着人民群众的生命健康和生活质量，给患者家庭及社会带来了沉重的负担[1]。卒中具有高发病率、高死亡率、高复发率等致病特点，2008年我国居民第3次死因抽样调查结果显示，脑血管疾病已成为我国居民第一大死因[2]。卒中根据其发病原因可分为缺血性卒中和出血性卒中两大类，其中以缺血性卒中最为常见，约占脑血管疾病的60%～80%[3]。对于缺血性卒中，溶栓治疗是目前最为有效的治疗手段，但溶栓治疗不可避免地引发脑缺血再灌注损伤。这种脑缺血再灌注损伤不仅加重了脑缺血所造成的神经功能缺损程度，并且这种缺血再灌注损伤为不可逆性的损伤[4]。失荅剌知丸是《回回药方》中治疗卒中的经典方药，我们拟通过观察失荅剌知丸对脑缺血再灌注大鼠的干预效果，探讨其治疗脑缺血再灌注损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

目前，初步形成自然保护区网络，保护区总面积35.84万km2，约占长江流域面积的20%，包括白鱀豚、中华鲟和长江上游珍稀特有鱼类自然保护区等。总体而言，保护区建设将生物群落及其依赖的适宜生境作为一个整体在时间和空间上给予保护，实践证明十分有效，是今后应重点采取的保护措施之一。如“长江上游珍稀特有鱼类国家级自然保护区”，保护区范围主要为长江干流向家坝下的横江口至重庆的松溉溪段、赤水河干流和部分支流，从有关监测结果来看，保护区有效保护了长江上游的珍稀特有鱼类。

1.1.1 实验动物 204只清洁级SD雄性大鼠，5个月龄，体质量220～260 g，由宁夏医科大学实验动物管理中心提供，动物合格证书编号：SCXK(宁)2016-0001。

1.1.2 实验用药及制备 失荅剌知丸药物组成：柴胡31 g，黑诃子31 g，撒额冰(阿魏)9 g，芦荟62 g，芥子9 g，失荅剌知(血根草)6 g，沙哈木罕荅里(药西瓜)9 g，胡椒3 g，安息香9 g，巴豆霜9 g，石菖蒲6 g，番盐6 g，阿里公(松蕈)9 g，干姜9 g，荜茇9 g，芸香9 g。全部生药由宁夏医科大学第二附属医院药剂科提供，生药总质量共226 g。失荅剌知丸水煎剂的制备：①将生药除去杂质后切碎，依照组方的剂量进行配比，泡置于水中1 h，水量为药材的10倍，加热煎沸，其中安息香及撤额冰(阿魏)后下，煎至沸腾后持续微沸状态30 min，将煎液过滤取制；②将药渣泡置于水中30 min，水量为药材的8倍，煎至沸腾后持续微沸状态30 min，将煎液过滤取制；③合并步骤①、②所煎制的汤液，加热浓缩分别配置成生药量浓度为1.5、3.0、4.5 g/mL的低、中、高3种剂量药液，4 ℃冰箱保存备用。

1.1.3 对照用药及制备 尼莫地平片，拜耳医药保健有限公司，国药准字H20003010，规格30 mg。尼莫地平混悬液的制备：将药物研制成粉末状，使用纯净水配比成浓度为1.08 mg/mL的混悬液。

1.1.4 主要试剂及仪器 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)粉剂(美国Sigma公司)；Western Blotting检测试剂盒(上海信裕生物技术有限公司)；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒[中科瑞泰(北京)生物科技有限公司]；IX71荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；高速离心机(德国Eppendorf公司)。

与空白组及假手术组比较，*P<0.05；与本组灌胃1 d比较，△P<0.05；与本组灌胃3 d比较，▽P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与尼莫地平组比较，&P<0.05

与空白组及假手术组比较，*P<0.05；与本组灌胃1 d比较，△P<0.05；与本组灌胃3 d比较，▽P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与尼莫地平组比较，&P<0.05

2.金融衍生产品的风险分析。金融衍生产品本身就是一个风险规避的产品，可是这样的一个产品却在短短十年之间发生了巴林银行、中航油等数起金融事件，造成数十亿的亏损，令人瞠目结舌。这样的事实告诉我们，有必要对金融衍生产品市场的内在风险进行梳理、分析［1］18。

1.3 观察方法

1.3.1 神经功能缺损评分 在大鼠处死前采用Garcia JH神经功能评分量表对大鼠神经功能缺损情况进行评分[6]，从自发运动、体态对称实验、前肢伸展功能、网屏实验、痛觉反射、位置觉6个方面计算，满分18分，得分越高，说明损伤越轻。

在阿姆斯特丹以北15公里，桑斯安斯风车村静静地展示着荷兰的田园之美。这里古老的建筑和居民们悠然的生活状态，生动再现了17、18世纪的荷兰生活。因为地势低洼总是面临海潮的侵蚀，生存的本能给了荷兰人动力，早在13世纪他们就发明了风车，一旦堤坝内灌进海水，就用风车把水抽走。因为荷兰平坦、多风，风车很快得到普及。需求的迅速增加，又带动了风车技术的改造。

要对现阶段的土地分类体系进行优化，实现用地分类标准的统一，并且还要以现代信息化技术为基础构建信息平台，以自然资源、测绘地理等各类数据为基础，聚合集成政府和社会将测绘地理、自然资源等数据信息进行收集和整理，构建现代化的数据库，这样能够给国土空间规划的编制提供基础数据支持，进而增强国土空间规划编制的效率和水平。在新时期，要不断增强大数据在国土空间规划编制工作中的应用，建立大数据与国土规划相耦合的分析、规划预测等模型，通过数据技术不断优化国土空间规划方案，保证国土空间规划编制的科学性。

1.3.3 大鼠脑组织Nestin蛋白表达情况 各组分别在灌胃1、3、7 d时各取另一半大鼠(空白组及假手术组2只，模型组、尼莫地平组及失荅剌知丸低、中、高剂量组各6只)采用Western Blot法检测大鼠脑组织Nestin蛋白表达情况。首先采用颈椎脱臼法处死大鼠，提取大鼠海马区脑组织总蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)比色法进行蛋白定量，再行SDS-PAGE分离蛋白，取25 μg样品，以12%的SDS-PAGE分离，用半干电转移法转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，Nestin兔抗大鼠单克隆抗体稀释比例1∶300，4 ℃下摇床孵育2 h。山羊抗兔第二抗体1∶3 000比例稀释，β-actin稀释比例1∶1 000，4 ℃下摇床孵育1 h。洗膜后以目的蛋白条带灰度与内参β-actin条带灰度的比值表示蛋白的表达水平。

1.3.2 大鼠海马区神经干细胞增殖情况 各组分别在灌胃1、3、7 d时各取一半大鼠(空白组及假手术组2只，模型组、尼莫地平组及失荅剌知丸低、中、高剂量组各6只)，采用Brdu/巢蛋白(Nestin)免疫双标检测大鼠海马区神经干细胞增殖情况。Brdu标记方法：各组均给予Brdu注射标记，将Brdu按照50 mg/kg的剂量，用0.9%氯化钠注射液配置成10 mg/mL浓度溶液进行腹腔注射，每日2次，于手术后连续注射3 d，其中灌胃1 d组于处死前3 d开始注射。取材：采用颈椎脱臼法处死大鼠，取大鼠海马区脑组织，大小0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm，采用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗。固定和包埋：将脑组织用4%多聚甲醛进行固定，再用70%乙醇涮洗1次，80%乙醇浸泡1 h，95%乙醇浸泡1 h(2次)，100%乙醇浸泡1 h(2次)，二甲苯透明处理20 min(2次)，55 ℃石蜡浸泡45 min(2次)，每次操作间隔时间为5 min，最后用铜制模具包埋组织块。切片：将厚度5 μm的组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，保持60 ℃静置过夜。脱蜡、入水：将切片浸于二甲苯中1.5 h，100%乙醇涮洗2次，95%乙醇涮洗1次，80%乙醇涮洗1次，自来水冲洗，室温下在3%甲醇双氧水中浸泡20 min，自来水冲洗，采用热修复方法(在电磁炉上放铁质盆，盆底放入垫板，盆里注入适量水，将切片放入盛有枸橼酸溶液的烧杯中，将烧杯放入铁盆，加热直至铁盆里的水沸腾，开始计时1～3 min，然后将烧杯取出，放入冷水中，冷却至常温即可取出切片)之后放入PBS中，然后进行划蜡。切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温静置20 min，甩去多余液体，不洗。切片上滴加Brdu+Nestin的兔抗大鼠第一抗体混合液(滴度为1∶60～70)，4 ℃静置过夜，次日取出待10～20 min后放入PBS中。切片上滴加荧光标记的Brdu+Nestin的羊抗兔第二抗体混合液，37 ℃避光20 min，放入PBS中充分水洗后，晾干，中性树脂封片。显微镜观察：在10×40高倍镜视野下观察照相，并数取该视野下的双标阳性细胞数，编号、采集，最后存盘。

1.4 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示，符合正态分布者采用单因素方差分析的最小显差法，组内比较经方差齐性检验后采用方差分析；多组间比较当各组方差齐时用LSD法比较，当各组方差不齐时用Dunnett's T3法比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能Garcia JH评分变化比较 见表1。

1.2.2 实验分组及给药 分组：将204只大鼠随机分为空白组(12只)、假手术组(12只)、模型组(36只)、尼莫地平组(36只)、失荅剌知丸低剂量组(36只)、失荅剌知丸中剂量组(36只)及失荅剌知丸高剂量组(36只)，其中模型组、尼莫地平组及失荅剌知丸低、中、高剂量组再分别根据灌胃给药天数分为1、3、7 d组，每组12只。空白组不进行手术操作，假手术组进行假手术操作，其余各组均进行手术造模操作。造模成功后各组大鼠均按1 mL/100 g剂量给药，尼莫地平组予浓度为1.08 mg/mL的尼莫地平混悬液灌胃，失荅剌知丸低、中、高剂量组分别给予浓度为1.5、3.0、4.5 g/mL的失荅剌知丸药液灌胃，空白组、假手术组及模型组予0.9%氯化钠注射液灌胃。所有大鼠均在每日同一时间灌胃，每日2次。

 

表1 各组大鼠神经功能Garcia JH评分比较 分，

  

组 别n1d3d7d空白组417.667±0.49217.667±0.49217.667±0.492假手术组417.417±0.51517.417±0.51517.417±0.515模型组125.333±0.888*8.167±1.030*9.250±1.215*尼莫地平组127.250±1.055*#11.167±1.030*△#13.583±1.379*△▽#失荅剌知丸低剂量组126.333±1.073*#&9.750±0.965*△#&12.500±1.314*△▽#&失荅剌知丸中剂量组127.417±0.996*#11.417±0.900*△#13.583±1.311*△▽#失荅剌知丸高剂量组128.333±0.985*#&12.417±0.900*△#&14.667±1.670*△▽#&

1.2 实验方法

由表1可见，空白组与假手术组Garcia JH评分同期比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与空白组及假手术组同期比较，模型组、尼莫地平组及失荅剌知丸低、中、高剂量组Garcia JH评分均低于空白组及假手术组(P<0.05)。与本组灌胃1 d时比较，模型组、尼莫地平组及失荅剌知丸低、中、高剂量组灌胃3、7 d时Garcia JH评分均明显增加(P<0.05)。与本组灌胃3 d时比较，模型组、尼莫地平组及失荅剌知丸低、中、高剂量组灌胃7 d时Garcia JH评分均明显增加(P<0.05)。与模型组同期比较，尼莫地平组及失荅剌知丸低、中、高剂量组Garcia JH评分均高于模型组(P<0.05)。与尼莫地平组同期比较，失荅剌知丸低剂量组Garcia JH评分低于尼莫地平组(P<0.05)，失荅剌知丸中剂量组Garcia JH评分与尼莫地平组相当(P>0.05)，失荅剌知丸高剂量组Garcia JH评分高于尼莫地平组(P<0.05)。

人工模拟胃液的配制：将23.4 mL浓盐酸加水稀释至100 mL得到稀盐酸，取16.4 mL稀盐酸，加水约800 mL与10 g胃蛋白酶，混匀后加水稀释至1 000 mL。

2.2 各组大鼠海马区神经干细胞增殖情况比较 见表2。

 

表2 各组大鼠海马区神经干细胞增殖情况比较 个，

  

组 别n1d3d7d空白组22.000±1.4142.000±1.4142.000±1.414假手术组23.500±1.8713.500±1.8713.500±1.871模型组68.500±1.871*14.333±1.633*17.667±1.633*尼莫地平组614.500±1.871*#20.000±2.608*△#25.167±1.941*△▽#失荅剌知丸低剂量组611.833±2.137*#&17.000±1.414*△#&20.333±2.422*△▽#&失荅剌知丸中剂量组614.667±1.751*#20.000±2.191*△#29.000±3.464*△▽#失荅剌知丸高剂量组625.833±2.927*#&31.667±2.066*△#&37.833±2.041*△▽#&

1.2.1 动物模型制备 参照改良Longa法通过使用线栓阻塞大鼠左侧大脑中动脉建立大鼠脑缺血再灌注模型[5]。手术前所有大鼠禁食1 d，采用大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉大鼠，待大鼠彻底麻醉后，采用仰卧位固定大鼠，颈部备皮，颈部消毒，沿着颈前正中切开，钝性剥离组织，充分暴露左侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉；栓线备用，用眼科剪在颈外动脉近动脉分叉处剪一小口，牵拉颈外动脉残端使之与颈内动脉在一条线上，栓线从颈外动脉缓慢插入颈内动脉，有阻力感觉则止，缝合皮肤。假手术操作除不需插入栓线步骤外，其余同上。手术过程中保证室温控制在25～27 ℃，大鼠肛门温度在36.5～37.0 ℃。手术后大鼠出现以下表现表明造模成功：①左侧肢体疼痛回缩迟钝或消失；②倒悬时左上肢向胸前屈曲；③行走时身体向左侧倾倒或向左转圈；④左侧出现Horner综合征。

通过有效的宣传带动，使干部和农民群众充分认识到水稻机械化插秧的作用和实效，实现对农村生产要素的有效整合，提高劳动资源利用效率，拓宽农民群众增收渠道。在技术推广过程中，通过建设示范区，在村集体树立典型，让农民群众切切实实看到应用机械化插秧所带来的效果。先进技术在推广应用过程中，只有确保有广泛的群众基础，才能为新技术推广应用奠定坚实基础。

通过以上误例的分析，在通俗类古籍读物涉及到异形词时，首先应据《第一批异形词整理表》进行规范，如果该表中没有收录，应按照从俗、从简、不易混音等原则根据词频进行取舍选择。

2.3 各组大鼠脑组织Nestin蛋白表达情况比较 见表3。

由表2可见，空白组与假手术组神经干细胞增殖情况同期比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与空白组及假手术组同期比较，模型组、尼莫地平组及失荅剌知丸低、中、高剂量组神经干细胞增殖均多于空白组及假手术组(P<0.05)。与本组灌胃1 d时比较，模型组、尼莫地平组及失荅剌知丸低、中、高剂量组灌胃3、7 d时神经干细胞增殖均明显增加(P<0.05)。与本组灌胃3 d时比较，模型组、尼莫地平组及失荅剌知丸低、中、高剂量组灌胃7 d时神经干细胞增殖均明显增加(P<0.05)。与模型组同期比较，尼莫地平组及失荅剌知丸低、中、高剂量组神经干细胞增殖均多于模型组(P<0.05)。与尼莫地平组同期比较，失荅剌知丸低剂量组神经干细胞增殖少于尼莫地平组(P<0.05)，失荅剌知丸中剂量组神经干细胞增殖与尼莫地平组相当(P>0.05)，失荅剌知丸高剂量组神经干细胞增殖多于尼莫地平组(P<0.05)。

 表3 各组大鼠脑组织Nestin蛋白表达情况比较  

  

组 别n1d3d7d空白组20.512±0.1010.512±0.1010.512±0.101假手术组20.559±0.1060.559±0.1060.559±0.106模型组60.902±0.042*1.034±0.041*△1.096±0.021*△▽尼莫地平组61.180±0.060*#1.268±0.010*△#1.336±0.024*△▽#失荅剌知丸低剂量组61.019±0.082*#&1.206±0.014*△#&1.265±0.012*△▽#&失荅剌知丸中剂量组61.186±0.069*#1.274±0.009*△#1.336±0.028*△▽#失荅剌知丸高剂量组61.279±0.020*#&1.349±0.019*△#&1.408±0.024*△▽#&

与空白组及假手术组比较，*P<0.05；与本组灌胃1 d比较，△P<0.05；与本组灌胃3 d比较，▽P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与尼莫地平组比较，&P<0.05

由表3可见，空白组与假手术组Nestin蛋白表达同期比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与空白组及假手术组同期比较，模型组、尼莫地平组及失荅剌知丸低、中、高剂量组Nestin蛋白表达均高于空白组及假手术组(P<0.05)。与本组灌胃1 d时比较，模型组、尼莫地平组及失荅剌知丸低、中、高剂量组灌胃3、7 d时Nestin蛋白表达均明显增加(P<0.05)。与本组灌胃3 d时比较，模型组、尼莫地平组及失荅剌知丸低、中、高剂量组灌胃7 d时Nestin蛋白表达均明显增加(P<0.05)。与模型组同期比较，尼莫地平组及失荅剌知丸低、中、高剂量组Nestin蛋白表达均高于模型组(P<0.05)。与尼莫地平组同期比较，失荅剌知丸低剂量组Nestin蛋白表达低于尼莫地平组(P<0.05)，失荅剌知丸中剂量组Nestin蛋白表达与尼莫地平组相当(P>0.05)，失荅剌知丸高剂量组Nestin蛋白表达高于尼莫地平组(P<0.05)。

3 讨 论

传统观念认为，成年哺乳动物中枢神经系统中神经元细胞是终级分化的神经细胞，一旦发生凋亡或坏死，将不可能再生，导致其功能丧失而无法代偿。但Altman J[7]在1962年通过用氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法，提供了成年鼠海马齿状回产生新神经元的放射自显影证据,首次发现脑室下区域在出生后可产生新的细胞。1992年Reynolds等又报道了利用Neurosphere法成功从成年小鼠脑纹状体内分离出具有自我更新及分裂増殖能力，并可在特定条件下诱导分化为神经元、星形胶质细胞及小突胶质细胞的神经干细胞[8-10]。这些发现打破了成年哺乳动物中枢神经系统不能再生这一传统观念，并且随着分子生物学的逐渐发展，神经干细胞被成功分离，进一步证实了中枢神经系统中的神经元细胞在一定条件下可以增殖、分化。

Nestin是一种中间丝类型的蛋白，表达起始于胚胎早期神经前体细胞，在胚胎脑发育中呈时空序列性表达，目前主要作为神经干细胞的标记蛋白,应用于神经干细胞的分离、鉴定及培养，并且因其在中枢神经损伤后能重新表达,可作为中枢神经系统损伤最早快速应答的敏感指标[11]。Nestin是神经干细胞特异的生物学标记物，是最晚被识别且为最大的中间丝，其氨基酸残基数为1 821，相对分子量240 000，在一级结构中含有307个氨基酸组成的保守核心区,其多肽数为1条[12]。1990年Lendahl U等[13]发现并命名了Nestin，其主要位于未分化且具有分裂能力细胞的细胞质中，表达具有严格的时空顺序，随着细胞分化成熟，Nestin逐渐被胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经丝蛋白(NF)等其他中间丝蛋白代替而停止表达[14]。在神经干细胞分化早期，Nestin表达仍呈阳性,但随着其分化为神经细胞、星形胶质细胞或少突胶质细胞的逐渐发育成熟，Nestin表达逐渐减弱[15]。近年来研究发现，脑缺血、缺氧、创伤及理化等因素均可诱导Nestin重新表达，在脑缺血大鼠的大脑皮层、室管膜下区、海马区、缺血中心区及周边区均有Nestin的表达并持续2周[16-17]。Nestin的这一表达特性决定了其可作为中枢神经系统损伤后神经干细胞增殖的标记物，通过对Nestin的检测，即可较为准确地反映出神经干细胞增殖的情况。但为了进一步证实神经干细胞增殖的发生情况，我们选取了Brdu与Nestin进行免疫双标检测。Brdu是胸腺嘧啶核苷的类似物，可与内源性胸腺嘧啶核苷竞争掺入细胞S期核酸序列，与3H-TdR掺入机制相似，因此也可作为反映细胞增殖活性参考指标[18]。因此，Brdu与Nestin均标记为阳性的细胞就可以确定为新生的神经干细胞。

失答剌知丸是回医药学中防治脑系疾病的经典方药，原方出自《回回药方》，因原书距今年代久远，方药中药名大多又冠以民族语言，剂量单位与现在差别很大，故我们依据宋岘编著的《回回药方考释》中所记载的失荅剌知丸作为标准[19]。原书中仅用“能开缠肠肚风病，最通经络”一句话阐明了失荅剌知丸一方的方义，我们难以从这一句言简意赅的方义中准确把握失荅剌知丸的功效、主治及其组方之理，惟有通过方药组成并结合回医特有的治病理论反推。回医学认为，机体病理根源的实质是禀性衰败所致，在致病因素作用下，机体禀性体质产生痰、瘀血、湿浊、黄水等病理产物，未能及时排出，停积于机体内，最终成为疾病发生的根源，其中黑血根源、白痰根源、黄痰根源被认为与缺血性卒中的发生密切相关[20-21]。失荅剌知丸全方药物组成多有芳香启闭、化痰利湿、祛寒通络之功，故可以将其主治、功效概括为祛除脑中浊物风痰，通络启闭，通神醒脑，并可用于治疗缺血性卒中后所致口眼歪斜、半身不遂等症状，先前的多项临床观察研究也均证实其疗效显著[22-24]。

本研究结果显示，与空白组及假手术组同期比较，其余各组大鼠神经功能Garcia JH评分均明显降低(P<0.05)，神经干细胞增殖明显增多(P<0.05)，Nestin蛋白表达明显增高(P<0.05)，说明造模后大鼠神经功能均受到一定程度损伤，经过尼莫地平及失荅剌知丸治疗后神经干细胞出现明显增殖，神经功能均得到一定恢复，并且随着治疗时间的增加，效果越明显。与尼莫地平组同期比较，失荅剌知丸低剂量组(1.5 g/mL)对神经功能Garcia JH评分升高、神经干细胞增殖增多及Nestin蛋白表达增高均不及尼莫地平组(P<0.05)，失荅剌知丸中剂量组(3.0 g/mL)与其治疗效果相当(P>0.05)，失荅剌知丸高剂量组(4.5 g/mL)治疗效果则明显优于尼莫地平组(P<0.05)，说明4.5 g/mL浓度的失荅剌知丸治疗效果最好。

本研究结果表明，失荅剌知丸对脑缺血再灌注大鼠的神经功能损伤具有确切疗效，可明显改善大鼠神经功能损伤症状，促进Nestin蛋白表达，其作用机制可能与促进神经干细胞增殖有关，并且其促进作用具有剂量和时间依赖性。此外，我们仅从神经干细胞增殖方面探究了失荅剌知丸对脑缺血再灌注大鼠神经功能损伤的治疗作用，是否还存在其他方面作用机制，有待将来进一步深入研究。

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