原发性肝癌(以下简称肝癌)是我国最常见的恶性肿瘤之一，据统计我国每年约有13万人死于肝癌，肝癌标化死亡率为10.09/10万，其发病率在恶性肿瘤中排第6位，死亡率居所有肿瘤中第3位[1-2]。肝癌在病理上可分为肝细胞性和胆管细胞性2类[3-4]。现代医学主要采用手术、放化疗、血管介入治疗等方法，但疗效并不理想，5年生存率仅8%～10%[5-6]。

中药蔓荆子为马鞭草科植物单叶蔓荆Vitex trifolia L.var.simplicifolia Cham.或蔓荆Vitex trifolia L.的干燥成熟果实，具有疏散风热、清利头目的功效[7]。近年来研究表明，蔓荆子具有抗某些恶性肿瘤的作用，如乳腺癌、宫颈癌、肺癌和胃癌等[8-9]。紫花牡荆素(Casticin)是从蔓荆子中提取和纯化的一种活性成分[10]。Casticin作为蔓荆子抗肿瘤的主要活性成分，其作用机制成为国内外学者的研究热点。目前尚不清楚Casticin抑制肝癌细胞侵袭迁移的作用机制。我们通过研究Casticin对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响及肿瘤转移相关基因蛋白表达水平的影响，明确Casticin对肝癌细胞侵袭迁移的抑制作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药品 CCK-8溶液(上海碧云天生物技术有限公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；改良伊格尔培养基(DMEM)(美国Corning公司)；0.25%胰酶(美国Gibco公司)；链霉素/青霉素双抗液(美国Gibco公司)；Transwell小室(美国Corning公司)；MTA1、nm23-H1、ARHGAP9一抗抗体(美国CST公司)。Casticin提取和配制：将蔓荆子干燥粉碎后，用70%乙醇加热回流提取3次，提取液滤过，合并滤液，减压浓缩成棕褐色浸膏。将浸膏用200～300目的硅胶进行柱层析，以不同比例的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，经薄层层析(TLC)检验合并相同流份，各流份再反复经硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、重结晶等分离纯化手段，最后得到黄色单体化合物Casticin(含量达98%以上)。实验时将Casticin用二甲基亚砜(DMSO)溶解成高浓度母液，实验时用DMEM培养基稀释成终浓度。

1.1.2 实验仪器 酶联检测仪(SDFY312，美国宝特)；全自动数码凝胶成像分析系统(FluorChem FC3，美国ProteinSimple公司)；超净工作台(SW-CJ-2FD，苏州博莱尔净化设备有限公司)；二氧化碳(CO2)培养箱[MCO-18AIC(UV)，日本SANYO公司]；电泳仪(164-5050，美国BIO-RAD公司)。

由表3可见，不同浓度的Casticin作用HepG2细胞之后，侵袭到下室的细胞减少，并且呈明显的剂量依赖性,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.001)。

1.2.1 细胞与细胞培养 人肝癌HepG2细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，用含10%的胎牛血清、1%链霉素/青霉素双抗液的DMEM高糖培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养，每2 d换液1次，当细胞生长至80%～90%时进行传代。

材料四王守仁：“心即理”，“致良知”。他认为良知是存于人心中的天理，但良知往往被私欲所侵蚀，所以要加强道德修养，去掉人欲，恢复良知。

1.2.3 细胞迁移和侵袭实验 采用Transwell实验检测Casticin对HepG2细胞迁移和侵袭的影响，首先对细胞进行血清饥饿，即实验前将不同分组的细胞换成无血清基础培养基继续培养24 h后，设置不同浓度(0.5、1、2 μg/mL)Casticin的阳性对照组及空白对照组(等容积培养基)。接种前将24孔板和Transwell小室用磷酸盐缓冲液(1×PBS)浸泡5 min湿润小室(侵袭实验需要加一步：在小室中铺80 μL基质胶，37 ℃培养箱中放置30 min使其凝固)；细胞处理后，用胰酶消化细胞，无血清培养液洗涤细胞并重悬，计数并调整细胞密度到2.5×105/mL，接种0.2 mL细胞悬液(5×104个细胞)到Transwell小室内，下室加入0.7 mL含10%胎牛血清的培养基，每组3个复孔，置于37 ℃培养箱中培养24 h(侵袭实验培养36 h)终止培养；培养结束后，每孔加入0.5 mL 4%多聚甲醛溶液，室温固定10 min；吸去固定液，用1×PBS洗涤1次，每孔加入0.5 mL 0.5%结晶紫溶液，染色30 min后用1×PBS洗3次；用棉签小心擦去Transwell小室内没有迁移的细胞，置于40倍显微镜下观察，计数每个视野中的细胞数。

1.2.4 蛋白质免疫印迹法(Western Blot) 将HepG2细胞悬液按每孔2×105接种到6孔板，细胞贴壁后设置空白对照组(等容积培养基)和不同浓度Casticin(0.5、1、2、4 μg/mL)组，继续培养至90%后，用刮板将细胞刮下，每孔加入100 μL的裂解液充分混匀，冰上裂解30 min，期间不时晃动离心管，使细胞裂解完全；随后4 ℃,12 000 r/min离心15 min；取上清测蛋白浓度，按照1∶4的比例加入5×蛋白上样缓冲液混匀，70 ℃煮15 min，使蛋白变性；配制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将不同组的蛋白样本按等量蛋白上样跑胶，转膜后用5%脱脂奶粉封闭1 h，然后分别孵育MTA1、nm23-H1、ARHGAP9抗体，4 ℃过夜；然后二抗室温孵育1 h，底物显色得蛋白条带。

阿囡笑道：“七爷写得好，我正是要这样说。就是起头那几个字不好，你把它改了罢。”燕西道：“这是外国人写信的规矩，无论写信给谁，前面都得加上一个亲爱的。”阿囡道：“我又不是外国人，他也不是外国人，我学外国人作什么？”燕西笑道：“我就是这样写，你不合意，就请别人写罢。”阿囡道：“就请你念完了再说罢。”燕西于是又笑着念道：因为这个缘故，我久在北京是很不放心的，我打算今年九、十月里，一定到上海来。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 5软件对统计数据进行作图分析，Image J软件对Western blot结果图像进行采集。实验结果均以均数±标准差表示，采用t检验。

2 结 果

2.1 不同浓度Casticin对HepG2细胞活性的影响 见表1。

一是依靠大众创新来丰富生产供给。大连传统产业项目比重大，产业结构总体偏重化，以石化、装备制造、造船、电子信息、汽车及零部件等为代表的传统优势项目，正面临产品需求市场萎缩的时代变革，已不同程度地出现了产能相对过剩，进入“龙头企业通吃”的零和博弈阶段，只有做到同行业冠军层次才能持久利润。要抓紧推进传统项目企业产品研发升级换代，启动传统项目龙头培育工程，围绕客户需求和产品用途，发展定制化、柔性化生产，建立 “售前—售中—售后”一体化服务体系，打造同行业标杆式高精尖企业品牌。

宁远中学“润泽教室”通过开发德育微课程，从班级、学校德育工作的困惑中寻找突破点，紧紧围绕学生当下生活，设计以“学生全部生活”为核心的班本课程，关注每一位孩子的心灵感受，通过润泽心灵促使学生行为的改变。每天利用晚自习前十分钟就当天发生的或者社会的焦点话题进行德育微课程学习交流。通过自主学习任务单、微课视频、自媒体交流工具，在短时间内实现了全体学生的广泛参与，通过润泽心灵促使学生行为的改变，实现无痕德育，改变从“外”而“内”的育人模式，实现从“内”而“外”的教育愿景，这就是有效德育。

 表1 不同浓度Casticin对HepG2细胞活性的影响  

  

空白对照组0.5μg/mL1μg/mL2μg/mL4μg/mL8μg/mL16μg/mL12hOD5500.824±0.0250.835±0.0210.748±0.0410.708±0.0210.552±0.0560.535±0.0240.483±0.032P值0.791170.061740.065800.00001**0.00000**0.00000**24hOD5500.677±0.0230.642±0.0250.622±0.0240.605±0.0540.481±0.0560.444±0.0340.400±0.032P值0.143200.060400.063190.00000**0.00000**0.00000**48hOD5500.447±0.0560.427±0.0650.420±0.0780.381±0.0460.386±0.0240.322±0.0340.326±0.021P值0.176890.190720.00699*0.00091**0.00000**0.00000**

与空白对照组比较，*P<0.01,**P<0.001

由表1可见，不同浓度的Casticin作用HepG2细胞之后，检测其OD值减小，并且呈明显的时间和剂量依赖性,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01,P<0.001)。

2.3 不同浓度Casticin对MTA1表达的影响 见表4，图3。

 表2 不同浓度Casticin对HepG2细胞迁移的影响  

  

空白对照组0.5μg/mL1μg/mL2μg/mL细胞数(均值)390±19324±12252±24168±22P值0.00201*0.00001**0.00000**

与空白对照组比较，*P<0.01,**P<0.001

由表2可见，不同浓度的Casticin作用HepG2细胞之后，其迁移到下室的细胞减少，并>且呈明显的剂量依赖性,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.001)。

1.2.2 CCK-8实验 取对数生长期的HepG2细胞，以细胞浓度为2×104个/mL接种于96孔板中，每孔100 μL，培养过夜，细胞铺满板底的80%左右，吸取培养基，设置不同浓度(0.5、1、2、4、8、16 μg/mL)Casticin的阳性对照组及空白对照组(等容积培养基)，每个浓度设置6个复孔，继续培养12、24、48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液37 ℃孵育45 min，测定550 nm处的吸光度值(OD550 Value)。

 表3 不同浓度Casticin对HepG2细胞侵袭的影响  

  

空白对照组0.5μg/mL1μg/mL2μg/mL细胞数(均值)311±19259±20197±18134±24P值0.00910*0.00005**0.00000**

与空白对照组比较，*P<0.01,**P<0.001

1.2 方法

2.2 不同浓度Casticin对HepG2细胞迁移和侵袭能力的影响 见表2、3，封3(图1、2)。

 表4 不同浓度Casticin对MTA1表达的影响  

  

空白对照组0.5μg/mL1μg/mL2μg/mL4μg/mL相对表达量1.000±0.0320.792±0.0250.625±0.0580.403±0.0490.292±0.054P值0.00061*0.00000*0.00010*0.00002*

与空白对照组比较，*P<0.001

  

图3 不同浓度Casticin对MTA1表达的影响

由表5、6及图4、5可见，不同浓度Casticin作用HepG2细胞后，nm23-H1和ARHGAP9蛋白的表达量发生变化，并且呈明显的剂量依赖性,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.001)。

原发灶直径大小是反映乳腺癌特性及其预后的重要参考指标之一。既往研究表明，随着肿瘤病灶直径的增大，非前哨淋巴结转移的比率随之增大[11-15]。 一项包含56项研究的荟萃分析[3]显示， 肿块最大径>2 cm 病人NSLN 转移的风险是肿块最大径≤2 cm病人的2.41倍。本研究中病灶大小>2 cm时，nSLN阳性率为65%(11/17)，病灶大小≤2 cm时，nSLN阳性率为36%(17/47)，前者为后者的1.8倍，与既往研究结果相近。可见原发病灶较大的乳腺癌患者，其非前哨淋巴结发生转移的几率更大。

由表4、图3可见，不同浓度的Casticin作用HepG2细胞之后，MTA1蛋白表达量降低，并且呈明显的剂量依赖性,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.001)。

2.4 不同浓度Casticin对nm23-H1及ARHGAP9表达的影响 见表5、6，图4、5。

 表5 不同浓度Casticin对nm23-H1表达的影响  

  

空白对照组0.5μg/mL1μg/mL2μg/mL4μg/mL相对表达量1.000±0.0651.4374±0.0541.632±0.0641.754±0.0791.792±0.078P值0.00000**0.00014**0.00198*0.00187*

与空白对照组比较，*P<0.01,**P<0.001

 表6 不同浓度Casticin对ARHGAP9表达的影响  

  

空白对照组0.5μg/mL1μg/mL2μg/mL4μg/mL相对表达量1.000±0.0871.391±0.0761.553±0.0581.754±0.0641.791±0.087P值0.00000**0.00007**0.00198*0.00483*

与空白对照组比较，*P<0.01,**P<0.001

  

图4 不同浓度Casticin对nm23-H1表达的影响

  

图5 不同浓度Casticin对ARHGAP9表达的影响

3 讨 论

肿瘤细胞转移是恶性肿瘤患者死亡的主要原因，因此研究肿瘤转移所涉及的基因和基因产物是目前国内外肿瘤分子生物学研究的热点。肝癌转移的过程十分复杂，首先肝癌细胞与细胞间、细胞与基质间的黏附性降低，肿瘤细胞脱离原瘤灶侵犯邻近组织，运动和增殖能力增强，同时分泌蛋白酶，如基质金属蛋白酶(MMP)等降解细胞外基质，穿越一系列天然屏障(如间质结缔组织、基底膜)，进入血管和淋巴管后分泌免疫抑制因子以逃避宿主免疫系统的攻击，到达靶组织器官进行细胞增殖的同时分泌刺激肿瘤血管生成的血管内皮因子，促使肿瘤血管生成，转移灶才能长大[11]。因此，肿瘤转移是一个涉及多步骤、多种基因及其产物的过程，受着多种基因正负作用的调控[12]。肝癌是一种发病率和死亡率都较高的恶性肿瘤，尽管目前临床有多种治疗方案，但如何抗转移一直是治疗过程中的棘手问题。肝癌早期诊断率低，术前难以确认有无微小转移，早期侵袭转移是肝癌术后高复发率的主要原因，因此深入对其侵袭转移分子机制的研究，寻找更有效的早期诊断和判断复发的指标，从而有效减低肝癌复发率、死亡率，提高生存率具有重要意义[13]。

中医古籍无肝癌病名的记载，据其常见临床表现，当属“肝积”“伏梁”“胁痛”“癥积”“臌胀”“黄疸”等范畴[14]。肝癌脏腑定位于肝、脾，其病因、病机不外乎虚实两端，在其发生发展中肝郁脾虚为启动因素，络脉瘀阻为重要环节，而癌毒胶着为肝癌缠绵难愈的症结所在。治法强调扶正解毒化瘀，扶正以滋补肝肾、益气健脾为主，祛邪则以解毒化瘀为重，且强调扶正祛邪并重，或扶正重于祛邪。许多中药如香附、龙胆草、北沙参、麦冬、牛膝、郁金等被报道能改善肝癌患者全身状况，增强机体免疫功能，提高生存质量，延长生命，降低癌症死亡率[15]。

Casticin是一种具有广泛药理活性的多甲基黄酮类化合物，研究表明，Casticin具有抗肿瘤、抗炎、抗催乳素等作用，与细胞有多个结合靶点，其通过抑制细胞增殖、诱导凋亡等途径发挥抗肿瘤效应；通过抑制炎症因子释放和调节内分泌发挥抗炎、止痛等作用；通过清除氧自由基而发挥抗氧化作用[16]。而目前其在抗肿瘤方面的作用已经成为国内外研究者关注的重点。

在多种肝癌相关基因中，促转移基因MTA1在肿瘤侵袭和转移中起着积极的调控作用，已发现MTA1基因可通过β-catenin、MMP-9调节肝癌细胞的黏附、侵袭和迁移，沉默MTA1基因可明显使肝癌细胞生长减慢、细胞侵袭及转移能力下降[17-19]。抑转移基因nm23-H1与肝细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤等多种人类肿瘤的转移和预后相关[20]。ARHGAP9基因在细胞增殖和转移中起至关重要的作用，ARHGAP9高表达同样可以降低肝癌细胞的黏附作用[21]。

水库长年较低水位运行，原本在水面线以下的土地常年暴露在外，土地被村民或企业侵占从事其他活动。①从事农业耕种。通过多年的耕种，村民把土地据为己有，土地耕种仍由原镇、村经营，没有真正实现由水库管理单位使用管理。②建造房屋居住。村民私自在水库管理范围内建造房屋，并长期居住，水库管理单位没有执法权，发现后不能驱离人员、拆除违建设施，苦于无应对措施，形成现状。③被企业填土造地并建设厂区。水库原有土地闲置后，疏于管理，被企业填土造地，并建设厂区，水库管理单位难以收回土地。

本研究中，我们通过CCK-8实验发现不同浓度Casticin对肝癌HepG2细胞活性具有良好的抑制作用，并且呈明显的时间和剂量依赖性；Transwell实验证明，Casticin能够大幅度减弱HepG2细胞侵袭和迁移的能力；Western Blot实验表明，Casticin下调促转移基因MTA1蛋白的表达水平，并上调抑转移基因nm23-H1和ARHGAP9蛋白的表达水平，且均呈剂量依赖性。以上研究结果说明Casticin具有抗肝癌转移的潜力，且其抗转移能力与转移基因MTA1、nm23-H1和ARHGAP9相关。在今后的肝癌研究中，Casticin极有可能成为抗肝癌转移的候选新药，对于临床攻克肝癌具有十分重要的意义。

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