伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)在各类意外伤害事件中频繁发生，患者伤后常患有不同程度的感觉、运动、认知功能障碍。脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是一种主要分布于中枢神经系统中的神经营养因子。有研究[1]表明，BDNF具有抗凋亡、抗氧化和阻滞钙通道的作用，且在神经细胞的生长发育及保护修复进程中发挥着重要作用。microRNA(miRNA)是长度为18～25 bp非蛋白质编码的小分子RNA，其主要通过结合RNA诱导沉默复合(RNA-induced silencing complex，RISC)形成功能单位，继而与靶miRNA的3′UTR互补结合，通过降解miRNA或阻碍其翻译，调控基因的表达与翻译[2-4]。有研究[5-6]发现，人类约有三分之一蛋白质编码的基因受到miRNA调控，miRNA在中枢神经系统的发生发育以及神经保护等过程中发挥关键作用，并广泛参与了肿瘤、神经系统损伤和退行性疾病的发生发展进程。本研究探索了BDNF/miR-195通路在TBI大鼠中的作用。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 细胞株、主要材料与试剂 N2A和SY5Y神经细胞购自ATCC公司。酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司，CCK-8购自日本同仁化学公司，miR-195引物由苏州吉玛生物公司设计并合成，PCR检测试剂购自北京全式金生物科技有限公司，抗体购自美国Cell Signal Technology公司，BDNF外源蛋白购自美国Millipore。Strong204台式牙钻Saeshin公司生产，自由落体打击装置、脑立体定位仪和电泳设备购自美国伯乐公司。

1.2 临床资料 选取2016年2月至2017年2月同济大学医学院上海公利医院神经外科接受治疗的的25例TBI住院患者作为观察组，同时选取25例健康人作为对照组。入选标准：(1)患者在脑损伤2 h内入院；(2)所有参与者均签署知情同意书。2组人群年龄、性别等一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。观察组在损伤入院后立即取静脉血，后在24、48和72 h各取血1次。

1.3 动物实验 (1)动物分组：70只健康雄性SD大鼠(同济大学医学院动物中心，动物许可证号：2017-02-1147)，体质量100～110 g。按照数字表随机分成3组：对照组10只、TBI组30只和治疗组30只，TBI和治疗组再各自分为轻度组、中度组、重度组(每组10只)。(2)TBI大鼠模型的构建：参照文献[7]建立脑损伤模型。用10%水合氯醛以0.35 ml/kg腹腔内注射进行麻醉，剪去大鼠顶枕部毛发，常规消毒后，于顶部中线切开头皮，剥离骨膜，暴露右顶骨，在人字缝前方2 mm。颅骨中线旁2 mm钻直径为5 mm的圆形骨窗，保持硬脑膜完好无损，采用自制自由落体打击装置，将撞杆置于硬膜上，用20 g砝码分别于10、30 cm高处沿外周导管坠落，撞击撞杆间接撞击硬膜，致右顶叶轻、中度脑挫裂伤；另用40 g砝码于25 cm高处坠落致重型损伤。打击后切口内滴注4万U硫酸庆大霉素，记录打击时间，骨蜡封闭颅骨破损区，缝合头皮。对照组仅开颅窗。(3)神经功能评价：大鼠损伤后24 h内给予大鼠BDNF、miR-195静脉注射，1次/d。采用神经损伤严重程度评分(neurological severity score，NSS)[8]，该评分方法由运动、感觉、反射和平衡实验4部分组成，神经功能评分0分为正常；1～6分为轻度损伤；7～12分为中度损伤；13～18分为严重损伤。分别于注射后7、14、21 d，随即处死大鼠，进行NSS评分。

山路环绕，河水蜿蜒。“中国芒果之乡”百色市西郊38公里处，就是广西农垦国有阳圩农场。这里地处南亚热带季风区域，气候温和，雨量充沛，土壤肥沃，拥有芒果种植不可多得的自然环境。

1.6 CCK-8法和Western blotting法检测大鼠神经细胞生长和凋亡能力 采用CCK-8法检测BDNF、miR-195对N2A和SY5Y的影响；采用Western blotting法检测细胞凋亡标记分子caspase-3和凋亡抑制分子Bcl-2的表达。

随着现代化进程的不断推进，钢铁积累不断增加，废钢重铸将逐渐增多，特别是表面镀锌等金属回炉重铸，高炉粉尘及灰渣中会含有锌元素。因此，在高炉粉尘和灰渣中富集、提取氧化锌逐渐成为关键固废资源回收的热点问题。我国锌资源储备丰富，分布广泛，品位主要集中在1%～7.5%之间，品位大于等于6%以上的已探明锌矿资源量仅全国总量33.3%[2]。高炉粉尘中回收锌元素对低品位锌矿的利用也有着重要的借鉴作用。

1.4 ELISA法测定大鼠脑组织中BDNF含量 分别在大鼠伤后0.5、3、6、12、24和48 h将大鼠过量麻醉后，断头取脑，迅速剥离脑组织，用高速均质机在冰水浴中匀浆，5 000×g离心25 min，收集上清液，ELISA法测定大鼠脑组织中BDNF含量。

2.1 TBI患者血清中BDNF和miR-195含量的变化 同健康组相比，患者入院0 h时血清BDNF含量显著下降，miR-195含量显著上升，但随着入院时间的增长其含量接近正常值。见表1、图1。

2.3 BDNF促进大鼠神经细胞N2A和SY5Y增殖 CCK-8法检测结果(图3A、B)显示，BDNF可促进神经细胞N2A和SY5Y增殖，抑制其凋亡，而miR-195可显著抑制N2A和SY5Y细胞增殖，促进其凋亡。Western blotting法检测结果(图3C)显示,BDNF降低caspase-3表达水平，提高Bcl-2表达水平；而miR-195提高caspase-3表达水平，Bcl-2降低表达水平(均P<0.01)。

2 结果

1.7 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，2组间比较应用独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

在计算机网络中存在各种安全隐患，对于现在的信息技术发展程度来说是不可避免的，很多安全隐患都对企业和人们的生产生活造成了极大的不利影响，甚至影响到了个人的人身安全，引起了社会的广泛重视。因此在社会生活中我们需要正视网络安全问题，积极开展针对性的管理措施，结合计算机网络发展的需要和技术条件，形成有效的改革和管理模式，维护网络信息安全，促进计算机网络的有效发展。

 

表1 不同时间点入院患者血清BDNF的含量(μg/ml，x±s)

  

组别例数0 h24 h48 h72 h观察组25514.5±48.9a534.6±45.7a560.8±56.9a597.6±56.7对照组25600.2±58.9600.2±58.9600.2±58.9600.2±58.9

注：与对照组比较aP<0.05。BDNF：脑源性神经生长因子

  

注：设定对照组miR-195含量为1图1 不同入院时间点患者血清miR-195的含量

2.5 BDNF/miR-195可减轻或加重大鼠TBI后神经功能的恢复 BDNF对轻度、中度和重度脑损伤的大鼠神经功能均有明显的改善作用，但当给予大鼠miR-195后，此作用受到明显抑制(P<0.05或P<0.01)。见表3。

 

表2 TBI不同时间点各组大鼠血清BDNF水平的变化(μg，x±s，每组n=10)

  

组别0.5 h3 h6 h12 h24 h48 h对照组177.0±20.4178.9±26.8175.7±30.2180.5±24.2179.5±16.9181.2±19.4轻度组220.1±30.1a121.1±21.5a110.4±27.8a100.2±25.8a98.5±29.0a86.8±15.9a中度组265.3±29.5a235.6±29.7a200.6±27.9b137.9±25.3b110.5±27.3a99.7±21.9a重度组300.5±31.2a250.8±26.7a213.8±25.1a154.2±23.7a123.5±19.7a103.6±21.0a

注：与对照组同一时间比较aP<0.01，bP<0.05

  

注：设定对照组0.5 h miR-195含量为1；与对照组比较aP<0.01图2 不同程度TBI不同时间点大鼠血清miR-195的含量水平

综上，对大数据伦理价值观的研究，一方面会激发学者们对技术创新引领下的制度建设和安排进行深度思考。技术总走在制度之前，引导制度研究的方向，尤其是法律具有明显的滞后性，在这个技术快速变革的时代更是如此。那么，法律制度应当如何应对这些由技术变革引发的社会变革呢?另一方面，也预示着大数据问题的复杂性，需要进行包括经济、法律、哲学、公共政策等在内的广泛的社会对话，以实现大数据技术应用的社会价值与个人信息利益之间的平衡。

  

注：与对应各组比较aP<0.05，bP<0.01。A为CCK-8法检测N2A和SY5Y加外源BDNF后细胞增殖能力；B为CCK-8法检测N2A和SY5Y细胞过表达miR-195后细胞的增殖能力；C为Western blotting检测外源BDNF和miR-195对N2A和SY5Y细胞的促凋亡能力；BDNF为脑源性神经生长因子图3 BDNF和miR-195在大鼠神经细胞增殖和凋亡中的作用

  

注：与相对应各组比较aP<0.01。A为RT-PCR检测N2A和SY5Y加外源BDNF后miR-195的表达水平；B为CCK-8检测不同处理组N2A和SY5Y细胞的增殖能力；C为Western blotting检测BDNF/miR-195对N2A和SY5Y细胞凋亡能力的影响；BDNF为脑源性神经生长因子图4 BDNF通过抑制大鼠血清miR-195表达抑制细胞凋亡

2.4 BDNF通过抑制大鼠血清miR-195表达抑制细胞凋亡 为了进一步探索BDNF和miR-195的关系，加入外源性BDNF后，RT-PCR检测结果(图4A)显示，N2A和SY5Y中miR-195的表达显著下调(P<0.01)；CCK-8检测结果(图4B)显示，加入BDNF后过表达miR-195可显著降低BDNF促进细胞生长的作用(P<0.01)。以上结果显示，加入BDNF后过表达miR-195可显著降低BDNF抑制细胞凋亡的作用。

2.2 BDNF和microRNA-195在TBI后大鼠脑组织中的变化 与对照组相比，TBI后大鼠脑组织中BDNF在0.5 h时显著上升，但随后逐渐下降；而miR-195含量上升，且显著高于正常水平，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2、图2。

1.5 荧光定量PCR(RT-PCR)测定大鼠脑组织中miR-195的水平 采用RT-PCR检测大鼠损伤后0.5、3、6、12、24和48 h血清中miR-195的含量。TBI患者入院后检测其血清中miR-195的含量。

 

表3 BDNF/miR-195对大鼠脑损伤后神经功能恢复的影响(分，x±s)

  

组别时间NSS评分轻度组治疗前3.2±1.1(n=10)BDNF治疗1.3±0.2bBDNF+miR-195治疗2.3±1.0a中度组治疗前7.8±3.1(n=10)BDNF治疗2.5±1.2bBDNF+miR-195治疗6.5±1.6a重度组治疗前15.7±4.5(n=10)BDNF治疗组5.3±3.8bBDNF+miR-195治疗10.8±4.4a

注：与BDNF治疗组比较aP<0.05；与治疗前比较bP<0.01。BDNF为脑源性神经生长因子；NSS为神经损伤严重程度评分

3 讨论

BDNF主要分布在海马和皮质中，少量分布在纹状体、基底前脑、丘脑、脑干和小脑，其作为神经营养因子家族的成员，在神经元损伤后再生修复和防止神经细胞退行性变等多方面发挥重要作用。Dong等[8]研究显示，TBI后BDNF可通过调节caspase-3的活性来对抗神经元的凋亡，从而起到治疗作用；如果各种原因导致caspase-3丧失活性，则BDNF不会发挥治疗作用。Trajkovska等[9]研究显示，由于BDNF可释放至脑脊液中，通过血脑屏障进入血液循环，因此脑组织与血清中BDNF水平呈正相关，患者血清BDNF浓度能部分反映脑部BDNF水平的变化。因此，本研究通过采集TBI患者外周血浆检测患者体内的BDNF水平，结果显示，BDNF水平在TBI患者血清中较正常水平显著降低，但随后升高，这可能是因为患者入院后立即采取了积极有效的治疗而使患者体内BDNF水平渐渐接近正常水平。此外，笔者通过构建TBI大鼠模型，研究显示，TBI大鼠脑组织中BDNF含量先升高后迅速降低且显著低于正常水平，这可能是因为TBI大鼠后会立即激活组织中BDNF的保护应激作用，但随着TBI时间的增加，大鼠体内BDNF无法对抗外界损伤，因此出现TBI的各种临床特征。随后，笔者加入神经细胞N2A、SY5Y及外源性BDNF进行进一步研究，结果显示，BDNF可促进神经细胞增殖，抑制细胞凋亡，表明BDNF在维持神经细胞活性方面发挥着关键性作用，同刘丽敏等[10]研究结果类似。

miRNA的表达具有组织特异性和细胞特异性。Chen等[11]研究结果显示，miRNA特异性表达于哺乳动物的中枢神经系统(脑和脊髓)中，对其神经系统的发育及功能发挥的过程中起着非常重要的作用。本研究显示，miR-195在TBI患者及大鼠中其含量显著高于正常水平，提示其对TBI具有一定程度的促进作用。Hu等[12]通过建立大鼠脑皮质创伤研究模型，发现大鼠海马组织中miRNA在TBI后24 h与7 d时具有明显的动态变化，其中伤后24 h有20个miRNA表达明显上调，23个下调；伤后7 d有9个表达明显上调，16个下调。上述研究均显示miRNA作为潜在分子标记物来评估TBI的可能性。本研究在TBI大鼠神经细胞N2A和SY5Y中过表达miR-195，发现miR-195可抑制神经细胞N2A和SY5Y增殖，从而促进细胞凋亡。此外，本研究通过BDNF/miR-195对TBI大鼠后神经功能的影响显示，BDNF可显著改善大鼠TBI后的神经功能，但加入miR-195后BDNF对神经功能的改善作用受到显著抑制，表明BDNF通过下调miR-195促进神经细胞增殖，抑制凋亡，并改善神经功能。

总之，通过BDNF/miR-195对患者和大鼠在TBI中的作用研究，为TBI的治疗提供了新的靶点，但将其应用到临床实验前还需要进一步探讨。

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[10] 刘丽敏，黄海霞，高建新. BDNF和NT-3对胚胎大鼠脊髓神经元生长发育的影响[J]. 首都医科大学学报, 2002, 23(3): 202-205. DOI:10.3969/j.issn.1006-7795.2002.03.002.

[11] Chen J, Li Y, Wang L, et al. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats[J]. Stroke, 2001, 32(4): 1005-1011. DOI:10.1161/01.str.32.4.1005.

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