0 引 言

主要由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病(Fusarium head blight，FHB)是世界性的流行病害，已经严重影响小麦品质，并且导致产量下降，危害人畜安全[1-2]。多年来，小麦赤霉病主要通过化学农药防治，但化学农药的大量使用导致病原菌抗药性菌株的出现，使防治难度加大，同时对人体健康有一定的伤害，对生态系统也会产生极大的破坏，土壤中有益微生物的种类和数量也会受到影响，因此，对小麦赤霉病进行生物防治尤为重要。生物防治的作用机制主要有竞争作用、抗生作用、诱导寄主产生抗病性和通过增加无机营养的溶解度促进寄主植物的生长发育来抵抗病菌的侵染[3]。芽孢杆菌AS43.3和AS43.4能使小麦赤霉病病情减轻7%和93%，另外，王雅平等[4]报道的分离自丝瓜根部的土壤微生物枯草芽抱杆菌TG26对小麦赤霉病的田间小区试验防效为76.4 %，并具有明显的增产效益。因此，利用有益微生物特别是芽孢杆菌对小麦赤霉病进行生物防治，已经取得一些成果，但距离商业化规模生产还存在一定距离。虽然目前芽孢杆菌和假单孢杆菌被陈然等[5]报道为在小麦赤霉病生物防治应用中最为广泛的菌株，但生物防治的关键是在田间条件下发挥防治作用，因此，本文将报道一株来自大庆湿地的拮抗性芽孢杆菌Zl-2所产的抗菌蛋白性质及其对小麦赤霉病菌的抑制作用，以期为小麦赤霉病的生物防治及生防菌剂的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

枯草芽孢杆菌菌株Zl-2由本实验室分离保存，供试靶标菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)由黑龙江八一农垦大学农学院植物病理研究室提供。

综上所述，虽然经典作家对时代有不同分法，但他们判断时代的标准具有内在统一性，也就是统一于社会基本矛盾运动。只是由于语境不同，理论斗争的需要不同，所以采用了不同的历史尺度。

1.2 培养基

枯草芽孢杆菌菌株Zl-2用Luria-Bertani (LB)培养基，靶标菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。发酵培养基：葡萄糖3%，可溶性淀粉1%，酵母浸粉1.5%，NaCl 0.5%，K2HPO4 0.1%，初始pH值7.5。

1.3 方法

1.3.1 Zl-2菌株发酵液的制备

1.3.3 Zl-2蛋白浓度测定

1.3.2 Zl-2抗菌蛋白的制备

紫外稳定性：取5 mL Zl-2抗菌蛋白溶液，置于20 W紫外线灯下(距离30 cm) 照射6 h，每间隔1 h取样1次，以未经紫外照射的做为对照，测定处理后的抗菌蛋白溶液对禾谷镰刀菌的抑菌作用，测定方法同上。

将Zl-2生防细菌接种于培养基上培养，待菌株生长OD600 nm>1.0时，按3%的接种量接入发酵培养基中培养，初始pH值7.5，装液量50 mL/250 mL，转速为160 r·min-1，28 ℃培养96 h，12 000 r·min-1、4 ℃离心10 min除去菌体，再用0.22 μm无菌滤膜过滤，收集发酵液备用。

依据汪家政等[7]于2001年采用的Bradford法，以牛血清白蛋白(BSA)作为标准OD280 nm进行Zl-2蛋白浓度的测定。

1.3.4 Zl-2抗菌蛋白稳定性测定

热稳定性：将制备的Zl-2抗菌蛋白于不同温度(30 ℃、60 ℃、90 ℃、121 ℃)下处理30 min，以室温的Zl-2抗菌蛋白作为对照，冷却后，以靶标菌禾谷镰刀菌作为指示菌，采用混菌法[8]游标卡尺十字交叉测定其不同温度处理后的抑菌圈直径。具体实验方法如下：将禾谷镰刀菌接种于PDA斜面上至其产生孢子后，用1 mL无菌水将孢子洗下，然后用血球计数板在显微镜下观察孢子数量，使其在105～106个·mL-1，取200 μL稀释好的孢子悬浮液，与温度适宜的PDA液体培养基混匀，待其凝固后轻轻摆放牛津杯，并在其中加入200 μL待测的Zl-2抗菌蛋白样品，25 ℃培养4 d，十字交叉法测定抑菌圈直径[9]，每个实验重复3次，抑菌结果为3次实验平均值。

pH 稳定性：参照王艳红等[10]方法进行测试。

采用相对饱和度为20%、40%、60%和100%的硫酸铵对ZL-2菌株发酵液沉淀获得粗蛋白，然后装入透析袋(8 000～14 000)中，4 ℃透析脱盐并收集内透液，用PEG 4000 包埋透析袋并浓缩，待透析袋内抗菌蛋白溶液剩下大约1 mL时立刻停止，对每一级沉淀下来的沉淀和上清液采用杯碟法[6]进行抗菌活性检测，具体操作如下：将靶标菌禾谷镰刀菌培养至产生孢子后，用无菌水将其洗下，稀释后均匀涂布于PDA固体平板，然后将牛津杯轻放上面，将上述的沉淀和上清液分别吸取200 μL于25 ℃恒温培养箱内使其扩散，观察并测量抑菌圈直径，每个试验重复3次，抑菌结果为3次试验平均值，最终确定制备Zl-2抗菌蛋白所需硫酸铵的相对饱和度，然后将在最佳饱和度下提取的抗菌蛋白进行SDS-PAGE电泳检测。

“陪”学生作检讨事件结束后，整个班级的风气焕然一新，每个人的担当意识被充分调动起来，责任感明显增强，整个班级沿着预定的轨道稳步运行。尤其是刺头小李，慢慢变成一个关心集体、积极参与班级事务的班委成员。

蛋白酶稳定性：参照王艳红等[10]和申光辉等[11]方法进行蛋白酶稳定性实验，以未经蛋白酶处理的样品作为对照，具体方法同上。

那你想要什么？孙东西，你知道吗？为了你这个位置，我东挪西借花了整整6万块钱，差点连身子都赔进去了。颖春大声嚎了起来。

1.3.5 Zl-2抗菌蛋白对禾谷镰刀菌菌丝形态的作用

1.3.6 Zl-2抗菌蛋白对禾谷镰刀菌孢子萌发的影响

用10 mL无菌水洗下培养10 d的禾谷镰刀菌孢子，4层纱布过滤，10 000 r·min-1离心5 min，然后使孢子浓度为105～106 个·mL-1。将Zl-2抑菌蛋白溶液加入孢子悬浮液中，25 ℃恒温培养，不同时间观察孢子萌发情况，每处理在低倍镜下检查约100个孢子，计算孢子萌发率，用未经Zl-2抗菌蛋白处理的孢子作为对照，每处理重复3次，公式如下。

胡琏点燃香火，祭拜完皇天厚土和列祖列宗。然后转身面向全师将士，举起右拳庄严宣誓：“陆军第十一师师长胡琏谨以至诚昭告山川神灵，我今率堂堂之师保卫我祖宗艰苦经营、遗留吾人之土地，名正言顺，鬼伏神钦，决心至坚，誓死不渝！汉贼不两立，古有明训；华夷须严辨，春秋存义。生为军人，死为军魂！后人视今，亦尤今人之视昔。吾何惴焉！今贼来犯，决予痛歼力尽，以身殉之。然吾坚信，苍苍者天，必佑忠诚。吾人于血战之际，胜利即在握，此誓！”

其次，还应该对中国近现代史基本问题研究与历史学科中中国近现代史研究之间的关系问题进行明确。虽然这两者所研究的均是中国近现代史，虽然两者之间的研究内容的重心有差异，但两者之间也存在紧密的关联性与交融性，中国近现代史基本问题重点研究的内容是在 “基本问题”上，而中国近现代史研究的重点是在“历史事件、历程”上，但二者是相互联系的，对基本问题的研究离不开历史发展历程与相应的历史事件，其是对基本问题进行研究的基础与依据，这也就说明两者之间是无法独立存在的。面对这一现象就应该加强两者之间的学术交流，使历史的经验、规律以及教训可以应用到现代社会发展的过程中。

按照赵龙飞等[12]应用的对峙法，观察Zl-2抗菌蛋白对禾谷镰刀菌菌丝生长的作用，每个实验重复3次，抑菌结果为3次实验平均值。

2.3 高通量测序的结果 对患儿的外周血DNA进行高通量测序，发现患儿WDR62基因存在2个杂合突变，c.1128C>A(C376*，rs377726144)和c.3620_3621delAG(Q1207Rfs*29)。前者位于第9号外显子，为无义突变，使第376位半胱氨酸密码子TGC突变为终止密码子TGA；后者位于第30号外显子，为缺失移码突变，它们均导致编码的肽链提前终止。

孢子萌发率

限制性喷嘴在压力增加过程到某一临界范围后，气体速度随着气体压力的变化显得不明显。由此相关研究人员通过对限制型喷嘴的结构改进，这就是目前使用最为广泛的紧耦合雾化法。原理是缩短喷嘴出气口和液流间的距离，合理利用气体动能达到高效破碎目的。依据是增加气体动能的传输效率。紧耦合雾化法由于气体动能传输效率高，可以将熔体直接雾化成熔滴，其熔体冷却速度≥105K/s，粉末平均粒度≤50μm。[13]该技术最早实际生产应用在英国PSI公司。

2 结果与分析

2.1 Zl-2抗菌蛋白的制备

将Zl-2生防细菌的发酵液离心后，上清液采用相对饱和度为20%、40%、60%和100%的硫酸铵沉淀获得粗蛋白，分级沉淀，透析脱盐，检测其对禾谷镰刀菌的抑菌活性(见图1)。结果发现相对饱和度为40%的沉淀物中抑菌活性最大，其次是饱和度为60%的，因此，采用相对饱和度为40%硫酸铵沉淀抗菌蛋白,将此浓度下制备的抗菌蛋白进行SDS-PAGE实验(见图2)，发现Zl-2所产抗菌蛋白为混合物，且蛋白的分子量大小主要在26～34 kDa。

  

图1 不同硫酸铵饱和度抑菌结果

 

Fig.1 Inhibitory results with different ammonium sulfate

 

 

图2 以相对饱和度为40%的硫酸铵处理的Zl-2抗菌蛋白的SDS-PAGE检测

 

Fig.2 SDS-PAGE results of Zl-2 antifungal proteintreated by 40% ammonium sulfate

2.2 Zl-2抗菌蛋白的浓度测定

用牛血清白蛋白(BSA)作为标准进行蛋白浓度测定，用0.02 mol·L-1 pH 8.0的Tris-HCl溶液将冷冻储存的抗菌蛋白溶解后，配制成浓度为20.0 mg·mL-1的蛋白母液，备用。

2.3 Zl-2抗菌蛋白稳定性测定

对抗菌蛋白的稳定性进行测试，结果如图3、图4和表1所示。30 ℃、60 ℃、90 ℃水浴30 min后抑菌活性基本没有变化，表明该抗菌蛋白具有较好的热稳定性，121 ℃处理后抑菌活性明显下降，因为过高的温度会破坏蛋白的活性；酸碱稳定性测试结果表明，过酸、过碱都对其活性产生影响，原因是影响了蛋白的构象，使其变性失活(见图4)。紫外稳定性测试表明，该抗菌蛋白对紫外线有很强的抗性(见表1)；酶的稳定性实验表明，经胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K处理后的抗菌蛋白，其抑菌活性受到影响，可能是由于发生了降解作用(见图5)。

  

图3 不同温度处理Zl-2抗菌蛋白对禾谷镰刀菌的抑菌活性

 

Fig.3 Activities of Zl-2 antifungal protein treated with differenttemperatures against the Fusarium graminearum

 

 

图4 酸碱处理Zl-2抗菌蛋白对禾谷镰刀菌的抑菌活性

 

Fig.4 Effect of different pH on the Zl-2 antifungalprotein against the Fusarium graminearum

 

表1 紫外照射处理Zl-2抗菌蛋白对禾谷镰刀菌的抑菌活性

 

Table 1 Inhibitory effects of the Zl-2 antifungal protein against the Fusarium graminearum by UV

  

处理时间 / h123456对照抑菌直径 / mm20.85±0.0520.85±0.0620.83±0.0520.83±0.0420.83±0.0520.80±0.0520.85±0.05

  

图5 Zl-2抗菌蛋白对蛋白酶的稳定性Fig.5 Stability of Zl-2 antifungal protein on proteases

2.4 Zl-2抗菌蛋白对禾谷镰刀菌菌丝形态的影响

用Zl-2抗菌蛋白对禾谷镰刀菌菌丝进行处理，并利用光学显微镜观察，结果如图6所示。由图6可知，未经Zl-2抗菌蛋白处理的菌丝粗细比较均匀，而经Zl-2抗菌蛋白处理后，菌丝呈现畸形，并且局部膨大，变得粗细不均，因此，该抗菌蛋白对禾谷镰刀菌的菌丝生长起到抑制作用。

 

  

图6 Zl-2抗菌蛋白对禾谷镰刀菌菌丝形态的影响:(a)处理前；(b)处理后

 

Fig.6 Effect of Zl-2 antifungal protein on the hyphal morphology of Fusarium graminearum：(a) pretreatment; (b) after treatment

2.5 Zl-2抗菌蛋白对禾谷镰刀菌孢子萌发的影响

将Zl-2抗菌蛋白母液稀释成不同质量浓度，对禾谷镰刀菌的孢子萌发进行实验。结果表明，Zl-2抗菌蛋白能显著抑制禾谷镰刀菌孢子的萌发，随着抗菌蛋白质量浓度的增加，其孢子的萌发率随之降低(见图7)。表2显示，当质量浓度为500 mg·L-1时，孢子萌发率仅为0.5%；当质量浓度为31.25 mg·L-1时，其萌发率约40.2%，说明该抗菌蛋白具有较好的抑制禾谷镰刀菌孢子萌发的作用。

  

  

 

图7 不同浓度Zl-2抗菌蛋白对禾谷镰刀菌孢子萌发的影响: (a) 500 mg·L-1；(b) 250 mg·L-1; (c) 125 mg·L-1; (d) 62.5 mg·L-1; (e) 31.25 mg·L-1

 

Fig.7 Effect of different concentrations of Zl-2 antifungal protein on the spore germination of Fusarium graminearum:(a) 500 mg·L-1； (b) 250 mg·L-1; (c) 125 mg·L-1; (d) 62.5 mg·L-1; (e) 31.25 mg·L-1

 

表2 Zl-2抗菌蛋白对禾谷镰刀菌孢子萌发的影响

 

Table 2 Inhibitory effects of Zl-2 antifungal protein against the spore germination rate of Fusarium graminearum

  

质量浓度 / (mg·L-1)50025012562.531.25萌发率 / %0.5±0.057.4±0.1013.2±0.3026.8±0.3040.2±0.50

3 讨 论

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种在自然界中广泛存在且对人畜无毒无害、不污染环境、能产生多种抗菌素的细菌[13],国内外均有应用枯草芽孢杆菌进行生物防治的实例。Chen 等[14]于2013年用枯草芽孢杆菌防治马铃薯枯萎病；国内许多枯草芽孢杆菌商品制剂已开发成功并投入生产，如百抗、麦丰宁、根腐消等[9]。叶华智等[15]应用拮抗芽孢杆菌B4、B6菌株对小麦赤霉病进行生物防治研究，发现这两株菌的作用机制主要是通过产生抗生次级代谢产物抑制病原菌的孢子萌发和菌丝生长；周苗苗等[16]应用拮抗内生菌进行了小麦赤霉病小区生防实验，结果发现可降低其发病程度。目前，对于枯草芽孢杆菌产抗菌物质的研究已有相关报道。周盈等[17采用饱和度为30%的硫酸铵对分离自魔芋的内生菌枯草芽孢杆菌进行蛋白提取，获得单一的蛋白条带，该蛋白分子量大小约31.6 KDa，但该蛋白对温度敏感，仅能耐受50 ℃，并且蛋白酶K破坏其活性，而胰蛋白酶对其活性没有影响；2009年，黄丽丽等[18]通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析及离子交换层析等方法从枯草芽孢杆菌E1R-j发酵液中分离并纯化得到分子量为约51.9 KDa的抗菌蛋白；2015年，黄娜等[19]报道的枯草芽孢杆菌孢外抗菌蛋白含有两种蛋白，可以使菌丝发生断裂、扭曲、畸形、肿大，但是哪种蛋白具有抑菌作用仍然未知，本研究亦是如此。虽然枯草芽孢杆菌菌株Zl-2对小麦赤霉病病菌有一定的抑制作用，但目前还不能确定是否可以直接应用于田间，因为田间是一个复杂的生态系统，有很多影响因素，因此，接下来的工作将是如何将Zl-2研制开发成能应用于田间的生物农药，为小麦赤霉病的生物防治提供物质基础。

4 结 论

来自大庆湿地的枯草芽孢杆菌菌株Zl-2所产的抗菌蛋白经40%硫酸铵沉淀后，获得粗蛋白混合物。其稳定性较好，即具有耐酸碱、耐紫外照射特性，但对高温(121 ℃)、蛋白酶敏感，而且该抗菌蛋白具有很强的抗菌作用，可抑制孢子萌发，使禾谷镰刀菌菌丝生长呈现畸形、粗细不均、底部膨大等。因此，本研究为枯草芽孢杆菌菌株Zl-2的进一步开发应用奠定了理论基础。

参考文献

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