胎衣不下是一种常见且危害巨大的产后疾病，分娩后的奶牛胎衣正常排出时间为8～12 h，当胎衣在上述时间段内没有正常排出时，这种情况称为胎衣不下[1]。其原因是由于胎儿胎盘上的绒毛没有成功从母体肉阜的隐窝中脱离下来。胎衣不下常发生于高产奶牛，已被证实对奶牛的产奶量有一定影响[2]。全世界范围内，胎衣不下的发病率在1.3%～39.2%之间，并且导致胎衣不下的发病因素包括：妊娠期长短，遗传，难产，年龄，小产及气候条件[3-6]。虽然我们已经了解很多关于胎衣不下病因学的知识，但是有关胎衣不下病因学知识还是存在缺口。

RhoA属于小G蛋白家族中的Rho家族，小G蛋白家族包括Rho、Rac1与Cdc42。Rho家族蛋白是调控某些细胞功能的关键，包括细胞骨架、细胞粘附作用以及收缩作用[7]。他们之中，RhoA在平滑肌细胞中高度表达并且在平滑肌的收缩过程中非常重要。Rho是一种丝氨酸蛋白酶，被认为是一种RhoA效应器。Rho在N-端有一个激酶结构域，在其中段有一个卷曲结构域，一个预测普列克底物蛋白同源结构域在其C-端。Rho的结合区域位于卷曲结构域的C端部分，RhoA的激活能够增强Rho的活性。平滑肌收缩的主体结构是由Rho激酶对MLCP（肌球蛋白轻链磷酸酯酶）的抑制来介导的。MLCP对MLC有脱磷酸化作用，Rho能够不依赖钙离子来激活MLCK与MLC在Ser19位点磷酸化，Rho在机体内能够使MLCP激活接触MLCP对MLC与MLCK磷酸化的抑制[8-10]。而MLC与MLCK的活性与机体平滑肌的收缩具有极大的关联性。分娩过程中，子宫肉阜上分布的血管平滑肌收缩，会导致肉阜组织上的隐窝舒张使胎儿胎盘上的绒毛从中脱离，胎儿胎盘从母体上分离然后经子宫的挤压胎衣排出。

因此，实验通过检测奶牛胎衣不下肉阜组织中的RhoA及Rho的mRNA表达量变化，来探讨两者与胎衣不下的研究，为胎衣不下的病因学研究提供更多的理论依据。

1　材料和方法

1.1　实验试剂

DEPC（sigma），液氮，琼脂糖（Bio-West），GenE－luteTMMammalian Total RNA Miniprep Kit sufficient for 10 purifications（Sigma），PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara），SYBR R○Fast qPCR Mix（Takara），DL1000 DNA Marker（TaKaRa），6×Loading Buffer（博凌科为），氯仿、异丙醇等试剂均购于上海生工公司，引物于上海生工合成。

1.2　胎盘组织的采集与总RNA的提取

实验将北安市的某一集约化奶牛场作为选取的采样地点，排除奶牛的双胎、难产、流产等因素，选取年龄25～50月龄、胎次1～2次、泌乳量相近的健康自然分娩奶牛12头。其中胎衣不下奶牛（产后12 h后胎衣还未排出）有6头作为实验组（RFM），胎衣正常排出奶牛有6头作为对照组（NFM），在奶牛产后12 h用子宫内膜取样器采集部分奶牛胎盘。采集后的胎盘须尽快用生理盐水频繁冲洗直至冲掉血污，将样品放入无菌冻存管中并标记牛号日期，最后将样品送入液氮罐中保存，待回到实验室迅速转移至-80℃冰箱保存。提取RNA时将样品在液氮中研磨成粉末状，然后根据总RNA提取试剂盒的说明书来提取样品中的总RNA。提取后的RNA用琼脂糖凝胶电泳检测其质量并检测其OD值及浓度。

1.3　Real Time Q-PCR

实验所用引物通过Primer 5设计实验所用引物，β-actin用作内参，具体引物序列见表1。反转录操作过程参考PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）的说明书，95 ℃ 30 s，94 ℃ 20 sec，60 ℃ 20 sec，72 ℃ 25 sec，72 ℃ 5 min，40个循环。然后采用 2（-Delta Delta C（T））方法对结果进行分析。

 

表1　β-actin和Rho、RhoA荧光定量PCR引物序列Table 1　Sequences（5’to3’）of the primers used in the quantitative real-time PCR

  

基因β-actin Rho RhoA引物种类及序列（5’→3’）F：GTC ATC ACC ATC GGC AAT GAG R：GCT AAC AGT CCG CCT AGAA GCA F：GGAGTGGAGAATGGACTGGA R：AAACAAAAGCGTGGGAAATC F：CAAAAACCTCCCTCACTCCA R：GAGCCAGTAAAACCCGAAGA

2　结果

2.1　总RNA提取结果

1.2.1 教学方法。传统教学组：由教员选用合适的培训教材（包括网络课程、视频教学课程等），备课，授课，学生听课，3～5次课/周，从健康管理的起源、发展，管理人群的地域性、生活方式的综合健康分析与风险评估，健康教育与促进，健康保险、慢性病的健康管理全面系统介绍健康管理的内容，并跟踪国内外健康管理前沿信息，引导学生建立健康管理的理念。

经SPSS19.0分析实时荧光定量PCR结果显示胎衣不下奶牛母体胎盘组织样品中Rho、RhoA的mRNA表达量显著（P＜0.05）下调。

实验采用Trizol手提法来提取样品中的总RNA，图2中的RNA琼脂糖凝胶电泳图中，28S、18S条带显示出的亮度均高于5S，并且这三条带的完整性非常高且无拖尾现象，说明实验中提取的总RNA无杂质、无污染、无降解。实验中对RNA浓度的检测结果见表2，该数据也表明总RNA可用于下一步实验。

 

表2　组织样品总RNA浓度及OD值Table 2　The concentration and OD of RNA in tissues

  

N1 N2 N3 R1 R2 R3 1.89 1.96 2.10 1.82 1.93 1.89 406 388 397 414 347 372

  

图1　总RNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.1　The result of agaroseg elelectrophoresis of total RNA

2.2　Q-PCR结果

把牛皮糖送进屋，钱镇长孙村长两个调转车头准备走，只听得膨的一声，一个东西砸在车门上。村长下来看时，是只猪的脚。那只猪脚好像走累了，靠着轮胎歇在那里。紧接着下雨一般，米、油、烟、酒，他们刚送进去的一样不少，全部被扔了出来，不是扔是砸。村长跳起脚大骂：牛皮筋，你是个什么东西！

  

图2　实验组与对照组子宫肉阜中RhoA基因的mRNA表达水平Fig.2　Relative expression of the RhoA in the control and RFM groups

  

图3　实验组与对照组子宫肉阜中RhoA基因的mRNA表达水平Fig.3　Relative expression of the Rho in the control and RFM groups

3　讨论

在平滑肌中，RhoA与Rho通过抑制MLC磷酸酶与MLC的脱磷酸化来调控收缩蛋白对钙离子的敏感性，Rho的增加是子宫肉阜上血管平滑肌收缩加强时的一个基本条件[11-13]。奶牛分娩时Rho的表达量降低会导致母体胎盘上的血管收缩无力，胎盘中血液并无减少，胎盘处于一种饱满状态，空隙的空间不足以让两胎盘连接处分离，加大奶牛患胎衣不下的风险。

王建勇等人检测了胎衣不下奶牛与胎衣正常排出母体胎盘中的血管紧张素Ⅱ，其结果显示胎衣不下中胎盘中的血管紧张素Ⅱ较正常排出组偏低[14]。说明胎衣不下发生时奶牛母体胎盘中血管平滑肌的调节机制与胎衣不下的发生有一定联系。在平滑肌的磷酸化过程中Rho能够激活MLCK的活性，并且有可能直接对MLC起到磷酸化作用。有学者曾经提出，Rho可能会对磷酸化的MLC的空间结构有调整作用，Rho在MLC在细胞中心的磷酸化中起到重要作用。在检测胎衣不下组织中的Rho的表达量结果中，胎衣不下奶牛胎盘组织Rho含量显著低于对照组样品中Rho的含量[15-16]。提示Rho参与胎衣不下的发生，Rho的表达量降低意味着MLC的磷酸化水平降低，会导致平滑肌的舒张。有研究表明能购降低MLCK的活性的环腺苷酸能够由NO激活，同时有研究表明胎衣不下奶牛胎盘的NO含量高于正常排出胎衣的奶牛[17-19]。胎衣不下的发生中，NO可能会抑制Rho的活性，Rho的低表达量可能会造成MLCK的活性降低，导致母体胎盘血管平滑肌收缩减弱，胎儿子叶不能顺利与母体胎盘的腺窝中分离。RhoA在MLC的磷酸化过程中对Rho起到激活的作用，实验的RhoA在胎衣正常排出组mRNA表达量高于胎衣不下组，可以从这样的结果推测出RhoA的含量高就会增加Rho被激活的概率，MLC的磷酸化水平自然随之增高，子宫肉阜上的血管收缩将肉阜内的血液挤压出，肉阜空隙开放，绒毛纤维轻易脱离下来胎衣正常排出。Fu-Qing Sun等人在雌激素与Rho蛋白间的关系的研究中证实，平滑肌细胞中加入雌二醇能够上调Rho及其下游蛋白的表达，说明雌二醇能够调节平滑肌的收缩[20]。而在胎衣不下领域的研究中，周帮会等人对胎衣不下及胎衣正常排出奶牛肉阜中的雌二醇进行了检测，结果显示胎衣不下奶牛子宫肉阜中的雌二醇含量显著低于12 h内排出胎盘的奶牛[21]。由以上内容推断胎衣不下组雌二醇的含量降低，胎衣不下组Rho的含量就会随之降低这与我们的实验结果相一致。

根据钻孔资料，中间竖井所处地下水位高出隧洞底部约30 m，勘探深度内地层主要以粉质黏土层为主，部分埋深为卵石层，盾构隧道位于粉质粘土层中。根据降水设计原则，本次计算以K49+818为中心，总长度20 m范围内的隧道为计算单元，根据形状面积、隧道深度和降水需求，确定降水井相关参数。

综上所述，RhoA及Rho表达量下调与胎衣不下有统计学联系，是否在其发生中起作用还是和其他分子一起起作用有待于进一步研究。

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