冠脉旁路移植术是治疗冠心病的主要方法之一,而移植后桥血管狭窄是冠脉旁路移植术后的并发症之一。许多研究证实，血管平滑肌细胞异常增生在心血管疾病中起着关键作用，例如冠状动脉粥样硬化和冠脉旁路血管移植术后桥血管再狭窄[1-3]。血管平滑肌细胞在损伤和其他刺激反应下，可以导致细胞增殖和迁移增加，这是冠脉旁路血管移植术后桥血管再狭窄的主要发病机制[4]。然而，冠脉旁路移植术后桥血管再狭窄的分子机制还不完全清楚。因此，了解血管平滑肌增殖和迁移的分子机制对预防和治疗支架内再狭窄有重要的意义。蛋白磷酸酶(PHLPP)基因参与了肿瘤生长的负性调节[5]，但是PHLPP基因在血管平滑肌中的作用还没有被研究。本文对PHLPP基因在大鼠血管平滑肌细胞中的作用进行研究，探讨其对血管平滑肌细胞增殖和迁移能力的影响。

1 资料与方法

1.1 实验材料及条件 SD大鼠购自郑州大学动物实验中心；PHLPP腺病毒购自武汉汉恒生物技术公司，PHLPP，PCNA，MMP2及β-action均单克隆抗体购自武汉三鹰公司；Total RNA提取试剂盒购自北京奥维亚生物技术公司。质粒pcDNA3.0/PHLPP，pcDNA3.0载体及转染试剂均购自武汉谷歌生物技术公司。EDU试剂盒购自广东博锐公司。全部实验在郑州大学第一附属医院重点实验室完成。

1.2 动物实验 研究组大鼠鼠尾静脉给予PHLPP腺病毒，对照组大鼠鼠尾给予空载病毒。用10%水合氯醛按6 mL/kg腹腔注射麻醉，暴露颈动脉后结扎颈内动脉，用显微剪剪开颈外动脉，插入2.0F动脉球囊，充气后反复牵拉10次，拔出球囊后结扎颈外动脉，解开颈内动脉结扎线，缝合伤口。假手术组暴露颈动脉后即缝合皮肤。2周后解剖取出颈动脉，多聚甲醛固定用石蜡包埋固定后切片。

1.3 细胞培养 使用组织粘附方法从6周龄Sprague-Dawley雄性大鼠的主动脉中提取大鼠血管平滑肌细胞。 切断血管，剥离脂肪、结缔组织和纤维膜。 然后将组织切成小块，在37 ℃下在加湿的5%CO2气氛中将补充有10%胎牛血清(FBS)的DMEM-F12过夜转移到细胞培养瓶中。 使用第3代和第6代之间细胞用于实验。

1.4 检测方法

定义3： 特征项t权值用Qt表示。设特征项为专业词汇且为名词，赋予其权重为QZ；特征项为方言词汇且为名词，赋予其权重为Qf。特征项为常用词汇且为名词，特征项为专业词汇、方言词汇的非名词词性，赋予其权重为Qc； 特征项为常用词汇的非名词，赋予其权重为Qo利用定义3，本文词汇termk的TF-IDF计算方法为

1.4.1 颈动脉血管病理切片 颈动脉切片行苏木精-伊红(HE)染色，置于显微镜下拍照，观察动脉内膜增生面积。

2.3 EDU实验检测细胞增殖能力 通过EDU实验检测细胞24 h增殖数量(蓝色为细胞核，桔红色为新增细胞，见图2)，结果显示，24 h后研究组细胞增殖数量较对照组明显减少。对照组24 h细胞增殖量为(123±7.6)，研究组24 h细胞增殖量为(45±4.2)，两组增殖差异有统计学意义(P<0.05)。提示PHLPP可以显著抑制细胞的增殖。

1.5 统计学分析 研究组与对照组分别进行3次独立实验，结果取3次平均值。采用SPSS21.0统计软件，整理相关研究数据。定量资料以均数±标准差表示，采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

1.4.4 细胞迁移能力 采用划痕实验对细胞迁移能力进行检测。将转染24 h后的细胞接种于6孔板中，每孔加入40 000个细胞。低血清培养24 h后用200 μl枪头在细胞培养板内划一道均匀的横线，PBS冲洗后置于显微镜下照相。正常血清培养24 h后再在同一位置照相，根据划痕面积计算细胞迁移能力。

1.4.3 细胞增殖能力 采用EDU实验对细胞增殖能力进行检测。将转染24 h后的细胞接种于96孔板中，每孔加入4 000个细胞，待细胞贴壁后按照EDU试剂盒说明书进行操作。操作完成后置于荧光显微镜下观察并照相，计算细胞增殖量。

2 结果

2.2 Western blot检测蛋白表达水平 研究组和对照组分别转染质粒后，研究组的PHLPP表达水平明显高于对照组，PCNA和MMP2表达水平明显低于对照组(P<0.05，见表1)。说明转染PHLPP质粒后PHLPP明显过表达，代表增殖的PCNA基因表达和代表迁移的MPP2基因表达明显下降。

情况 4.4 若f3(v)=3,此时最坏的情况是v点关联3个6-面,3个3-面,且3-面的邻面均为6-面。由R1和最坏3-面6-点情形得

采用SPSS 21.0统计学软件对数据进行处理，计数资料以百分数（%）表示，采用x2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

  

图1 研究组、对照组及假手术组颈动脉切片HE染色情况

2.1 颈动脉病理切片 研究组和对照组较假手术组均有明显的增生，而给予PHLPP腺病毒研究组的血管增生面积较对照组显著减少(见图 1)。说明PHLPP可以抑制血管损伤后的增殖和狭窄。

 

表1 Western blot检测各组蛋白表达量

  

蛋白对照组研究组PHLPP0.21±0.011.36±0.03*PCNA2.32±0.010.89±0.02*MMP21.38±0.020.36±0.04*

注：研究组与对照组相比，*P<0.05

1.4.2 蛋白表达水平检测 分别将质粒pcDNA3.0/PHLPP和pcDNA3.0/空载转染至大鼠平滑肌原代细胞。转染48 h后提取2组血管平滑肌细胞总蛋白，测定浓度后取各40微克加入缓冲液，电泳后转至PVDF膜，室温下5%牛奶封闭2 h，特异性一抗4 ℃过夜，TBST洗脱后用二抗封闭2 h。采用ECL化学发光显影，依据显影灰度定量检测相关蛋白水平。

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2.4 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 通过细胞划痕实验检测细胞迁移能力，结果显示，研究组的细胞迁移愈合面积为(0.25±0.2)，显著小于对照组愈合面积(0.86±0.3)，差异有统计学意义(P<0.05)。结果提示PHLPP可以抑制细胞的迁移。

  

图2 EDU实验检测各组细胞24h增殖量

3 讨论

冠脉旁路移植术是治疗冠心病的主要方法之一，而移植后桥血管再狭窄或者闭塞限制了冠脉移植术的应用和发展[6]。 冠脉旁路移植术后，血管平滑肌细胞在损伤和其他刺激作用下，增加细胞增殖蛋白的表达，进而刺激细胞增殖，这是冠脉旁路移植术后桥血管再狭窄的主要发病机制[4]。PHLPP蛋白为蛋白磷酸酶，可以特异性脱磷酸化丝氨酸蛋白激酶(Akt)，从而抑制其促细胞生长的作用[7]。近年来的相关研究显示[8]，PHLPP除了抑制肿瘤细胞生长外，还可以抑制胰岛素的敏感性。而PHLPP在心血管疾病中的作用还未被研究，本研究首次证明了PHLPP在心血管疾病中的作用。

本研究通过颈动脉损伤动物模型模拟了冠脉移植术后引起的血管损伤，结果显示，PHLPP基因可以显著地抑制由于血管损伤引起的血管增殖和狭窄。更进一步的细胞实验也验证了PHLPP基因表达水平对调节血管平滑肌细胞增殖和迁移能力有一定的作用。

增殖细胞核抗原(PCNA)是细胞增殖的关键基因，大多数细胞增殖是通过PCNA基因的表达实现的[9]。而基质金属蛋白酶2(MMP2)则是细胞侵袭和迁移的主要标志蛋白[10]，在心肌缺血再灌注和心肌重构中起着非常重要的作用[11]。过表达PHLPP的同时，发现PCNA和MMP2蛋白的表达下降，暗示了PHLPP的表达与PCNA和MMP2的表达呈负相关。通过EDU实验和划痕实验进一步证实了PHLPP的过表达抑制了细胞的增殖和迁移，而其作用机制可能是通过抑制PCNA和MMP2的表达能力而达到上述作用的。然而PHLPP作为抑癌基因在体内作用广泛，能否将PHLPP基因作为调控血管平滑肌细胞增殖的靶基因还需进一步研究。

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4 参考文献

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[2] 陈洁,熊国祚.血管平滑肌细胞凋亡在血管再狭窄中作用的研究进展[J].临床与病理杂志,2014,34(1):65-70.

[3] Jiang Z, Yu P, Tao M, Fernandez C, Ifantides C, Moloye O, Schultz GS, Ozaki CK, Berceli SA: TGF-beta- and CTGF-mediated fibroblast recruitment influences early outward vein graft remodeling [J]. American journal of physiology Heart and circulatory physiology 2007;293:H482-488.

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[5] 衣素琴,庄园,国风.PHLPP1与肿瘤的关系及研究进展[J/CD]. 中华临床医师杂志:电子版,2013,7(5):2167-2170.

[6] 王承,李若谷,方唯一.冠状动脉旁路移植术后桥血管再狭窄治疗进展[J].心血管病学进展,2008,29(2):238-240.

[7] 闫朝奇,张丽君,高峰,等.PI3K/Akt/mTOR通路抑制剂对白血病细胞株增殖及其PHLPP表达的影响[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2012, 19(4):369-373.

[8] 吴兴利,刘文静,杨丁友,等.胰岛素样生长因子-1对血管平滑肌细胞磷酸酶PHLPP蛋白表达的影响[J].实用医学杂志, 2010, 26(4):552-554.

[9] 宋楠萌,桑建利,徐恒.增殖细胞核抗原(PCNA)的分子结构及其生物学功能研究进展[J].自然科学进展, 2006, 16(10):1201-1209.

[10] 孙春凤.基质金属蛋白酶-2的结构和功能[J]. 安徽医科大学学报, 2013,48(3):330-332.

[11] 熊俊,鲁赛. 基质金属蛋白酶2在冠心病的研究进展[J]. 系统医学,2017(15):154-156.