布鲁氏菌病（Brucellosis,简称布病）是由布鲁氏杆菌引起牛、羊、猪、鹿、犬等哺乳动物和人类共患的一种传染病。布鲁氏杆菌一般持续终身感染并通过繁殖道和乳腺分泌物扩散传染，引起相似的临床与病理损伤，如发热、流产与不育等症状，严重威胁公共卫生和食品安全，是国际贸易检疫中必检的一种传染病。根据国家布鲁氏菌病防治计划（2012—2020）[1]和国家标准《GB/T 18646-2002 动物布鲁氏菌病诊断技术》[2]，我中心用虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验 (SAT)、酶联免疫吸附试验（C-ELISA）,对长沙地区牛、羊布病开展血清学抗体检测，用兽医实验室常用的布病净化的几种血清学检测方法进行比对、评估，对检测结果进行分析，为长沙市动物布鲁氏菌病净化提供科学依据，确保动物源性食品安全，为长沙市建设国家食品安全城市提供技术支撑。现将检测情况报告如下。

1 材料与方法

1.1 血清样品

采集长沙地区未免疫布鲁氏菌疫苗的牛、羊血清样本，冷冻保存。

1.2 试剂

布鲁氏菌病虎红平板凝集抗原 (生产批号：20161005)，购自青岛易邦生物工程有限公司。布鲁氏菌病试管凝集抗原、标准阳性血清、标准阴性血清(生产批号20170115)，购自青岛易邦生物工程有限公司。布氏杆菌竞争ELISA检测试剂盒(C-ELISA)，购自兰州兽医研究所，生产批号20160714130，有效期 20170713。

1.3 主要仪器

恒温培养箱、MK3酶标仪、生物梅里埃VITEK麦氏比浊仪、移液枪等。

各类用户在该操作系统的使用权限各不相同，具体分为以下几种权限：（1）教师的权限为输入、查询与输出自己的个人信息；（2）评价部门管理者的权限为审核教师上传到由本部门考核栏目的相关信息，以及在全校范围内结合部门考核对教师的综合考核结果进行排序等；（3）超级用户（校长或经学校授权者）具有增减考核栏目（板块）、评价要素的权限，修改各板块评价要素权重的权限，以及对全校教师进行综合评价和某一单项评价的权限。本调查研究团队成员邱健筠为“教师专业发展评价系统”架构的操作系统如图3所示[4]。

1.4 检测方法

1.4.1 虎红平板凝集试验(RBT)

按动物布鲁氏菌病诊断技术（GB/T18646-2002）和试剂说明书进行操作和结果判定：实验前将抗原、待检血清样品及阴阳性对照恢复至室温，取0.03mL虎红平板凝集抗原于洁净玻璃板上，取0.03mL被检血清与抗原混合，4分钟内观察结果。凡出现+以上者判为阳性。对出现阳性反应的动物，必须进一步做试管凝集试验确证。凝集反应判定标准：++++凝集块呈菌丛状，凝块间液体明显清亮；+++凝集反应较强，液体较清亮；++形成较明显卷边，凝集块间液体稍清亮；+稍能查到凝集，稍有卷边形成，凝集物间液体呈红色；-无凝集，呈均匀粉红色。

从表3可以看出，牛羊布鲁氏菌病检测，酶联ELISA法、试管凝集法、虎红平板法，三种方法检测OD值和试验结果符合，且完全吻合。

按动物布鲁氏菌病诊断技术（GB/T18646-2002）和试剂说明书进行操作和结果判定。

2.2.1 标准比浊管按标准方法配制，5管的麦氏度检测结果分别 0.00、0.94、0.76、2.61、3.44。清亮度显著凝集50%，稀释度为1∶200，标记为++，对应的麦氏度为1.70±0.05；阳性血清试管凝集试验1∶160 0++阳性，麦氏比浊仪对应的麦氏度为1.70±0.05；阴性血清两者均为阴性。试管凝集试验结果填写出现“++”以上凝集现象的血清最高稀释度。

1.4.2 .2加入抗原：取0.5mL 20倍稀释抗原于每支试管内，充分混匀，第一管至第五管血清稀释度分别变为 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800。同时做阳性对照、阴性对照、抗原对照。

按GB/T18646-2002标准，进行动物布鲁氏菌血清学检验，大量样品的检验，可用虎红平板法RBT进行初筛，操作简便，快速，能在短时间内对布鲁氏菌病的感染情况作出定性。但由于受非特异性抗体的干扰，有时会出现非特异性凝集，存在假阳性，或者人为肉眼观察判断的因素影响，弱阳性样品不易看出，存在误差和漏检。

2.2.2 试管凝集法SAT检验8份血清，其中虎红平板法筛选的5份阳性和随机3份阴性样品。5份阳性样品中，1份为1∶100，为弱阳性；2份为1∶400，为稍强阳性；2份为大于1∶800，为强阳性；3份小于1∶50，均为阴性。结果见表3。

1.4.2 .4对照管及比浊管充分震荡后，置37℃培养24h，取出后恢复室温，以参照比浊管为标准判定结果。

1.4.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)

严格按照布氏杆菌抗体竞争ELISA试剂盒说明书进行操作和结果判定。

2 结果与分析

2.1 三种血清学检测结果比较

用虎红平板RBT、竞争ELISA、试管凝集SAT法，分别对长沙地区未免疫布鲁氏菌疫苗的176份牛、羊血清，进行布病抗体检测。首先用虎红平板凝集试验初筛，阳性样品经试管凝集试验或酶联法ELISA定性。三种检测方法，检测数、阳性数和阳性率，结果如表1。

(4)各重金属之间存在不同程度的相关性，Pb 和Zn 之间相关系数为0.825，Cd和Ni之间相关系数为0.695，达到显著相关水平，可见Pb 和Zn 、Cd和Ni之间存在一定的伴生关系，可能属于同源污染物。

 

表1 三种检测方法的阳性数和阳性率

  

检测方法虎红平板法RBT酶联法ELISA试管凝集法SAT检测数176 176 176阳性数5 5 5阳性率/%2.84 2.84 2.84

根据国家判定标准要求，虎红平板法RBT阳性，试管凝集法SAT确诊阳性，可以判定为抗体阳性个体。取虎红平板法筛选的5份阳性和3份阴性血清样品，用试管凝集法复核。试管凝集法置37℃～40℃培养24h，取出检查并记录结果。因该法为利用肉眼观察其混浊程度，人为因素影响较大，质量控制不易把握。本实验室为确保试管凝集法结果判定的准确性，采用法国梅里埃麦氏比浊仪进行读数，结果如表2。

2.2 试管凝集试验SAT及比浊仪检测结果

由表1可以看出，RBT、ELISA和SAT三种方法检测样品176份，检出阳性样品5份，阳性率均为2.84%；三种方法阴阳性结果符合,且完全对应。

对照组：行NC化疗，即：①在患者住院的第1天、第8天行标准为25 mg/m的长春瑞滨静脉注射治疗；②住院的第1～5天行标准为25 mg/m的顺铂静脉注射治疗，连续用药60 d。

 

表2 试管凝集法比浊仪读数结果

  

样品编号2016111201 2016111202 2016111203 2016111204 2016111205 2016111206 2016111207 2016111208阳性对照阴性对照抗原对照1∶50 1.61 0.36 0.11 0.03 0.11 3.41 3.57 3.66 0.18 3.56 3.44 1∶100 3.42 0.16 0.53 0.26 0.06 3.50 3.62 3.57 0.21 3.68 3.57 1∶200 3.29 0.96 1.23 0.18 0.24 3.46 3.58 3.63 0.32 3.66 3.54 1∶400 3.24 3.63 3.18 0.65 0.70 3.48 3.55 3.69 0.43 3.54 3.56 1∶800 3.28 3.66 3.22 3.45 3.43 3.54 3.63 3.62 0.86 3.50 3.55结果1∶100 1∶400 1∶400 1∶800 1∶800＜1∶50＜1∶50＜1∶50 1∶1600＜1∶50＜1∶50

1.4.2 .1被检血清的稀释：取5支VITEK一次性塑料试管，第一管加1.2mL稀释液（0.5%石碳酸生理盐水，羊血清必须用0.5%石碳酸10%氯化钠盐溶液），第 2、3、4、5 管加 0.5mL 稀释液；取 0.05mL 被检血清于第一管，充分混匀，弃去0.25mL,再吸0.5mL入第二管，从第二管取0.5mL入第三管，同法至第五管，第五管取0.5mL弃去。第一管至第五管血清稀释度分别为 1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400。

1.4.2 .3试管凝集试验参照比浊管的制备：每次反应须配比浊管，作为判定凝集反应程度的依据，先将20倍稀释抗原用等量稀释液作对倍稀释，按要求配置比浊管。

 

表3 三种检测方法试验结果比较

  

样品编号2016111201 2016111202 2016111203 2016111204 2016111205 2016111206 2016111207 2016111208阳性对照弱阳性对照阴性对照酶联ELISA法OD值0.635 0.174 0.156 0.091 0.083 1.039 1.013 1.037 0.053 0.562 1.059试管凝集试验结果1∶100 1∶400 1∶400 1∶800 1∶800＜1∶50＜1∶50＜1∶50 1∶1600 1∶100＜1∶50虎红平板凝集试验结果弱阳性阳性阳性强阳性强阳性阴性阴性阴性强阳性弱阳性阴性

1.4.2 试管凝集试验(SAT)

2．6 ELBWI预后影响因素分析 按存活组和死亡／放弃组比较，见表2。行二分变量的Logistic回归分析结果示：受孕方式（P＝0．013）在两组中差异有统计学意义。

3 讨论与结论

3.1 虎红平板法RBT可用于大量样品的初筛检验

沙漠中的建筑为更好地适应气候环境，防止墙体因长时间照射而影响室内的热舒适性，往往受规划布局和朝向的影响较大。但盖尔达耶的建筑在紧凑布局下并没有过多考虑关于朝向的问题，而是将抵御恶劣环境的方式落实到建造各环节。

3.2 ELISA方法适用于大量样品的检测

通过试验结果可以看出，通过ELISA方法检出的阳性样本，准确率高，操作简便、快速、特异性好，检测效率高，与虎红平板法的符合率达到100%，适用于大量样品的检测。但ELISA试剂盒成本比较高，费用较高。

3.3 试管凝集试验SAT法

试管凝集试验SAT法是国标中法定的布病检测方法，也是农业部动物疫病诊断的确诊方法。但此法过程较为繁琐，操作繁杂、费时，不适用于现场应用和大批量样品的检测。

常微分方程是学生将理论知识应用于实际问题的重要桥梁之一[7]。因此，培养学生创新意识、提升学生数学应用创新能力是课程改革和建设的宗旨。

3.4 动物布鲁氏菌病的诊断

对动物布鲁氏菌病的诊断，根据国家布鲁氏菌病防治计划（2016-2020）实验室诊断要求，对于未免疫动物，血清学确诊为阳性的，判定为患病动物；若初筛诊断为阳性的，确诊诊断为阴性的，应在30天后重新采样检测，复检结果阳性的判定为患病动物，结果阴性的判定为健康动物。

表 2 结果显示，三组被试的自尊和职业认同不存在显著差异，这是每组被试作为一个整体的结果，但死亡凸显及亲密关系丧失的压力可能会对不同自尊水平的被试产生不同效应，为进一步明确二者对不同自尊水平被试职业认同产生的影响，研究者在被试中区分了高自尊者和低自尊者，高自尊者是自尊问卷得分中排名前27%的被试，低自尊者是自尊问卷得分中排名后27%的被试，详见表 3。

3.5 动物布鲁氏菌病净化监测应用

在动物布鲁氏菌病净化监测中，常需要两种或两种以上的方法相互配合使用。本实验室对虎红平板和ELISA法筛选出的阳性样品，再用试管凝集法确诊，在最后一步读数时，为降低肉眼观察带来的误差，通过麦氏比浊仪读数，准确可靠，给操作带来方便，也更标准化。

本实验室对长沙地区牛、羊布病开展血清学诊断，用兽医实验室常用的布病净化的几种血清学检测方法进行比对、评估，对检测结果进行分析，为长沙市动物布鲁氏菌病净化提供科学依据，确保动物源性食品安全，为长沙市建设国家食品安全城市提供技术支撑。 □

参考文献：

[1] 农业部，国家卫生计生委.国家动物布鲁氏菌病防治计划（2016-2020年）[S].北京：中华人民共和国国家质量技术监督检验检疫总局，2002.

[2] 中华人民共和国国家标准.动物布鲁氏菌病诊断技术GB/T 18646-2002[S].北京：中华人民共和国国家质量技术监督检验检疫总局，2002.

[3] 任路等.牛布鲁氏菌四种血清学检测方法的比较[J]．中国动物检疫，2016，33(3)：74-76.

[4] 孙锡斌等.动物检疫检验彩色图谱[M].北京：中国农业出版社,2004.

[5] 陈慧燕.麦氏比浊仪检测布鲁氏菌病[J]．中国卫生检验杂志，2009，19(6)：1318-1320.