乳腺癌发病率逐年增高，位居女性恶性肿瘤第一位，目前许多学者都在探索疗效好、毒性反应小且廉价的治疗方案[1-2].现阶段关于复方苦参注射液对乳腺癌作用的研究多停留在体外细胞层面，动物实验探析体内抗乳腺癌作用的研究较少.Cyclin是细胞周期素，与周期素依赖性激酶、周期素依赖性激酶抑制因子共同作用，对细胞周期起到调控作用[3〗.Cyclin D1属于G1期细胞周期蛋白的重要组成部分，Cyclin D1与细胞周期依赖激酶形成复合物促进Rb蛋白磷酸化，解除抑癌基因的调控作用，细胞周期从G1期进入S期，进而细胞增殖，Cyclin D1出现过表达，G1期缩短，细胞生长紊乱，出现癌变[4-6].笔者通过研究复方苦参联合5-Fu对细胞周期素Cyclin D1表达的影响来探究其抗癌机制，观察其对乳腺癌荷瘤裸鼠的治疗作用.通过体内、外实验，多方面对其作用疗效进行探析.

1 实验材料

1.1 细胞标本与实验动物

细胞系：人乳腺癌细胞系MCF-7(美国典型培养物保藏中心ATCC，雌激素受体ER阳性)，购自中科院上海细胞研究所.实验动物：SPF级雌性BALB/C-nu/nu裸鼠12只，4～6周龄，体质量19±2 g，购于海斯莱克有限公司(合格证号：SCXK(上海)2007-0005).

1.2 实验药物

复方苦参注射液：5 mL/支(山西振东制药股份有限公司)，批准文号：国药准字Z14021231.5-氟尿嘧啶(5-Fu)注射液：0.25 g/支(天津金耀氨基酸有限公司)，批准文号：国药准字H12020959.二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)：100 mL/瓶.

1.3 主要试剂

Rabbit anti-cyclin D1 (美国Abcam公司)； FITC标记山羊抗兔IgG(H+L)试剂盒(北京中杉金桥公司)；Triton X-100(美国Sigma公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；胰蛋白酶EDTA溶液(0.25%)(以色列BioInd公司)；DMEM(达尔伯克氏必需基本培养基)；硝酸纤维素膜(Schleieher and Schcell公司).

目前，研究区的工程地质、自然环境等方面已有较为详尽的资料，但在地下水方面没有进行过系统的分析研究。本研究应用GMS建立研究区的溶质(污染物)运移模型来探索污染物迁移的规律、确认污染扩散时间和范围，弥补研究区对地下水研究方面的不足，并在此基础上建立场地的污染监控体系。同时为其他类似场地的污染模拟、监测工作提供参考。

1.4 主要仪器及设备

FPROGO2D型PCR仪(Techne)，Eppendorf；80-2106-20型紫外分光光度计(Pharmacia)；ELT-21V-85V14型超低温冰箱(Harris)；各种离心机：UNIVERSAL 16R型 (Hettich)，EBA12型(Hettich)， D-7200型(Hettich)；转膜仪(Bio-Rad)；荧光素酶检测仪器(Berthold)；电子天平(Sartorius)；垂直式蛋白电泳槽装置(Bio-Rad公司)；流式细胞仪(BD)；HZS-H型恒温水浴振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)；超净工作台(苏州净化设备公司)；凝胶成像系统(上海四星生物技术公司)；荧光显微镜(Olympus IX70)；P25 Powerpack Biometra型电泳仪(Biotron)；细胞培养瓶板、离心管、移液管等耗材(美国Corning公司).

2.2.4 RT-PCR逆转录-聚合链式反应 复苏MCF-7 细胞后，移入两个培养皿中，分别加入联合用药组和对照组药物，放入37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h.将两组细胞从恒温培养箱取出，加入1 mL TRIZOL 试剂，颠倒均匀，室温孵育5 min；加入200 μL氯仿，剧烈震荡15 s，室温孵育2 min；在4 ℃下，12 000 r/min离心15 min；吸取上层含有RNA的水相放入新管中，加入500 μL异丙醇沉淀RNA，室温孵育10 min；在4 ℃下，12 000 r/min离心15 min；弃掉上清液，加入1 mL 75%乙醇洗涤RNA，待沉淀后再次在4 ℃下，7 500 r/min离心10 min；弃掉上清液，空气干燥5 min，用20 μL DEPC水溶解RNA；用紫外分光光度计测定RNA浓度，放入-20 ℃冰箱中备用.反转录反应参照Takara产品说明书，反应液配置参照试剂盒要求，主要RT-PCR 引物见表1.

2 实验方法

2.1 细胞准备与实验动物的饲养

2.1.1 细胞准备 将解冻细胞用移液管移入离心管中，1 000 r/min 离心5 min，弃去上清液，加入培养基并反复吹打离心管，待细胞悬浮后，加入含有10 mL 10% 胎牛血清的DMEM培养，放入37 ℃，5%CO2培养箱.次日更换一次培养液，继续培养；24 h后，取待传代细胞培养瓶，观察细胞生长情况，待80%以上细胞发生融合即弃去培养基.加3 mL PBS冲洗细胞，加1 mL 0.25%胰蛋白酶消化细胞，室温放置5 min，在显微镜下观察，当80%的细胞脱离培养基呈游离状态时即可加入10%胎牛血清的DMEM培养基，终止细胞消化.

2.2.1 乳腺癌细胞株流式细胞术检测 复苏MCF-7 细胞后，接种入两个6孔板中，分别加入联合用药组和对照组药物，放入37 ℃，5% CO2恒温培养箱培养；24 h后取出联合用药组和对照组干预后细胞，去除培养基.用0.25%胰蛋白酶，1 mmol/L EDTA的消化缓冲液消化细胞；用70%乙醇稳定蛋白，混匀.4 ℃下避光孵育30 min.加入 2 mL 1×PBS后 1 400 r/min 离心5 min，去除上清液；使用AnnexinV细胞凋亡检测试剂盒，上流式细胞仪分析，并用细胞周期软件Modifit 2.0处理结果.

2.2 细胞实验及动物实验

CCK-8增殖实验主要检测MCF-7细胞在不同时间的增殖情况.见表2，联合用药组(Rsf+5-Fu)与对照组(Dmso+5-Fu)相比，在48，72和96 h三个时间点的增殖差异具有统计学意义(P<0.05)，在0，24，48，72和96 h共5个时间点，每个时间点通过CCK-8检测法测得6个数据，取平均值后计算增殖比例，做细胞增殖曲线(图1)，从图中可以看出，联合用药组药物干预后的MCF-7细胞增殖能力下降，明显低于对照组药物干预后的MCF-7细胞.

2.1.2 实验动物的分组和饲养 如1.1所述小鼠12只，随机分成联合用药组和对照组两组，每组各6只小鼠.采用笼养方式，一鼠一笼，避光，室温保持在18～24 ℃，相对湿度控制在50%～60%，用锯末和木屑作为鼠笼垫料，每日5.5～6 g饲料及水(实验室提供).

干预MCF-7细胞24 h，用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞技术检测细胞凋亡率，纵轴表示PI染色，横轴为Annexin V-FITC染色，左上象限(Annexin V-FITC染色阴性，PI染色阳性)为坏死细胞，左下象限(Annexin V-FITC染色阴性，PI染色阴性)为活细胞，右上象限(Annexin V-FITC染色阳性，PI染色阳性)表示晚期凋亡细胞，右下象限(Annexin V-FITC染色阳性，PI染色阴性)为早期凋亡细胞.见图3及图4,药物干预后24 h,联合用药组相较于对照组,MCF-7细胞早期凋亡率达到12.7%，对照组为6.2%，差异显著.

应用 SPSS 18.0 软件分析处理相应数据，数据用均数±标准差表示，计量资料比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义，计数资料进行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义.

其中Pi是农户有小额信贷需求的概率，m为小额信贷需求影响因素的个数，Xij是自变量，表示第j种影响因素。

胎儿MRI检查所需时间较长，胎动时的伪影导致所得图像不清晰，快速扫描系列单层图像采集时间不足1s，完成全部检查只需0.5min，不受胎动伪影的影响。MRI检查的基本序列为T2W1序列，具有较高的诊断价值，该序列中包括单次激发快速自旋回波序列及弥散加权成像，弥散张量成像等特殊序列。上述序列对胎儿颅脑检查的价值均较高。

 

表1 RT-PCR 引物

 

Tab. 1 The primers of RT-PCR

  

名称序列β-actin5'-cgtaaagacctctatgccaa-3',5'-agccatgccaaatgtctcat-3'Cyclin D15'-gccctacccacaaagcctcag-3',5'-gtggctttctgttgctgttca-3'

2.2.5 动物实验-裸鼠荷瘤模型的建立及给药效果 复苏MCF-7 细胞，移入两个培养瓶中，放入37 ℃，5% CO2培养箱中培养；待细胞扩增至2×105数量级后将细胞离心，用200 μL生理盐水重悬成单细胞悬液后接种裸鼠皮下.将1.1所述12只裸鼠饲养于SPF环境中，适应环境后，用1 mL注射器向12只裸鼠右侧大腿皮下脂肪垫注入0.2 mL 2×105数量级MCF-7细胞悬浊液，观察2周，待细胞形成的肿瘤长成黄豆大小时将裸鼠随机分为2组，每组6只，一组为联合用药组，予复方苦参+5-Fu(5-Fu 2 mg/kg，苦参3 mL/kg)瘤内注射，1次/d;另一组为对照药物组，给予DMSO+5-Fu瘤内注射(5-Fu 2 mg/kg，DMSO 3 mL/kg)，1次/d.观察动物的生命体征、活动度、体质量、荷瘤大小.测量1个月后两组小鼠荷瘤的直径.

2.3 统计学方法

2.2.3 CCK-8增殖实验 复苏MCF-7 细胞后，以每孔2 000个的密度接种于两个96孔板中，设置5个复孔，分别加入联合用药组和对照组药物，放入37 ℃，5% CO2恒温培养箱培养；在相应的时间点加入十分之一体积的CCK-8工作液，37 ℃ 孵育1 h后，放入酶标仪以450 nm波长检测；分别在0，24，48，72，96 h重复上述检测，将检测结果整理后取平均值，再制成细胞增殖曲线.

3 实验结果

3.1 对MCF-7细胞的增殖抑制作用分析

细胞实验和动物实验将使用平行对照的方式，设置联合用药组(复方苦参联合5-Fu)，对照组(DMSO联合5-Fu).

 

表2 对MCF-7细胞增殖抑制的作用比较

 

Tab. 2 Comparison of the inhibition effects of MCF-7 cell proliferation

  

组别0 h24 h48 h72 h96 h联合用药组1.001±0.0251.031±0.0840.955±0.018▲0.822±0.017▲0.807±0.035▲对照组1.001±0.0251.098±0.0441.022±0.0160.925±0.0180.892±0.022

注：与对照组相比，▲P<0.05

3.2 裸鼠荷瘤模型的建立及瘤体比较

经过1个月后，两组荷瘤的直径分别为联合组(79.8±10.3)mm，对照组(176.7±26.2)mm，大小差异具有统计学意义(P<0.05).经联合用药组处理过的MCF-7细胞在成瘤能力上不如对照组，可以认为联合用药组对乳腺癌(MCF-7)治疗作用优于对照组，见图2.

  

图1 RSF+5-Fu和DMSO+5-Fu干预MCF-7后，细胞增殖能力的情况Fig. 1 Proliferation ability of MCF-7 cells after treated by RSF+5-Fu and DMSO+5-Fu

  

图2 裸鼠荷瘤后比较联合用药组和对照组瘤体的情况Fig. 2 Comparison of tumor mass in the two groups after nude mice were burdened with tumor

3.3 MCF-7细胞的凋亡情况比较

2.2.2 免疫印迹(Western Blot) 复苏MCF-7 细胞后，接种入两个6孔板中，分别加入联合用药组和对照组药物，放入37 ℃，5% CO2恒温培养箱中24 h；弃去培养液，加入PBS缓冲液冲洗细胞3次，分别加入PMSF 400 μL，于冰上裂解30 min；用刮棒将细胞碎片和裂解液移至离心管中，在4 ℃下，12 000 r/min离心5 min，去除上清液置于-20 ℃冰箱保存；将变性样品进行SDS-PAGE蛋白电泳.将10%分离胶加入TEMED摇匀，待分离胶凝固后吸去水分，用浓缩胶将剩余空间浸满，放入电泳槽中，电泳5 h；电转仪转移蛋白至硝酸纤维素膜；将膜用TBST浸湿后，用5%脱脂奶粉封闭1 h；用5%BSA稀释一抗，室温下孵育2 h，用TBST在脱色摇床上洗3次；用5%脱脂奶粉稀释二抗，孵育1 h，用TBST洗3次；去尽残液，放入X-光片夹中.将显影剂和定影剂倒入塑料盘中，曝光后将X-光片浸入显影液中显影，浸入定影剂中，最后清除定影剂.

  

图3 联合用药组与对照组MCF-7细胞凋亡的情况比较Fig. 3 Comparison of apoptosis of MCF-7 cells in the two groups

  

注：*P<0.05图4 联合用药组与对照组MCF-7细胞凋亡率比较Fig. 4 Comparison of apoptosis rate of MCF-7 cells in the two groups

3.4 Western blot法检测细胞中Cyclin D1的表达情况

显色结果表明，在干预后，联合用药组与对照组相比，Cyclin D1表达降低，差异显著，见图5.

反转课堂是指将学习的决定权转由教师转向学生自己，这种教学方法可以提高同学们的积极性。商务英语翻译课程本来就有许多是得靠学生自己主动记忆学习的，使用反转课堂的教学方法可以很好地激发同学们的积极性，教师也从专研课本内容转到引导学生主动学习的方向[5]。其中商务英语翻译课程中的许多知识点也要靠学生自己主动研究总结，这样知识点会更加容易地被学生记住，学生也可以很快地掌握知识，并得到满足感，这样也可以不断地激发学生对商务英语翻译课程的兴趣。这就是反转课堂的创新使用的好处。

混凝土是房屋建设中的主要建筑材料。混凝土的质量直接决定了最终建筑的质量。因此，要提高房屋的建筑质量，必须加强混凝土施工技术的创新。在混凝土施工技术的创新中，突破重点在于提高混凝土的耐热性，降低其水化热反应的热差，从而避免混凝土的过度收缩，进而避免混凝土的变形和开裂。提高混凝土的使用寿命。

3.5 聚合链式反应法检测细胞中Cyclin D1的表达情况

RT-PCR法检测联合用药组与对照组细胞中Cyclin D1的表达情况.从图6中Cyclin D1 mRNA 表达情况可以看出，联合用药组干预后MCF-7细胞中的Cyclin D1 mRNA明显低于对照组干预后的MCF-7细胞，差异显著.

卫生状况是环境质量的一个最重要的外在体现，直接影响到顾客的消费行为和消费质量。一个拥有良好的卫生情况的旅游景区肯定会更受老年人的喜爱，进而增加其旅游市场的吸引力。

  

图5 联合用药组与对照组Cyclin D1的表达情况比较Fig. 5 Comparison of the protein expression of Cyclin D1 in the two groups

  

注：*P<0.05图6 联合用药组与对照组Cyclin D1 mRNA的表达情况比较Fig. 6 Comparison of the expression of Cyclin D1 mRNA in the two groups

4 讨论

本研究通过CCK-8增殖实验观察发现，在各个时间点比较MCF-7细胞的增殖情况，联合用药组对细胞增殖的抑制作用都优于对照组.在0及24 h两个时间点，联合用药组与对照组相比，对MCF-7细胞的增殖抑制作用差异并无统计学意义，从48 h开始，联合用药组的药物作用逐步显现，差异有统计意义.表明复方苦参注射液对乳腺癌细胞MCF-7有明显的增殖抑制作用.抑制细胞增殖属于抗肿瘤药物针对肿瘤细胞抑制的一种方式[7].5-Fu可干扰DNA合成，对RNA的合成也有一定的抑制作用.复方苦参注射液为经典抗肿瘤中成药,能通过各种途径作用于肿瘤细胞,抑制增殖，诱导分化，促凋亡，达到抗肿瘤作用[8].实验应用5-Fu与复方苦参注射液联合作用乳腺癌MCF-7细胞裸鼠移植瘤成瘤模型，研究体内抗肿瘤作用效果.结果显示两组药物作用于带瘤裸鼠后，联合用药组处理过的MCF-7在成瘤能力上不如对照组处理的MCF-7细胞，说明联合用药组作用于裸鼠移植瘤，显示明显抗肿瘤效果 [9].乳腺癌细胞株流式细胞术主要检测MCF-7细胞的凋亡情况，联合用药组药物干预后的MCF-7细胞相较于对照组细胞凋亡的数量更多，比例高，速度差异显著，其中在24 h，联合用药组细胞凋亡率达到12.7%，对照组为6.18%，两组相比差异显著.通过诱导凋亡、启动细胞死亡治疗或消除肿瘤属于目前大部分抗肿瘤药物的主要机制[10].联合用药组可以减少S期和G2-M期细胞数量，将细胞明显地阻止在G0-G1期.Cyclin D1基因定位于人染色体11q13，属于细胞周期素家族中主要成员，对细胞周期起正调控作用[11-12].Cyclin D1促复合物形成，进而Rb蛋白磷酸化，细胞由G1期向S期转化，加速细胞周期，细胞异常增生，参与肿瘤的进展 [13-14].肿瘤发生、发展离不开信号通路的激活，肿瘤的内科治疗中特异性的靶向药物也是研究方向之一.通过药物干预，抑制Cyclin D1的表达，相当于抑制肿瘤细胞的增殖速度，进而减缓疾病的发生及发展过程.笔者通过多种实验方法检测细胞中Cyclin D1的表达情况后发现，联合用药组干预后的MCF-7细胞中的Cyclin D1 mRNA明显低于对照组，差异显著.研究表明，通过调控细胞周期相关蛋白C能够降低Cyclin D1蛋白表达水平[15].Cyclin D1对细胞周期的调控和促进肿瘤形成具有重要作用.

本实验表明通过联合用药，复方苦参可明显下调Cyclin D1的表达，从而抑制MCF7细胞的生长，可能通过调控Cyclin D1影响乳腺癌细胞的生长，并对乳腺癌起到治疗的作用.

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