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固相萃取净化高效液相色谱串联质谱法测定林蛙油中4种环境雌激素的含量

更新时间:2009-03-28

林蛙又叫做黄蛤蟆、雪蛤、红肚田鸡等,产自于中国东北长白山,是一种特有的珍稀野生动物[1-2],林蛙油是成熟雌性林蛙的干燥输卵管,具有润肺生津、补肾益精等功效[3],林蛙油具有珍贵的医疗保健价值,具有抗疲劳、抗衰老和增强免疫力等作用,市场价格昂贵,素有“软黄金”之称[4].林蛙油中所含的雌激素主要成分是雌二醇、雌酮、雌三醇等,目前主要用于治疗骨质增生、妇科疾病、调节体内脂类代谢[5].在养殖过程中,由于雌激素具有影响动物性别分化、缩短动物生长周期的效应,常被不法养殖户加入饲料中提高饲养效率.雌激素不易降解,较稳定,通过食物链进入人体后,具有较强的生物活性和潜在的致癌性,人体过多摄入雌二醇,也会导致乳腺癌、卵巢癌等癌症的发生[6].目前国际食品法典委员会(CEC)对动物食品中蛋白同化类激素的残留有严格的要求,欧盟已经禁止在养殖过程中使用生长激素.

目前国内外激素类物质的测定方法有气相色谱法[7-8]、气相色谱-质谱法[9]、液相色谱法[10-11]、液相色谱-质谱法[12-15].但是这些方法主要针对地表水、涂料、牛奶、纺织品等其他基质,目前对植物油基质的处理方法比较少见.液相色谱质谱联用法相对于高效液相色谱法,具有分离能力强、检测限低、定性水平高等优势.本文建立一种高效液相色谱质谱联用法测定林蛙油中雌二醇的分析方法,具有灵敏度、准确度高的特点,而且节约成本,能实现药物残留的快速检测,满足水产品质检以及相关基础研究的要求.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

4种化合物标准品:雌二醇(Estradiol)、雌三醇(Estriol)、雌酮(Estrone)、己烯雌酚(Diethylstilbestrol),纯度均大于98%,德国Dr. Ehrenstorfer公司产品;乙腈、二氯甲烷、甲醇、正己烷、丙酮(均为色谱纯),德国Merk公司产品;超纯水出自美国Milli-Q纯水系统;Carb/NH2固相萃取柱,500 mg/3 mL,美国Waters公司产品.

1.2 仪器与设备

Thermo TSQ Quantum高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪、配用电喷雾离子(ESI)源,均购自美国Thermo公司;超声波清洗器(昆山超声波仪器厂);平行旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司);高速冷冻离心机(日本日立公司);微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂);精密电子天平(梅特勒—托利多称重设备系统有限公司).

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

由于林蛙油成分比较复杂,基质中含有大量的脂肪、蛋白质、碳水化合物等杂质.而雌酮、雌二醇、雌三醇、己烯雌酚这4种环境激素属于疏水性物质,易溶于大多数有机溶剂,本文比较了甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯4种溶剂的提取效果,得到4种环境激素的回收率,见图1.由图可知,乙酸乙酯对环境激素提取的效率低,4种物质的回收率为20%~30%;正己烷提取的回收率满足要求,但是正己烷对脂肪溶解度大,容易造成对质谱的污染;甲醇和乙腈提取的效果较好,乙腈能提取大多数目标物,并且提取效果好,还能使蛋白质变性凝结沉淀下来后通过离心除去;甲醇的提取液中含有少量杂质,不利于净化过程,容易造成固相萃取柱堵塞.因此本文采用加入乙腈后超声提取.

2.1.2 固相萃取条件的选择

1.3.2 样品前处理方法

流动相的pH值会影响目标物在色谱柱中的分离.实验比较了乙腈-水(0.1%甲酸)、甲醇-水(0.1%甲酸)、乙腈-水(0.01%氨水)、甲醇-水(0.01%氨水)4种不同的流动相对目标物的电离喷雾影响.实验发现,当采用甲醇-水(0.01%氨水)作为流动相时,采用合适的梯度洗脱程序,不但得到了最佳的分离效果和质谱信号响应,并且得到了比较理想的色谱峰,峰形尖锐且对称性好,基线平稳,增大了分子离子峰的峰强度.4种环境类激素的SRM色谱图见图3.

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

要说也有好运的日子。比如春天,我就住进了楼房,由农民变成了市民,李家庄也变成了李家社区。这就是个天翻地覆的变化。在李家庄改为李家社区之前,城市已经伸手可及。穿过幸福大街,就是县里的老年文体中心,那里有一个很大的门球场,那些退休的城里人都在那里打门球,不论冬夏,风雨无阻。

但她何以这样的像她呢?这个容态,还保留十四岁时候的余影,难道就是她自己吗?她为什么不会到上海来呢?是她!天下有这样容貌完全相同的人吗?不知她认出了我没有……我应该问问她了。

 

表1 流动相梯度洗脱程序

 

Tab. 1 Elution process of the separation

  

时间/min流速/(mL·min-1)流动相体积比/%V(A)V(B)00.30109030.30307050.3040605.10.3010907.50.301090

采用大气压电喷雾离子源(ESI),负离子模式;喷雾电压为3 000 V;离子传输毛细管温度为350 ℃,Q1半峰宽为0.7 Da;Q3半峰宽为0.7 Da;碰撞气氩气压力为0.2 Pa;鞘气流量为10 L/min;辅助气流量设定为2 L/min;采用选择反应监测模式(SRM),4种化合物的监测离子对、碰撞能量、线性方程及相关系数见表2.

色谱柱为Capcell Pak C18(MGⅡ,150 mm×2.1 mm,5 μm);柱温为30 ℃,进样量为10 μL,流动相A为甲醇;B为0.02%氨水溶液;采用梯度洗脱程序见表1.

1.4.2 质谱条件

 

表2 4种化合物的SRM采集参数

 

Tab. 2 SRM parameters for 4 drugs

  

编号目标物母离子(m/z)子离子(m/z)碰撞能量/eV1雌酮269145*,15930,292雌二醇271145*,18336,403雌三醇287171*,14537,324己烯雌酚267251*,23727,29

注:带*的为定量离子

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的选择及优化

2.1.1 提取溶剂的选择

据访问,南京普通高校定向运动开展的场地一般可分为两种,即校内场地与校外场地。校内场地的使用一般是整个校园,校外场地是南京的各个开放式公园。这些高校更多的会使用校内场地,较少使用校外场地。

  

图1 提取溶剂对林蛙油中4种环境雌激素回收率的影响 Fig. 1 Influence of selected solvents on the recoveries of 4 environmental estrogens in Rana oviduct

图9给出了不同进口Mach数条件下, 喷口后沿流向不同截面处氢气燃烧效率的变化趋势. 除热壅塞状态, 在各进口Mach数条件下, 燃烧效率均沿流向逐渐增大. 由于在本文中, 氢气是由于楔板产生的入射斜激波增温增压的作用强迫点火, 随着进口Mach数的增大, 来流总焓增大, 有利于氢气的燃烧, 同时在喷流条件不变的情况下, 增大进口Mach数相当于增加了空气的质量流量, 在本文设置的参数条件下各计算状态均未达到完全燃烧条件, 因此增加氧气的含量会使燃烧效率增加, 因此燃烧效率不断上升, 其最大值由0.501上升至0.683.

分别称取雌二醇(Estradiol)、雌三醇(Estriol)、雌酮(Estrone)、己烯雌酚(Diethylstilbestrol)标准品各10.0 mg,用甲醇溶解后转移至100 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容配置成100 mg/L的标准储备液,在-18 ℃下避光保存.使用时将上述标准储备液混合,用甲醇稀释成不同浓度的标准工作液.

  

图2 不同固相萃取柱的4种环境雌激素回收率Fig. 2 Recoveries of metabolites of 4 environmental estrogens on different SPE columns

固相萃取是一种色谱分离的前处理方法,主要依靠固相萃取柱进行净化,不同的基质选择不同材料的固相萃取柱,填料的类型决定了吸附能力的大小以及回收率的高低,本文采用实验室常用的几种固相萃取柱HLB,C18,MAX,Alumina-N及Carb/NH2进行比较.HLB是一种亲水亲脂的固相小柱,主要用于酸性、中性和碱性化合物的通用吸附剂;C18是以硅胶为基质的反相萃取柱,用于净化非极性或极性较低的化合物;MAX是阳离子交换固相萃取柱,用于净化离子型的化合物;Carb/NH2固相萃取柱,多用于从非极性溶剂中提取弱极性或者中等极性物质,通过用非极性有机溶剂活化或者洗脱,能够很好地将目标物洗脱下来.通过这5种固相萃取柱对环境类雌激素的吸附能力比较,可发现回收率范围为41%~102%,其中Carb/NH2固相萃取柱的平均回收率比较高,均在72%以上,并且比较稳定,见图2.

2.2 色谱条件的选择及优化

准确称取2 g样品(精确至0.01 g)至离心管中,加入8 mL乙腈,在漩涡混合仪上充分混合后超声振荡10 min,平衡后放入离心机8 000 r/min离心10 min待用.固相萃取柱(Carb/NH2:500 mg/3 mL)用5 mL乙腈活化,取提取液在大气压力下自然过柱.然后加入5 mL正己烷淋洗并抽干.用4 mL V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=3∶7的混合液分2次洗脱,洗脱液于40 ℃水浴中旋转蒸干.准确加入1.0 mL V(甲醇)∶V(0.01%氨水溶液)=1∶9的混合液溶解残渣,为了防止脂肪和杂质的影响,加入2.0 mL正己烷去脂,漩涡混匀1 min,取下层液体过0.22 μm滤膜,供液质联用仪分析.

  

图3 4种环境雌激素的SRM图Fig. 3 SRM of 4 environmental estrogens

2.3 质谱条件的选择及优化

根据环境类雌激素的结构特征,环境雌激素分子结构中含有大量的—OH,容易脱落一个H形成[M—H]-离子峰,采用ESI负离子电离模式,以流动注射泵连续进样进行全扫描.然后对这4种目标物的分子离子施以碰撞能量形成子离子进行二级质谱分析,最终选择离子丰度比高的2对离子.同时进一步优化锥孔电压、碰撞能量、鞘气与辅助气流量等质谱条件,使各个离子的质谱响应信号达到最高.得到1.4.2中最佳质谱条件.

2.4 方法的线性范围和检出限

在0.5~100 μg/L范围内配置一系列混合标准工作溶液,采用外标法定量,以待测物的质量浓度X(μg/L) 为横坐标,待测物的峰面积比值Y为纵坐标制作标准曲线,由实验得出的线性回归方程、相关系数、检出限(LOD)及定量限(LOQ)见表3.以3倍信噪比为检出限(LOD),10倍信噪比为定量限(LOQ),结合样品的前处理过程,经过样品添加实验计算后确定方法的检出限和定量限.

《小镇上的将军》发表并获奖之前,我的一次次投稿四处碰壁,头破血流。而那之后,直到今天,情况并无太大改观。退稿好像是我这种平庸的不稳定的写作的一个标配,不离不弃。

宝石界将红宝石之外的各色宝石级刚玉都称为蓝宝石。也就是说自然界中的宝石级刚玉除红色的称红宝石外,其余各种颜色如蓝色、淡蓝色、绿色、黄色、灰色、无色等均称为蓝宝石,或称为彩蓝宝石,所以别以为蓝宝石是以蓝字做定语,就只有蓝色哦。

 

表3 4种目标物的线性方程、相关系数、检出限和定量限

 

Tab. 3 Linear equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of 4 compounds

  

编号目标物LOD/(ng·g-1)LOQ/(ng·g-1)线性方程相关系数1雌酮0.421.23Y=0.029 3+0.017 9X0.999 52雌二醇0.371.18Y=0.058 6+0.023 5X0.998 73雌三醇0.361.16Y=51.98+72 783.1X0.997 64己烯雌酚0.401.20Y=0.283+6 947.57X0.999 1

2.5 方法的回收率和精密度

本方法采用外标法定量,在空白样品中添加低、中、高3个不同浓度的目标化合物,按1.3.2节所述条件分别进行添加回收率和精密度实验.每个浓度平行测定5次,其平均回收率及相对标准偏差结果见表4.

2.6 实际样品测定

从市场及养殖场购买50份林蛙油样品,采用本方法进行分析,其中12个样品检出雌二醇,含量为0.63~23.4 ng/g;所有样品均未检出雌三醇、雌酮及己烯雌酚.由此可见,林蛙油中主要残留的雌激素为雌二醇.

 

表4 4种药物在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差

 

Tab. 4 Recoveries and relative standard deviations of 4 drugs in blank samples

  

化合物添加水平/(ng·g-1)测定回收率/%12345平均回收率/%RSD/%0.493.599.284.795.882.691.27.88雌酮0.89896.2100.386.584.393.17.724.097.299.892.488.8103.296.35.970.482.998.784.687.193.089.37.30雌二醇0.888.6102.383.787.194.091.17.974.082.3110.487.684.2103.193.513.40.494.983.691.298.389.991.66.05雌三醇0.882.687.499.392.180.688.48.544.080.285.091.083.596.787.37.520.491.089.287.686.485.888.02.41己烯雌酚0.890.093.183.782.288.787.55.164.082.198.084.692.385.588.57.36

3 小结

本文建立了固相萃取净化后高效液相色谱串联质谱法测定林蛙油中4种环境类雌激素含量的检测方法.通过对前处理条件、色谱条件以及质谱条件的优化,4种环境类雌激素标准曲线的线性关系良好,检出限LOD为0.36~0.42 ng/g;在不同的添加水平下,各组分的平均回收率为87.3%~96.3%,相对标准偏差为2.41%~13.4%.该方法前处理方法步骤简单、试剂用量少、回收率稳定、精密度好,可为测定林蛙油中的雌二醇等环境激素残留量提供方法参考.

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肖维,万译文,伍远安,杨霄,索纹纹
《湖南师范大学自然科学学报》2018年第02期文献

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