苯丙烷类代谢途径是植物特有的次生代谢途径之一，木质素、类黄酮、生物碱等生物活性物质均通过该途径合成[1]。苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL，E.C 4.3.1.5)是苯丙烷代谢第一步反应的限速酶，能催化L-苯丙氨酸(L-phenylalanine，L-Phe)脱氨生成肉桂酸，是连接初级代谢和苯丙烷类代谢的关键桥梁[2-3]。PAL不仅与植物抗病抗逆相关[4-6]，还参与花青苷和木质素的合成[3,7]，影响果实呈色和组织褐变[1, 8]。

石榴(Punica granatum L．)果实中富含安石榴苷、类黄酮和生物碱等生物活性物质，是一种极具发展前景的保健食品[9-10]。研究表明，石榴果实呈色受PAL、查尔酮合成酶(chalcone synthase，CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase，CHI)、二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)和UDP-葡萄糖-类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶(UDP-glucose-flavonoid 3-O-glucosyltransferase，UFGT)等的调控[11]。目前，石榴果实中花青苷调控酶CHS[12]、CHI[13]、DFR[11]和UFGT[14]基因克隆与表达方面的研究已有报道，但石榴果实呈色与PAL基因表达关系的研究尚鲜见报道。石榴果实采后极易发生褐变，严重影响其商品价值，研究表明，石榴果实褐变程度与PAL活性高低密切相关[9, 15]，但PAL基因表达与石榴果实褐变的关系尚不清楚。因此，研究PAL在石榴果实发育期的表达水平，对阐明其呈色和褐变发生的分子机理具有重要意义。

目前，鸭梨[3,8]、柑橘[16]、芒果[17]等多种果树作物上已有PAL基因克隆以及序列分析等方面的报道。在大多数植物中，PAL是一个多基因家族，包含多种同工酶，在不同组织和器官中的表达特性不同[18]。宋修鹏等[19]研究表明，PAL在甘蔗根中相对表达量最高，在茎和叶中表达量较低；闫洪波等[3]研究发现，鸭梨果实发育早期果心中PbPAL1和PbPAL2表达量显著高于果皮和果肉，受机械损伤后，果皮和果肉中PbPAL1和PbPAL2表达上调的时间不同。但目前针对石榴果实中PAL基因克隆、生物信息学及表达分析等方面的研究尚鲜见报道。因此，本研究采用RT-PCR和RACE技术，从石榴果实中克隆PAL基因，进行生物信息学分析，探讨其在不同品种果实发育中的表达特性，以期为揭示石榴果实呈色和褐变机理提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以山东省果树研究所石榴种质资源圃栽植的石榴品种泰山红幼果(直径2～3 cm)为试材。将采集的石榴果实洗净晾干，用削皮刀分离果皮，液氮冷冻后贮存于-80℃ DW-HL340型超低温冰箱(安徽中科美菱低温科技有限责任公司)中，用于基因克隆。

选取泰山红和泰山三白甜生长健壮且长势一致的8年生石榴树10株，常规管理。盛花期第50天时开始采样，每个品种选10个大小相同、着色一致、无病虫害、无挤压损伤的果实样品，每10 d采集一次，直至完全成熟(图1)。提取2个品种各时期果皮总RNA，反转录为cDNA，实时荧光定量PCR检测PAL的相对表达量变化。同时分析2个品种发育期果皮中褐变度和花青苷含量的变化规律。每时期每样品设3次重复。

  

图1 2个石榴品种发育期果实性状Fig.1 Fruit characteristics of two pomegranate cultivars during development

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA提取和cDNA第一链的合成 石榴果皮RNA的提取按照RNA prep Pure Plant Kit试剂盒(北京天根生化有限公司)说明书进行。提取RNA完整性利用琼脂糖凝胶电泳检测，OD260/OD280值利用Nanodrop紫外分光光度计(上海赛默飞世尔科技)测定。cDNA第一链的合成参照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(日本TaKaRa公司)说明书进行[20]。

1.2.2 石榴果皮PAL基因的克隆 根据GenBank登录的PAL基因的保守序列设计简并引物PAL1和PAL2(表1)，以合成的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：上、下游引物各1.5 μL，2 × Ex Taq buffer 25 μL，dNTP(10 mmol· L-1)1 μL，cDNA 5 μL，Ex Taq酶1 μL，ddH2O 15 μL。反应程序：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸 1 min，35个循环；72℃保温10 min，4℃保存。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段，连接至pMD18-T载体上，转化大肠杆菌后获得的阳性克隆送至上海生工生物公司测序[21]。

根据获得的保守序列分别设计5′ RACE和3′ RACE特异引物，UPM为通用引物(表1)。5′端克隆参照5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0(18374-058，Invitrogen)试剂盒说明书进行。3′端克隆时先以PAL3和UPM为引物进行扩增，以得到PCR产物为模板，再以PAL4和UPM为引物进行PCR扩增。按照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit(634923，Clontech)试剂盒说明书进行[22]。

将所获得的两端序列和中间片段序列进行拼接，分别在5′端起始密码子的上游和3′端终止密码子的下游设计特异引物PAL8和PAL9进行全长cDNA的扩增，然后将扩增的DNA片段连接到pMD18-T载体上进行测序。利用BLAST和DNAMAN软件进行序列比对，比较测序结果与拼接结果，测序正确的cDNA序列为PAL基因[23]。

 

表1 PAL基因克隆所用引物Table 1 Primers used for cloning of PAL gene

  

引物名称Primername引物用途Primeruseage引物序列(5′-3′)Primersequence(5′-3′)PAL1中间片段GAGCTNATYAGATTYTTGAAYGCPAL2IntermediatefragmentsCAATYTGDCCRGGRTGGTGCTTCPAL33′RACECTGGCGGTCCTGTCCGAGGTATTATPAL4GGAAGCCCGAGTTCACGGACCATCTUPMCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTPAL55′RACEAGGGGGTGATGTTGTGPAL6CAGGAGCTTCGTGATTGCPAL7CTGGAGGAGGGTGTTGATCPAL8全长TGCGGTTAGGTTTGGCTTCGPAL9FulllengthAGCACCGGAACAGCATAGGA

注：UPM为通用引物。

Note: UPM is universal primer.

Tunable lasing is an important branch in the field of lasers. Although some tunable microlasers based on WGM microresonators have been demonstrated, realizing the large tunable range and long lifetime are still challenging.

班主任担负着教书和育人的双重任务，对学生的个性心理品质培养，行为习惯的培养，以及学习态度培养起着巨大的作用。因此，让每一个班主任上岗前就具备扎实的理论知识和先进的管理理念，不能再摸着石头过河，这样浪费的是学生的时间，同时有可能让学生丧失学习的兴趣。

1.2.4 PAL基因表达分析 根据获得的PAL基因序列设计实时荧光定量PCR特异引物PAL-F：A A C G G C G A G A A C G A G A A G AA，PAL-R：C G A A T C G G T A C A A T G G G T A GG，使用的仪器为BIO-RAD IQ5实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad Laboratories, Inc., USA)。根据SYBR® Green PCR Master Mix说明书配制PCR反应体系，每个样品设3次重复。反应体系：SYBR Green Master I 10 μL，上、下游引物(5 μmol·L-1)各1 μL，模板1 μL，加去离子水至20 μL。PCR反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性 10 s，58℃退火30 s，72℃延伸15 s，40个循环；最后退火至55℃，每隔7 s上升0.5℃至95℃，共81个循环。以石榴Actin(GU376750.1)为内参，每个基因扩增均有内参同时扩增，默认条件下读取Ct值，采用2-ΔΔCT法[14]进行数据分析。

会上，长庆油田、新疆油田、华北油田被评为全国质量管理小组活动优秀企业，大庆钻探工程公司钻井二公司我爱创新QC 小组获得40 周年QC 标杆小组称号，7 名石油员工获得全国质量管理小组活动组织40 周年杰出推进者称号。

由图10可知，2个石榴品种发育期果皮中PAL基因相对表达量随着发育天数的增加呈先降低后升高的变化趋势，均在7月15日出现峰值。显著性分析表明，在整个发育期，同一时期泰山红果皮中PAL基因表达水平均明显高于泰山三白甜。在第50～第80天时，泰山红果皮中PAL基因表达量与其他时期差异极显著(P<0.01)。在第50、第60和第120天时，泰山三白甜果皮中PAL基因表达量与其他时期差异极显著(P<0.01)。

1.3 数据分析

利用Mircrosoft Excel 2007软件作图，SPSS 19.0软件的Duncan′s multiple range test法进行PAL基因表达量、褐变度和花青苷含量差异显著性分析。利用SPSS19.0软件进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 PAL基因cDNA片段克隆

以石榴cDNA为模板，扩增获得525 bp中间片段序列(图2-A)；基于中间片段的2次扩增，分别获得 1 417 bp的3′序列(图2-B)和511 bp的5′序列(图2-C)。

  

注：A: 中间片段扩增产物；B：3′ RACE扩增产物；C：5′ RACE扩增产物；D：全长PCR扩增产物。Note: M: DL2000 marker. A: Amplification of conserved fragment. B: Amplification of 3′ RACE. C: Amplification of 5′ RACE. D: PCR amplification product of full length.图2 石榴PAL基因PCR扩增Fig.2 PCR amplification of PAL gene

利用DNAMAN 软件将5′端和3′端序列与中间片段进行拼接，获得长为2 453 bp的cDNA序列。根据拼接后的全长cDNA序列设计包含完整ORF的PAL基因引物，扩增得到长2 205 bp的ORF序列(图2-D)，与拼接结果序列完全一致，共编码734个氨基酸(图3)。该基因氨基酸序列中含有苯丙氨酸和组氨酸解氨酶保守结构的标志性模式(216～232位)，序列为GTITASGDLVPLSYIAG，包埋在酶的活性中心(图3)。

利用NCBI 网站BLAST 进行序列比对，PAL基因核苷酸序列与龙血树(Dracaena cambodiana，ID：JN377585.1)、巨桉(Eucalyptus grandis，ID：XM_010069013.2)和大叶桉(Eucalyptus robusta，ID：AB696677.1)的相似性分别为81%、79%和78%。该基因编码的氨基酸序列与金合欢(Acacia koa，ID：AOX49212.1)、葡萄(Vitis vinifera，ID：XP_002268256.1)和苹果(Malus domestica，ID：XP_008387584.1)的PAL基因相似性较高，分别为90%、89%和85%，表明克隆得到的cDNA序列是石榴PAL基因，GenBank登录号为KY094504。

  

注：方框内是起始密码子ATG和终止密码子TGA； GTITASGDLVPLSYIAG为苯丙氨酸和组氨酸解氨酶保守结构。Note: The initiation codon (ATG) and termination codon (TGA) were labeled by box. GTITASGDLVPLSYIAG is the conserved structure of phenylalanine and histidine ammonia-lyases.图3 石榴PAL 基因的核苷酸及推测的氨基酸序列Fig.3 The nucleotide and deduced amino acid sequence of PAL gene from pomegranate

2.2 PAL蛋白基本理化性质分析

2.2.1 PAL蛋白保守结构域分析 对PAL编码蛋白的保守结构域分析表明，石榴PAL蛋白具有苯丙氨酸解氨酶PLN02457特异性结合位点和PLN02457超家族(图4)。

2.2.2 PAL蛋白序列分析 ProtParam分析表明，石榴PAL蛋白的预测分子质量为79 693.87 Da，等电点(pI)为6.19，分子式为C3506H5601N987O1070S31，负电荷氨基酸残基总数(Asp+Glu)为80，正电荷氨基酸残基总数(Arg+Lys)为71，不稳定系数为33.80，是一类稳定蛋白，脂溶性指数为88.68，亲水性平均数为-0.173。

2.2.3 PAL蛋白疏水性/亲水性预测 ProtScale分析表明，PAL蛋白存在明显的疏水区和亲水区，其中第300位最高，为2.422，第625位最低，为-3.100，表明PAL蛋白为亲水性蛋白(图5)。

1.2.3 PAL基因生物信息学分析 克隆获得的中间片段、3′RACE和5′RACE序列采用DNAMAN软件拼接，同时进行多序列比对和系统进化树分析；基因序列的开放阅读框(open reading frame，ORF)和编码的蛋白质序列采用ORF finder预测；采用NCBI进行基因核苷酸和氨基酸序列相似性分析；蛋白保守结构域采用CDD软件分析；蛋白质的理化性质采用Expasy Protparam分析；蛋白质的疏水性/亲水性采用ProtScale分析；蛋白质的磷酸化位点采用NetPhos分析；蛋白质的二级结构采用SOPMA预测。

2.2.4 PAL氨基酸序列翻译后的磷酸化修饰预测 蛋白质磷酸化是一种最普遍、最重要的蛋白翻译后修饰方式。一般多肽链中的氨基酸潜在的磷酸化位点越多，发挥更多功能的可能性越大[25]。NetPhos分析表明，PAL存在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3个磷酸化位点(图6)。各个磷酸化位点的数目存在差异，其中丝氨酸磷酸化位点32个，苏氨酸磷酸化位点22个，酪氨酸磷酸化位点7个。

2018年也是浙江自然资源管理具有里程碑意义的一年。省自然资源厅在这轮机构改革中应运而生，肩负起“统一行使全民所有自然资源资产所有者职责，统一行使所有国土空间用途管制和生态保护修复职责”新使命，浙江自然资源事业站在了新的历史起点上。省委、省政府对我们寄予厚望，人民群众对我们充满期待。

2.2.5 PAL蛋白二级结构预测 分析石榴PAL编码蛋白的二级结构发现，有349个氨基酸参与形成 α-螺旋，占总氨基酸的47.55%；有224个氨基酸参与形成无规则卷曲，占总氨基酸的30.52%；有94个氨基酸参与形成延伸链，占总氨基酸的12.81%；有67个氨基酸参与形成β-转角，占总氨基酸的9.13%(图7)。表明石榴PAL编码蛋白二级结构中含有丰富的α-螺旋和无规则卷曲。

2.3 PAL蛋白序列的同源性与系统进化分析

利用DNAMAN软件对石榴与其他物种PAL编码的氨基酸序列进行多重比较分析，发现石榴与其他物种之间存在较高的同源性，均含有苯丙氨酸和组氨酸解氨酶的保守结构域，说明不同植物PAL蛋白含有高度保守序列，但存在长度差异性和组成变异性(图8)。

为研究石榴与其他物种PAL的进化关系，根据10个PAL基因的氨基酸序列构建系统进化树。由图9可知，石榴与葡萄、白桦、金合欢、刺槐PAL蛋白聚为一大类，又单独为一小类，这可能与其物种特异性有关。苹果和梨同属于蔷薇科(Rosaceae)聚为一类。

为大力宣传水法，普及水法律知识，促进水法规的贯彻实施，水利部于1988年6月确定每年的7月1日至7日为“中国水周”，集中开展水法规宣传活动。考虑到“世界水日”与“中国水周”的主旨和内容基本相同，从1994年开始，水利部将“中国水周”的时间调整到每年的3月22日至28日。两项活动时间的重合，加大了水法规宣传活动的力度。

由图11-A可知，2个石榴品种果实发育期内果皮褐变度均随着发育天数的增加而逐渐降低。在整个发育期，同一时期泰山三白甜果皮褐变度明显高于泰山红。泰山三白甜各发育期果皮褐变度差异均极显著(P<0.01)。果实发育第50～第110天，泰山红果皮褐变度与其他时期差异极显著(P<0.01)，第120、第130天时，泰山红果皮褐变度与其他时期差异显著(P<0.05)。

2.4 不同石榴品种PAL基因表达分析

1.2.5 石榴果皮花青苷和褐变度测定 石榴果皮褐变度测定参照冯立娟等[9]的方法，花青苷含量测定采用盐酸乙醇提取比色法[24]进行。

2.5 不同石榴品种发育期果皮褐变度和花青苷变化分析

通过对课程历史挂科比例、学生往期成绩、出勤状况、课堂评学、作业情况等数据的分析，进行学业预警，督促学生提前准备，避免学业危机，帮助学生更好地完成学业。2016年9月至12月，使用翻转校园点名2.4万堂课，签到人次达92万。共上传课程5000+，查看次数超50万；建立题库总数超10万，平均每月内使用学生人次达20万，涉及课程1200+；全校2万多名学生30万课次预测，每月自动更新；学期初出勤率为81%，学期末达到96%，到课率提高15%；课外学习时间平均增加1小时，全校挂科率下降了2%。

由表2可知，泰山红PAL基因表达量与花青苷含量呈极显著负相关(P<0.01)，与褐变度呈极显著正相关(P<0.01)。泰山三白甜PAL基因表达量与花青苷含量呈正相关但不显著，与褐变度呈显著正相关(P<0.05)。表明石榴PAL基因与果皮褐变和花青苷合成密切相关。

2.6 相关性分析

由图11-B可知，2个石榴品种果实发育期果皮中花青苷含量变化趋势不一致，泰山红花青苷含量随发育天数的增加逐渐增加，在130 d时达到最高。在果实发育第110、第120和第130天时，泰山红果皮花青苷含量与其他时期差异显著(P<0.05)。整个发育期，泰山三白甜果皮花青苷含量各时期变化幅度较小，且各发育期间差异不显著。整个发育期，泰山红果皮花青苷含量明显高于泰山三白甜。

教师给学生的榜样作用非常重要。学生对教师充满敬意，对教师满怀期望和强烈的好奇心。教师的一言一行都对学生产生重要的影响。所以，给学生上课要做好充分的准备，给学生展现出最好的精神状态和足球教学技能，取得学生对教师良好印象，为以后的教师威信的树立打下良好的基础。反之，足球课没有充分的准备，教师就容易出现各种错误或者紧张等情绪，给足球课堂造成不必要的影响。

3.4 ROS ROS是细胞代谢过程中产生的一系列不稳定、高活性氧分子化合物的统称，包括O2-、-OH等。研究发现，动物模型中衰老动物心脏中ROS的产生显著增加；而过表达超氧化物歧化酶可减轻衰老心脏的氧化应激损伤，减缓心脏衰老相关纤维化[31]，提示氧化应激可通过调节胶原合成和代谢来调节细胞外基质的量和质[32]。此外，ROS可介导细胞因子、炎症介质以及AngⅡ的生成，诱导成纤维细胞转化、增殖以及分泌[33]，在衰老相关纤维化中起重要作用。ROS通过介导趋化因子上调，诱导微血管内皮中黏附分子的表达增加，使老化心肌中单个核细胞和成纤维细胞祖细胞募集，进而导致纤维化[34]。

 

表2 相关性分析Table 2 Correlation analysis

  

品种Cultivar基因Gene花青苷Anthocyanin褐变度Browningdegree泰山红TaishanhongPAL-0 849∗∗0 936∗∗泰山三白甜TaishansanbaitianPAL0 5850 698∗

注：*表示在0.05水平相关性显著，**表示在0.01水平相关性极显著。

Note: *means significant correlation at 0.05 level. **means significant correlation at 0.01 level.

3 讨论

前人研究表明，GenBank数据库中所报道物种的PAL同源基因全长cDNA序列长度为2 096～2 650 bp，编码628～730个氨基酸[26]。本研究从石榴果皮中克隆得到PAL基因，ORF序列长度为2 205 bp，编码734个氨基酸，与已报道PAL基因长度范围基本相符。PAL编码蛋白中存在苯丙氨酸和组氨酸解氨酶保守结构域，序列为GTITASGDLVPLSYIAG，这与甘蔗[19]、美洲南瓜[25]和白桦[27]上的研究结果一致。

  

图4 石榴PAL基因编码蛋白的保守结构域Fig.4 Conservative domains of PAL encoding protein in pomegranate

  

图5 石榴PAL蛋白疏水性/亲水性预测Fig.5 Prediction of the hydrophobic/hydrophilic of PAL in pomegranate

细胞内蛋白质磷酸化与信号转导密切相关，其磷酸化部位主要包括丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸结合位点[28]。本研究中，石榴PAL蛋白中丝氨酸磷酸化位点31个，苏氨酸磷酸化位点21个，酪氨酸磷酸化位点7个，表明多数PAL蛋白是在丝氨酸和苏氨酸残基上磷酸化，少数在酪氨酸位置上被磷酸化。PAL磷酸化后可改变蛋白质的活性，这种改变在植物生理生化应答反应过程中起重要作用[28]。

本研究中，2个品种果皮中PAL基因相对表达量均呈先降低后升高的变化趋势，在幼果期最高，这与鸭梨[3]上的研究结果一致，同时与Cheng等[8]认为2个石榴品种果皮中PAL活性在幼果期最高的结论相一致，进一步从分子和生理水平明确PAL作为合成酚类物质的关键酶参与石榴幼果期木质素、花青素等次生代谢物质的合成。此外，本研究中泰山红整个发育期内果皮中PAL基因相对表达量均高于泰山三白甜，这可能与泰山红果皮厚呈红色，需要较高PAL激活花青苷和木质素等物质的合成，而泰山三白甜果皮薄呈白色，所需PAL较低相关[9]。石榴发育期PAL基因表达量与其果实褐变呈密切正相关，这与Cheng等[8]在鸭梨上的研究结果一致。PAL在一定程度上影响石榴果实中花青苷的合成，存在品种差异性，这与越橘[7]上的研究结果一致。

为了筹集粮食，红军建立了严密有力的组织体系，成立了专门的粮食委员会，积极为红军部队、后方机关、医院等筹粮。地方设有粮食部，专管筹粮工作，西北联邦政府和省苏维埃、县苏维埃、乡苏维埃都有粮食委员会，形成强大的筹粮工作网络，对粮食进行统一的保管（粮库）、运输、分配，实行定量供给。这些组织在筹粮工作中起到了关键的作用。

  

图6 石榴PAL氨基酸序列翻译后的磷酸化修饰预测Fig.6 Phosphorylation site prediction of PAL in pomegranate

  

注：A：α-螺旋；B：延伸链；C：无规则卷曲；D：β-转角。Note: A: Alpha helix. B: Extended strand. C: Random coil. D: Beta turn.图7 石榴PAL蛋白二级结构预测Fig.7 Prediction of the hydrophobic/hydrophilic of PAL protein in pomegranate

  

注：PgPAL：石榴；VvPAL：葡萄， XP_002268256.1；AkPAL：金合欢，AOX49212.1；BpPAL：白桦，AKN79308.1；JcPAL：麻疯树，XP_012082374.1；MdPAL：苹果，XP_008387584.1；PbPAL：梨，NP_001306736.1；PtPAL：毛白杨，AKE81098.1；RpPAL：刺槐，ACF94716.1；TcPAL： 可可，XP_007027354.1。黄色方框表示苯丙氨酸和组氨酸解氨酶保守结构区域。下同。Note: PgPAL: Punica granatum. VvPAL: Vitis vinifera, XP_002268256.1. AkPAL: Acacia koa, AOX49212.1. BpPAL: Betula platyphylla, AKN79308.1. JcPAL: Jatropha curcas, XP_012082374.1. MdPAL: Malus domestica, XP_008387584.1. PbPAL: Pyrus x bretschneideri, NP_001306736.1. PtPAL: Populus tomentosa, AKE81098.1. RpPAL: Robinia pseudoacacia, ACF94716.1. TcPAL: Theobroma cacao, XP_ 007027354.1. The yellow box shows the label coding of phenylalanine and histidine ammonia-lyase. The same as following.图8 石榴与其他植物PAL氨基酸序列的多重比较Fig.8 Multiple alignment of deduced PAL amino acids sequences from pomegranate and other plants

目前，陆地棉中已鉴定出13种不同的PAL基因[4]，拟南芥[29]和小麦[5]中均克隆出4种PAL基因，鸭梨[3]和杏[30]中得到2种PAL基因，其表达具有组织特异性和时空表达差异性。本研究从石榴果实中只克隆出1种PAL基因，是否存在其他类型的PAL基因，其在石榴叶片、花和根等部位中的表达仍需更深入的研究。

大量研究表明，PAL基因的表达受生物和非生物胁迫的影响，如机械损伤[31-32]、UV-B照射[31, 33]、冷害[8, 32]、脱落酸[32-33]和水杨酸[32-33]等。石榴果皮中PAL基因在调控花青苷和木质素代谢过程中具体受哪些因素的影响目前尚不明确。今后可系统分析UV-B照射对石榴果实中PAL基因调控花青苷合成的影响，冷藏对石榴果实中PAL基因调控木质素代谢的影响等。

  

图9 石榴与其他植物PAL蛋白的系统进化树分析Fig.9 Phylogenetic analysis of PAL protein from pomegranate and other plants

  

注：TSH：泰山红，TSSBT：泰山三白甜。*表示同一品种不同发育期PAL的相对表达量在0.05水平差异显著，**表示同一品种不同发育期PAL的表达量在0.01水平差异极显著。下同。Note: TSH: Taishanhong. TSSBT: Taishansanbaitian. * means the PAL expression level of the same cultivar was significantly difference at 0.05 level in different development period. ** means the PAL expression level of the same cultivar was significantly difference at 0.01 level in different development period. The same as following.图10 不同石榴品种发育期果皮PAL 基因表达分析Fig.10 Expression analysis of PAL gene in different pomegranate cultivars with development

  

图11 不同石榴品种发育期果皮褐变度和花青苷含量变化分析Fig.11 Changes analysis of peel browning degree and anthocyanin content in different pomegranate cultivars with development

4 结论

本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆了石榴PAL基因的全长cDNA序列，其ORF序列长2 205 bp，编码734个氨基酸，具有典型的苯丙氨酸和组氨酸解氨酶保守结构域、PLN02457特异结合位点和PLN02457超家族保守结构域。泰山红和泰山三白甜果实发育过程中，PAL基因相对表达量呈先降低后升高的变化趋势，表达水平存在品种差异性。泰山红抗褐变能力强于泰山三白甜，前者花青苷含量明显高于后者。石榴PAL基因表达水平与花青苷合成、果实褐变密切相关。本研究结果为揭示石榴果实呈色和褐变机理奠定了理论基础。

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