茶叶作为当今全球四大饮品之一，最早起源于中国，经过千年历史的变革，形成了当代独特的茶文化体系[1]。饮茶，不仅是生活中的一种重要休闲方式和传统习惯，更是一种简便、大众化的保健选择[2-3]。研究表明，茶叶中富含抗氧化功能的茶多酚类化合物，能够有效清除人体产生的有害自由基，延缓组织衰老,降低心血管疾病的发生[4-5]。此外，茶叶中还含有多种生命活动所需的维生素、氨基酸及微量矿物元素[6-7]。中国是茶叶的主要生产国和出口国，茶叶品种繁多，采茶和制茶工艺复杂多样，口感风味各异，加之中国幅员辽阔，不同品种、产区之间形成各具特色的品牌产品[8-9]。西湖龙井茶是最具代表性的绿茶之一，是“中国十大名茶”，在国内外都享有盛誉，其具有的优良品质和深厚的文化底蕴提升了西湖龙井茶的商业价值，在国内外市场竞争中占据优势[10-11]。然而，近年来，不法商贩的假冒掺杂活动，严重损害了西湖龙井茶的品牌信誉，扰乱正常的市场秩序，打击消费者的信心[12-13]。为提升政府职能部门市场监管能力，维护合法经营者及广大消费者的利益，建立有效、稳定的产地判别策略保护地理标志特色的西湖龙井茶极为迫切[14-16]。

近年来，基于稳定同位素特征分析的产地溯源方法已发展成为保护地理标志特色农产品的重要手段[17-21]，通过同位素比率质谱(isotope ratio mass spectrometry，IRMS)测定农产品中总体或某个特征组分的稳定同位素比值(如δ13C、δ15N、δ2H和δ18O等)，从而实现农产品的产地溯源和真实性鉴别。不同于传统的基于特征组分含量测定的判别策略，稳定同位素特征与地理因素(如土壤、大气和水源等)更为密切相关，且受人为活动(如施肥等)的影响较小，从而保证了判别结果的有效性和稳定性[22-23]。因此，稳定同位素特征作为大米[24-25]、小麦[26]、葡萄酒[27]等初加工或未加工地理标志保护农产品的重要指标得到了广泛认可。值得关注的是，为改善和提高茶叶的成茶率和质量，鲜茶叶常需要进行更为复杂的加工处理，其中，杀青和干燥是茶叶初加工中最为关键的工序[28-29]。研究发现，化学物质在加热、蒸发和精馏过程中可能出现不可控的同位素分馏现象，导致碳同位素比率(δ13C)出现±2.0‰的偏差，而其他同位素的分馏变化则更为剧烈，这为茶叶产地溯源的有效性及判别模型的稳定性提出了难题[30-31]。同时茶叶样品(鲜叶到干茶)很难在采样现场完成，如果严格按照西湖龙井茶加工工艺制备费时费力，难以满足试验要求。因此，研究不同烘干方式茶叶中稳定同位素特征的变化，评估其对溯源判别模型稳定性和准确性的影响，具有积极的现实意义与应用价值。

总体来看，水政监察部门在执法过程中还存在一系列的问题，比如执法机关滥用手中权力，公民在执法机关执法过程中忽视了行使自己的权利以及在自己的权利受损害后不能得到及时救济等等。

本研究探讨5种烘干方式(烘箱直接杀青烘干、微波杀青扁形机烘干、微波杀青烘箱烘干、扁形机杀青直接烘干和扁形机杀青摊晾烘干)下西湖龙井茶中4种稳定同位素比率(δ13C、δ15N、δ2H和δ18O)特征的变化，并应用数学统计分析(one-way ANOVA)和椭圆联合置信区间域(elliptical joint confidence region，EJCR)测试评估其是否具有显著性差异，并通过线性判别分析(linear discriminant analysis，LDA)方法验证该特征变化对茶叶产地溯源判别模型稳定性和准确性的影响，旨在探索新的西湖龙井茶地理标志产品确证技术，识别非法误标行为，为政府市场监管提供有效的手段，从而确保西湖龙井茶生产企业和消费者的正当权益。

1 材料与方法

1.1 样本烘干处理

本试验所用龙井群体种(Camellia sinensis cv longjingzhong)鲜叶样品采自浙江省杭州市西湖区渤兰湾农场(30.18°N，120.10°E)，分别采用烘箱直接杀青烘干(HX)、微波杀青扁形机烘干(WB)、微波杀青烘箱烘干(WH)、扁形机杀青直接烘干(BB)和扁形机杀青摊晾烘干(BT)处理，每处理设5个平行，每份茶叶样本制备采集大约500.0 g干茶，样本的详细烘干方式信息如表1所示。

 

表1 西湖龙井茶5种烘干方式的详细信息Table 1 The detailed information of five drying techniques of Westlake Longjing tea

  

烘干方式Dryingmethod样本序号SampleNo．杀青步骤Fixationstep干燥步骤Dryingstep投样量Samplevolume/(kg·批-1)仪器型号InstrumenttypeHX1～560 0min内加热到105℃杀青降温到60℃烘干30min2 0CT⁃C型烘箱WB6～10微波杀青1 5min(30s翻动一次)摊晾，扁形机150℃炒干2 0QH-80PW-8X型微波杀青机WH11～15微波杀青1 5min(30s翻动一次)摊晾，烘箱60～70℃烘干3h2 0QH-80PW-8X型微波杀青机，CT⁃C型烘箱BB16～20扁形机200℃杀青直接炒干至八成，摊晾后150℃烘干20min2 06CCB-78ZD型扁形机，CT⁃C型烘箱BT21～25扁形机200℃杀青摊晾，150℃烘干30min2 06CCB-78ZD型扁形机，CT⁃C型烘箱

随机采集山东产区40个成茶样本(其中日照15个、青岛崂山15个、胶南10个)和重庆产区35个成茶样本(其中巴南15个、永川10个、万盛10个)，用于评估不同烘干方式西湖龙井与其他产区茶叶产地溯源判别模型有效性和稳定性。所有茶叶样品经粉碎机粉碎后过80目网筛，收集精细粉末用于稳定同位素检测。

1.2 稳定同位素比率检测

本研究构建25个西湖龙井茶样本和40个山东、35个重庆产区茶叶的LDA分析模型，进一步评估不同烘干方式对茶叶产地溯源有效性及判别模型稳定性的影响。3个产地的100个茶叶样本和4个稳定同位素比率构成一个大小为100×4的数据矩阵，通过Monte-Carlo方法随机抽取90%的样本作为训练集，基于类间方差最大，同时类内方差最小的原理构建线性判别模型，剩余10%的样本作为测试集验证模型的可靠性，循环2 000次，计算总体判别准确度。

通过单因素方差分析的boxplot图可以更全面、直观地反映不同烘干方式西湖龙井茶样本间的差异。由图1可知，对δ13C而言，HX、WB、WH 3种烘干方式对茶叶中碳素影响相似，而BB和BT则均导致比率值升高，δ15N也呈相似变化趋势。对δ18O而言，除WH处理的茶叶的比率值出现较大幅度降低外，其他烘干方式对茶叶中氧元素的影响较小，比率值基本接近。而对于δ2H，5种烘干方式茶叶间出现较大差异，尤其是BB加工的茶叶中δ2H出现显著降低，这可能是由于茶叶杀青和干燥过程中水分的交换比有机成分变化更为显著，从而导致δ2H出现较大幅度的变化。

1.2.3 稳定同位素比率计算 由于元素重同位素自然丰度相对较低，仪器获取的稳定同位素比率值(R)极小，国际上通常采用将已知同位素比率的标准品作为参照，计算未知样本中稳定同位素比率的相对值。

由图2-A、B可知，在δ13C和δ15N两因素EJCR测试中，仅第25号样本和第9号样本出现在95%的置信椭圆外，而在δ2H和δ18O两因素椭圆区间测试中，也只有第25号样本和第19号样本出现在95%的置信椭圆外，5种加工工艺的西湖龙井茶样本依然大体上分布在两因素的95%置信椭圆内。由图2-C、D可知，在δ13C、δ15N和δ2H三因素EJCR间测试中，第25号样本和第9号样本同样的分布在95%的置信椭球外，而在δ13C、δ15N和δ18O的三因素EJCR间测试中，只第25号样本分布在95%的置信椭球外，5种烘干方式的西湖龙井茶样本依然大体分布在三因素的95%置信椭球内。由两因素和三因素EJCR测试可知，虽然不同烘干方式的西湖龙井茶样本间4种稳定同位素比率出现差异，但除几个样本外，多数茶叶样本依然集中分布在95%的置信区间，且随着两变量增加到三变量，仅第25号样本可以被认为是异常样本。由此可知，尽管不同烘干方式能够引起西湖龙井茶中稳定同位素比率出现变化，然而这种变化并不会导致茶叶样本出现显著性差异，这为基于稳定同位素的产地溯源和判别模型构建提供了理论基础和可行性。

单因素方差分析比较不同烘干方式西湖龙井茶中4种稳定同位素均值，初步观察了单个变量的变化及茶叶样本间的差异。然而，单个变量的比较无法全面地考察样本中稳定同位素的整体变化趋势。此外，单个样本变量的异常也会造成均值统计的不可估性。为解决这一难题，本研究采用两因素和三因素EJCR测试评估不同烘干方式对西湖龙井茶中稳定同位素的影响。对δ13C和δ15N、δ2H和δ18O分别作为两因素EJCR测试如图2-A、B所示，而对δ13C、δ15N和δ2H，δ13C、δ15N和δ18O分别作三因素EJCR测试如图2-C、D所示。

δ=[(R样品/R标准)-1]×1000‰

由表2可知，不同烘干方式西湖龙井茶间稳定同位素比率的均值出现变化，其中，δ13C和δ18O的均值总体间差异较小(<±0.5‰)，分别保持在-27.71‰～-27.47‰和14.05‰～14.99‰之间，δ15N的均值总体在5.95‰～6.30‰，不同烘干方式间变化并不显著，与文献[32]报道一致。而δ2H的均值出现较大差异(标准偏差>±6.00‰)，HX茶叶δ2H均值最高，为-100.75‰，WH、WB、BT较接近，而BB最低，为-107.55‰，与其他4种加工工艺相比差异最大。5种烘干方式西湖龙井茶中测定的稳定同位素比率值与文献[16]报道不一致，其中，δ2H和δ18O值相比均偏低。这主要归因于稳定同位素比率不仅受茶叶生长当年降雨量、气候的影响，还与栽培地点海拔高度和茶叶品种(如龙井43、群体种和长叶)等因素相关。因此，本研究只分析同一地块、同批次茶叶不同烘干方式对其δ13C、δ15N、δ18O和δ2H的影响。

微课的实际运用过程中，为提高应用效果，就要和教学内容相结合来评估指标，通过加强课件内容的质量监控，才能真正保障微课运用的整体质量.做好微课课件内容的审核工作，查看课件内容和教学的要求是不是符合，以及在技术层面有没有存在问题，这些都是提高微课运用质量的基础.

1.3 数据处理

25个西湖龙井茶样本测量4个稳定同位素比率可构成大小为25×4(样本×变量)的数据矩阵。为比较不同烘干方式茶叶样本间稳定同位素比率的变化，首先应用单因素方差分析(one-way ANOVA)逐一考察δ13C、δ15N、δ2H和δ18O均值之间的变化；然后，通过椭圆置信区间(EJCR)测试分别评估2个和3个稳定同位素比率变化对茶叶样本差异性的影响；最后结合山东和重庆产区的茶叶样本数据，构建大小为100×4的数据矩阵(样本×变量)，采用有监督模式的线性判别分析(LDA)，评估对茶叶产地溯源模型准确性和稳定性的影响。单因素方差分析在SPSS 18.0上实现，椭圆置信区间测试和线性判别分析通过MATLAB 2009b软件进行，所有程序均由农业部农产品信息溯源重点实验室编写。

2 结果与分析

2.1 单因素方差分析

式中，R样品为所测样品中重同位素与轻同位素丰度比，即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H；R标准为国际标准样品中重同位素与轻同位素丰度比，δ13C的相对标准为VPDB、δ15N的相对标准为Air、δ18O和δ2H的相对标准为VSMOW。

 

表2 5种烘干方式对西湖龙井茶叶中δ13C、δ15N、δ18O和δ2H的影响Table 2 Effects of five drying techniques on the δ13C、δ15N、δ18O and δ2H in Westlake Longjing tea

  

烘干方式Dryingmethod样本数Numberofsample平均值±标准偏差Meanvalue±standarddeviation/‰δ13Cδ15Nδ2Hδ18OHX5-27 47±0 04a6 12±0 09ab-100 75±0 87a14 69±0 34aWB5-27 50±0 09a6 30±0 26a-103 36±0 59b14 97±0 10aWH5-27 49±0 05a6 22±0 09a-102 37±1 32b14 05±0 17bBB5-27 66±0 12b5 95±0 10b-107 55±1 41c14 94±0 42aBT5-27 71±0 06b6 21±0 17a-103 61±1 10b14 99±0 50a

注：不同小写字母表示样本间差异显著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters represent significant difference among samples at 0.05 level.

1.2.2 氧、氢稳定同位素测定 采用元素分析仪/高温裂解-同位素比率质谱(elemental analyzer/high temperature pyrolysis-isotope ratio mass spectrometry，EA/HT-IRMS)测定茶叶样品中的δ18O和δ2H值。称取0.30～0.60 mg茶叶样品，用银杯(4 mm ×4 mm ×11 mm)包好后按顺序放入120位自动进样器中将样品送入元素分析仪中，经燃烧炉高温裂解后，产生的CO和H2进入同位素质谱仪进行检测。具体参数如下：氦气流量为125 mL·min-1，燃烧炉温度为 1 450℃；同位素质谱检测时间设置为950 s，O2和H2作参考气。

  

图1 5种烘干方式西湖龙井茶的δ13C、δ15N、δ2H和δ18O单因素方差分析boxplot图Fig.1 One-way ANOVA boxplot of δ13C、δ15N、δ2H and δ18O in Westlake Longjing tea of five drying techniques

2.2 椭圆置信区间测试

实施案例教学时，应将案例提前一周发放给学生，以便学生查阅资料，开展课前的小组讨论、分析。课堂上教师引导学生围绕相关案例进行讨论后，根据案例对操作目的、步骤要点、注意事项等进行示教；学生根据案例进行模拟操作，如操作前对病人、环境等进行评估，对病人或其家属进行相关解释说明，对实验用物、环境进行准备，根据案例情景就解决问题的技术进行训练，操作过程中注意人文关怀，操作完毕进行健康教育；最后教师进行归纳、总结。

稳定性同位素比率计算公式：

目前，大部分独立学院借用其他一般本科院校就业指导工作模式，这显然不符合独立学院发展的规律和培养目标[2]。因此，构建有特色的独立学院“大学生职业发展与就业指导”课程体系，有针对性地开展有特色的就业指导课教学和实践，开发适用独立学院的培养大学生职业发展力和打造就业力的指导体系成为必然趋势[2]。

  

图2 不同烘干方式西湖龙井茶样本稳定同位素的两因素(A-B)和三因素(C-D)椭圆置信区间测试Fig.2 Two-factor (A-B) and three-factor (C-D) EJCR test of stable isotopes in Westlake Longjing tea samples of different drying techniques

2.3 西湖龙井茶与其他产区茶叶产地溯源线性判别分析

1.2.1 碳、氮稳定同位素测定 采用德国艾力蒙塔公司元素分析仪-同位素比率质谱(elemental analyzer-isotope ratio mass spectrometry，EA-IRMS)测定茶叶总的δ13C和δ15N值。称取2.0～4.0 mg (确保检测信号强度在2～10 nA范围内)待测样放入锡箔杯(4 mm ×4 mm ×11 mm)中，通过自动进样器进入Elementar vario PYRO cube元素分析仪(德国Elementar公司)中，样品中的碳元素和氮元素转化为纯净的CO2和N2气体后，经稀释后进入Isoprime 100同位素质谱仪(英国isoprime公司)检测。具体参数如下：元素分析仪的氧化炉和还原炉温度分别为920℃和600℃，氦气吹扫流量为230 mL·min-1；同位素质谱检测时间设置为550 s，N2和CO2作参考气。

由图3可知，样本4个稳定同位素变量构建2个正交的线性判别函数(Function 1和Function 2)，在这2个线性判别函数的新坐标系中，3个产区茶叶可以明显区分开来，其中右边为山东产区茶叶，左上角和左下角分别为重庆产区和西湖龙井茶叶。不同烘干方式造成西湖龙井茶样本相对于山东和重庆产区茶叶分布更为分散，但并不影响3个产区茶叶间的明显区分。然后，通过测试集验证该模型的判别准确度，通过蒙特卡洛(Monte-Carlo method)随机循环运行2 000次，3个产区茶叶在构建的LDA模型中的整体判别准确度如表3所示。与西湖龙井茶相近经度的山东产区茶叶和相近纬度的重庆产区茶叶判别的准确度均在90%以上，误判为西湖龙井的概率分别低至0%和5.8%，而西湖龙井茶整体判别的准确度在训练集和测试集中分别高达95.8%和94.1%，误判为其他产区茶叶的概率低于4.2%和5.9%。

改革开放以来，随着中国法治化与民主化进程的不断推进，海外学者对中国法治建设的研究热情逐渐高涨。有学者将海外学界对中国法治的总体评价归纳为三种观点，即中国在政治民主化方面并没有取得很大进展；中国仍处于走出法律工具主义的进程且尚未成为一个“法治”国家；中国的法治具有中国特色的国家社会主义法治的特性。[32]还有学者认为，受制于对中国国情的了解程度以及主观价值偏好等因素，海外学者对中国法治建设的研究存在一定的局限性。[33]

由此可知，不同的烘干方式会对西湖龙井茶中单个稳定同位素比率产生影响，从而引起少数样本出现差异，但基于多个稳定同位素比率变量的产地溯源线性判别分析，这种细微的差异可以通过数学统计的方式忽略，从而实现不同产区茶叶原产地的溯源，获取准确、有效、稳定的判别结果，以减少不同生产企业或加工方式造成的差异。因此，虽然不同烘干方式对茶叶中稳定同位素特征有影响，但对产地溯源判别模型准确性和稳定性的影响并不显著。

第三、表1中学生评教工作的初衷是为了褒奖和促进教师教学的积极性，需要体现教师的认真负责和严格要求学生的正能量，教育本身包含有约束管教的使命，因此这种方法依然有继续使用的价值和意义，但需要做出以下两方面的调整：①对学生评教的内容进行调整，引导学生积极正面地评价教学；②降低和减小学生评教结果对教师综合评价的百分比。

  

图3 西湖龙井茶、山东产区茶叶和重庆产区茶叶的产地溯源线性判别分析Fig.3 LDA scattering plot of origin traceability of Westlake Longjing tea and tea from Shandong and Chongqing

 

表3 西湖龙井茶(浙江杭州)、山东产区茶叶和重庆产区茶叶的产地溯源判别准确度Table 3 Discriminant accuracy of origin traceability of Westlake Longjing tea (Hangzhou, Zhejiang) and tea from Shandong and Chongqing

  

数据集Dataset产区Area样本数Numberofsample判别准确度Discriminantaccuracy/%山东Shangdong重庆Chongqing西湖Westlakeregion训练集Trainingset山东Shangdong3699 40 60 0重庆Chongqing331 493 15 5西湖Westlakeregion240 04 295 8测试集Testingset山东Shangdong496 23 80 0重庆Chongqing22 791 55 8西湖Westlakeregion10 05 994 1

3 讨论

近年来，基于稳定同位素特征的茶叶产地溯源技术已成为茶叶地理标志保护的重要手段[33-34]。评估不同加工工艺对茶叶中稳定同位素特征的影响是确保产地溯源有效性及判别模型稳定性的先决条件。研究表明，不同加工方式(杀青、烘干)不会导致茶叶中δ15N出现显著性差异[32]。目前，基于稳定同位素分析的西湖龙井茶产地溯源的研究主要集中在实际应用上，而不同加工工艺导致茶叶中稳定同位素产生的分馏效应可能对产地溯源模型稳健性的影响仍缺乏相关基础性研究[35-36]。本研究通过同时比较5种烘干方式的西湖龙井茶叶中4种稳定同位素比率(δ15N、δ13C、δ2H和δ18O)变化，利用数学统计分析方法更全面地探讨了不同烘干方式对茶叶中稳定同位素特征和其产地溯源的影响。与前人[32]研究相比，本研究利用多种数据处理方法不仅对不同加工方式导致茶叶中单个因素的差异进行了评价，同时还评估多因素变化所引起的样本间是否存在显著性差异。单因素方差分析发现不同烘干方式对西湖龙井茶中δ15N、δ13C和δ18O的影响较小，而对δ2H的影响较大，初步推断这是由于茶叶烘干过程中水分交换比有机质的变化更为剧烈。通过进一步采用两因素和三因素EJCR测试，探讨上述变化是否导致不同烘干方式茶叶样本间存在显著性差异。结果表明，虽然不同烘干方式引起茶叶中单个稳定同位素比率出现较大变化，但这种变化并未导致样本间出现显著性差异。说明采用化学计量学模式识别策略，建立茶叶中稳定同位素特征的产地溯源线性判别模型，能够获得准确的判别结果。由此可见，即使西湖龙井茶采用不同烘干方式制备，依然可以通过其稳定同位素特征进行产地溯源研究，这为茶叶产地溯源技术的应用提供了理论基础。本研究仅评估了不同加工方式对同批次西湖龙井茶中稳定同位素的影响，而不同采摘季节、不同储存年份、甚至不同保存方式对茶叶中稳定同位素特征可能出现的变化仍有待进一步探讨，这为西湖龙井茶地理标志产品产地溯源与确证技术的发展提出了新的亟待解决的难题[37]。

4 结论

本研究通过单因素方差分析EJCR测试分别评估5种烘干方式(烘箱直接杀青烘干、微波杀青扁形机烘干、微波杀青烘箱烘干、扁形机杀青直接烘干和扁形机杀青摊晾烘干)西湖龙井茶中δ13C、δ15N、δ2H和δ18O 4种稳定同位素比率的差异，发现不同烘干方式可能会对西湖龙井茶叶中稳定同位素比率产生影响，其中δ13C、δ15N和δ18O的变化极为微小，而由于杀青和干燥过程中主要是茶叶中水分的交换，因此δ2H变化相对更为明显。在不同烘干方式导致稳定同位素存在细微差异的情况下，通过线性判别分析依然能够实现西湖龙井茶和山东、重庆产区茶叶的准确区分。综上，即使采用不同的烘干方式，西湖龙井茶中稳定同位素特征依然可以作为一种可靠、有效和稳定的参数指标用于茶叶产地溯源研究。

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