多囊卵巢综合征 （polycystic ovary syndrome,PCOS）是病因尚不明确的异质性、进行性、难治性的妇科内分泌疾病。其临床表现以高雄激素血症为普遍特征，涉及月经失调、不孕、肥胖、多毛、痤疮等诸多方面[1]。此外，PCOS还通常伴有或引发多种并发症，如，胰岛素抵抗，子宫内膜癌、高血压、代谢性综合症以及心血管系统疾病[2-3]。西医认为卵巢颗粒细胞凋亡与PCOS排卵障碍具有密切关系[4-5]。最近研究发现，高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)介导了胰岛素抵抗 （insulin resistant,IR）诱导的卵巢颗粒细胞凋亡[6]。本文旨在研究体外PCOS模型中HMGB1促进胰岛素抵抗诱导的卵巢颗粒细胞凋亡的相关通路及其具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雌性SD大鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK（沪）2013-0003），SPF 级，鼠龄 3～4 周，体质量 50～100 g。 室温 18～20 ℃，湿度为65%～70%，自由进食饮水。

1.1.2 主要试剂 DMEM/F12培养基 （GIBCO公司），孕马血清促性腺激素（宁波第二激素厂产品），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）。合成的si-HMGB1(货号：1027280）购自德国 QIAGEN公司。青霉素、链霉素，HMGB1试剂（H4652-1MG），葡萄糖含量检测试剂盒（Lot#SLBH0679V），雄激素（12850）购自美国Sigma公司。pNF-kBp65检测试剂盒（ab176647），TNF-α 检测试剂盒（ab46070），HMGB1抗体（ab79823），IkBa 抗体（ab32518）购自英国 ABCAM公司。 pIkBa 抗体 （#5209），Caspase3 抗体（#9662P），Cleaved Caspase3 抗体（#9661S）购自美国CST公司。辣根过氧化酶标记的二抗（A0208，A0216）购自碧云天公司。

1.1.3 主要仪器 MK3型酶标仪 （美国Thermo公司），Autoblotsystem 20型全自动蛋白印迹仪 （新加坡Genelabs公司）。

4～6月树冠上部相对湿度逐渐降低，随着树体的扩大，叶片量增加，7月有所提高，8月空气相对湿度急剧升高，进入9月又快速下降；树冠上部相对湿度较低，5月有所回升，6月最低。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠卵巢颗粒细胞的原代分离 SD大鼠（10只）腹腔注射 PMSG（8～10 U）48 h 后腹腔麻醉，无菌条件下迅速取出双侧卵巢，用PBS缓冲液清洗3次，在体视显微镜下去除其周围脂肪和被膜，用1 mL注射器针头刺破卵泡使颗粒细胞和卵母细胞释放出来，加入1 g/L透明质酸酶消化使颗粒细胞与卵母细胞分离，用孔径为200目筛网过滤，1 000 r/min离心5 min。弃上清,用PBS缓冲液清洗3次，加入基础培养液 (DMEN/F12培养基+100 U/mL青霉素+100 μg/mL 链霉素+0.5 μg/mL 两性霉素 2B+体积分数10%FBS)重悬，而后计数，鉴定，活力测定。

1.2.2 多囊卵巢综合征细胞模型的建立[6]及分组 分离获得的大鼠卵巢颗粒细胞原代培养5 d后，传代培养至60%时，加葡萄糖（glucose）和胰岛素（insulin）处理48 h，收集细胞用于下一步实验。体外培养大鼠卵巢颗粒细胞的IR模型，分组设置分别为对照组（+glucose4.5 g/L， -insulin），IR0.1 μmol/L 组 （+glucose4.5 g/L，+insulin0.1 μmol/L），IR0.5 μmol/L 组（+glucose4.5 g/L， +insulin0.5 μmol/L），IR1.0 μmol/L 组（+glucose4.5 g/L，+insulin1.0 μmol/L）。

体外检测不同浓度HMGB1刺激对卵巢颗粒细胞的影响，设置分组为对照组,HMGB1低浓度组（10 ng/mL），HMGB1 中浓度组(60 ng/mL)，HMGB1 高浓度组(150 ng/mL)。

检测IR的卵巢颗粒细胞通过HMGB1介导炎性及凋亡效应，设置分组为：IR(-)+Si-HMGB1(-)组，IR(-)+Si-HMGB1(50 nmol/L)组 ，IR(1.0 μmol/L)+Si-HMGB1(-)组，IR(1.0 μmol/L)+Si-HMGB1(50 nmol/L)组。

本工程金属屋面造型曲线、弧线较多，薄弱部位防渗漏问题不易控制。金属屋面在温差大，长期暴晒、降雨、外力与形变等因素影响下多种材料伸缩变形不一致，致使水平搭接，垂直搭接，伸出屋面管道，采光板四周等防水薄弱部位产生渗透，我项目经过多方的考察研究论证，采用丙烯酸高弹防水涂料施工工艺，延长屋面的使用寿命，改善并保证了建筑物的使用功能，进一步拓展了金属屋面的应用领域。

1.2.3 ELISA法测定葡萄糖、HMGB1、雄激素（andro gen）、 肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-a，TNF-α）、核因子 kB（nuclear factor kB，NF-kB）p65的含量 将样品上样至96孔板，室温孵育1～2 h，PBS洗板，加一抗，室温孵育2 h，PBS洗板，加二抗，室温孵育1 h，加显色液，450 nm波长读值并计算。不同试剂盒按说明节操作。

通过以上比较可以看出，市辖区在带动县域经济发展时，各项指标的驱动力相差不大，其耦合关联度基本上在0.5以上，具有较高的关联性。县域经济指标对城市经济发展有明显差异，它们的促进作用差距较大，其中第二产业与市辖区经济指标的平均总和关联度仅有0.17。

1.2.4 Western blot 检 测 IkBa、pIkBa、Caspase3 和Cleaved Casepase3的蛋白表达 不同细胞分组后处理48 h，收集细胞，RIPA裂解液裂解，提取总蛋白，测定总蛋白浓度。并取等量蛋白上样，电转膜后，脱脂奶粉室温封闭1 h，加对应一抗（详见试剂，1∶1 000-1∶5 000 稀释），室温孵育 3 h，TBST 清洗，加相应二抗 （详见试剂，1∶1 000-1∶2 000 稀释） 室温孵育45 min到1 h，ECL发光试剂盒显色，扫描并统计分析灰度值。

1.3 统计学分析

用SPSS l7．0统计软件分析数据，数据分析为差异统计学，以标准差“±s”表示，各组间比较用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P＜0.05代表差异具有统计学意义，P＜0.01代表差异具有显著统计学意义。出现聚集生长的特征，形成胚胎干细胞样集落。图1显示大鼠卵巢颗粒细胞的原代分离比较成功。

  

图1 倒置显微镜下大鼠原代卵巢颗粒细胞分离2 d，5 d和10 d后培养效果图（×200）

2 结果

2.1 卵巢颗粒细胞的原代分离及培养

大鼠原代卵巢细胞分离后，刚开始接种时颗粒细胞呈球形,10 h后贴壁生长，培养24 h后,形态不规则,呈多角形或梭形(图1∶5 d)。培养10 d时可铺满皿底，形成单层的颗粒细胞(图1∶10 d)。部分颗粒细胞还

2.2 PCOS卵巢颗粒细胞模型的构建

胰岛素对卵巢颗粒细胞的影响，加入不同浓度的胰岛素培养48 h后，收集并裂解细胞，检测其细胞因子发现高浓度胰岛素处理细胞后，会导致PCOS特征性因素葡萄糖相比未加胰岛素对照组明显降低（P＜0.05），雄激素较对照组明显升高(P＜0.01)；同时相关炎症因子HMGB1、TNF-α较对照组明显升高 (P＜0.01)，并激活转录因子NF-kB p65使其磷酸化程度较对照组明显升高 (P＜0.05)。由此可见，HMGB1，TNF-α和NF-kB均被胰岛素正向调控，呈现表达量明显上升。显示本实验建立的PCOS细胞模型相对有代表性[6]，且胰岛素过高造成的IR可能与炎症反应及NF-kB通路直接相关。见图2。

中国近几年尤其关注自主知识产权的问题，国家鼓励企业、教育机构、公益机构、政府等多部门进行创新，各个部门的创新带动整个地域的创新，提高当地的区域创新能力，进而实现当地GDP的提高，提高人民生活的幸福感。

2.3 HMGB1介导p-IkBa和TNF-α表达升高

[2]EVANTHIA DK,ANDREA D.Insulin resistance and the polycystic ovary syndrome revisited:an update on mechanisms and implications[J].Endocrine Reviews,2012,33(6):981-1030.

1.2.5 避免选择下肢静脉穿刺。在术中注意保护血管,为避免反复穿刺,可以在术前选择留置针,穿刺时尽量缩短扎止血带的时间,减轻对局部和远端血管的损害下肢血栓发生率是上肢的3倍,应该尽量选择上肢静脉穿刺,避免下肢静脉内膜再损伤加速DVT形成;输液过程中严格执行无菌操作,避免感染,减少微粒进入静脉形成微血栓的概率。并且交由经验较为丰富的护理人员对患者进行穿刺,提高一次成功率。

  

图2 胰岛素处理对大鼠卵巢颗粒细胞的影响

 

注：（a）不同胰岛素影响的葡萄糖含量变化；（b）不同胰岛素影响的HMGB1含量变化；（c）不同胰岛素影响的TNF-a含量变化；（d）不同胰岛素影响的pNF-kb p65含量变化；（e）不同胰岛素影响的雄激素含量变化。**P＜0.01，*P＜0.05

  

图3 HMGB1体外作用对大鼠卵巢颗粒细胞影响

 

注：（a）IkBa 和 pIkBa 的免疫印迹结果；（b）IkBa 和 pIkBa 蛋白的相对表达量；（c）TNF-α 的含量变化；（d）pNF-kB p65 的含量变化；（e）雄激素的含量变化。 **P＜0.01,*P＜0.05

2.4 在PCOS卵巢颗粒细胞模型中HMGB1通过TNF-α/NF-kB通路促进细胞凋亡

当IR的卵巢颗粒细胞中加入HMGB1的干扰小分子，则发现IR带来的炎症现象得到有效缓解。与IR对照组相比，雄激素、Cleaved Caspase-3、TNF-α、磷酸化IkBa和磷酸化NF-kB p65的表达量都发生了显著性下降 (P＜0.05 or P＜0.01)，更加确定了HMGB1在此过程中起重要作用。见图4。

  

图4 HMGB1对胰岛素抵抗的卵巢颗粒细胞的影响

 

注：(a)免疫印迹结果；(b)免疫印迹结果灰度值分析结果；(c)不同分组的TNF-α表达量；(d)不同分组的pNF-kB p65 含量；(e)不同分组的雄激素含量。 *P＜0.05，**P＜0.01

3 讨论

50%～90%的PCOS患者存在IR、高胰岛素血症，使得其发生代谢综合征、II型糖尿病、心血管疾病的风险较普通人群增加5～10倍 [1]。深入探索PCOS患者高雄激素水平与糖脂代谢失衡之间的关系，对该疾病的风险预测及早期干预治疗具有重要意义。

土地使用权贷款与土地出让金正相关，如图2所示。土地出让面积从1997年的6 641.7万平方米开始逐年增加至2011年44 327.44万平方米的顶峰，之后逐渐回落，2017年为25 508万平方米。与此同时，土地购置费逐渐攀升，从1997年的247.6亿元逐步增长至2016年的18 778.68亿元。

[4]赵 娜，杨正望，全春梅.多囊卵巢综合征临床分型与中医证型的相关性分析[J].湖南中医药大学学报，2017，37(9):966-968.

[5]LI L， MO H， ZHANG J， et al.The role of heat shock protein 90B1 in patients with polycystic ovary syndrome.picard D，ed[J].PLoS ONE， 2016，11(4):e0152837.

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在本研究中发现IR的卵巢颗粒模型细胞中HMGB1水平较正常对照组表达明显增加。而当IR的卵巢颗粒细胞中加入HMGB1的干扰小分子，则发现IR带来的副作用得到缓解。较IR对照组而言，雄激素明显下降以及凋亡明显降低 （Cleaved Caspase3），建议可作为PCOS治疗的靶点。TNF-α、磷酸化IkBa和磷酸化NF-kB p65的表达量较对照组显著性下降，提示PCOS与炎症反应相关，并经HMGB1参与NF-kB通道，该机制可能参与了PCOS的发病。

参考文献：

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随着HMGB1浓度升高，雄激素、磷酸化IkBa、磷酸化NF-kB p65和TNF-α的表达量都较对照组明显升高(P＜0.05 or P＜0.01)。 见图3。

[3]邢 玉，刘艳霞，佟 庆.中医药辨证治疗多囊卵巢综合征临床研究进展[J].环球中医药，2016,9(7):887-891.

有研究表明PCOS患者中炎症因子水平升高，在其发生发展的过程中存在低度慢性炎症[6]。目前发现和PCOS密切相关的有c反应蛋白 (c-reactive protein，CRP)、 白细胞介素 6 （interleukin-6，IL-6）、TNF-α、NF-kB等慢性炎症因子的异常 [7-8]。其中TNF-α是一种非糖化蛋白[8-10]，由多种炎症细胞合成和分泌，可通过多种机制调节组织释放TNF-α，而TNF-α可以通过多种作用机制影响胰岛素的敏感性，是重要的IR介质：它可以减少胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）的酪氨酸磷酸化，抑制胰岛素信号向IRS-1的传导[11-12]；下调多种脂肪细胞中多种细胞分子和蛋白表达，导致IR。研究发现，PCOS患者TNF-α水平显著高于正常人群[4]，且肥胖者升高更明显[13]。

TNF-α能够诱导NF-kB结合雄激素受体启动子，使其活性增加，降低颗粒细胞芳香酶活性，使得雄性激素转化成雌激素减少，引起高雄激素血症[14]。NF-kB的激活使得炎症因子表达增多，IR水平加重，雄激素水平升高，诱导PCOS的产生。而NF-kB通路中最关键的上游因子即为HMGB1。

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[7]戴金颖，张 军，袁 洁,等.脂肪组织与2型糖尿病胰岛素抵抗的研究进展[J].湖南中医杂志，2017，219(5):186-188.

HMGB1是较新发现的一种炎性细胞因子，普遍存在于大多数的哺乳动物细胞的细胞核中，参与细胞核内多种生物学功能[15]。胞外的HMGB1能够通过不同的受体途径影响NF-kB的活性，发挥不同的生物学效应。除此以外，大量的研究证实，HMGB1与其受体相互作用，通过激活NF-kB等信号通路，介导了如IR等许多病理过程的发生[14-15]。

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[12]张淑芳，于 易，田晓蕾，等.妊娠糖尿病患者血清脂联素水平变化及其与炎症因子胰岛素抵抗的关系[J].河北医学，2015(2):272-275.

目前国内外均没有非洲猪瘟疫苗，也无治疗药物，不能进行疫苗免疫和药物治疗。一旦发病，只能采取无害化处理措施。主要原因是非洲猪瘟病毒基因型多样，病毒结构蛋白复杂，能在单核细胞和巨噬细胞内复制，具有宿主免疫逃避等特点。

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[13]王丽萍，方春霞，蔡文伟，等.PCOS患者AMH水平与肥胖、睾酮水平、胰岛素抵抗的相关性分析[J].浙江医学，2016，38(16):1354-1357.

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文化学角度。2018年9月10日，习近平总书记在全国教育大会上发表重要讲话，提倡“全党全社会要弘扬尊师重教的社会风尚，努力提高教师政治地位、社会地位、职业地位，让广大教师享有应有的社会声望，在教书育人岗位上为党和人民事业做出新的更大的贡献”。在全社会全力构建教师支持网络和建立良好公共信任的环境下，高校党政部门也应将基层行政管理人员纳入和教师同等重要的位置上，大力宣扬正面典型和先进形象，以此提高他们的自信，促进工作动力。高校教育管理部门和宣传部门应做好对在校师生的引导，使师生对高校基层行政管理人员有一个正确合理的认识。