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强心安神汤对慢性心衰大鼠AngⅡ及AT1mRNA表达的影响

更新时间:2009-03-28

慢性心力衰竭 (congestive heart failure,CHF)是一种常见的、多发的心脏疾病,现代医学的飞速发展,并没有降低慢性心衰的病死率。我院心内科在多年的中西医结合临床实践及实验中发现以“益气滋阴、强心安神”为法组方的“强心安神汤”治疗慢性心衰可以显著改善患者临床症状、体征及实验室指标,减轻心衰大鼠心肌细胞损伤[1-2]。本文观察强心安神汤对慢性心衰大鼠血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及AT1mRNA表达的影响,探讨其可能的作用机制,现将实验结果报道如下。

而高职院校近些年来新招的旅游专业教师大都是院校对接的青年教师,尽管这些教师受过系统的旅游专业的理论教育,但实践经验尚显不足。所以,为适应旅游行业的发展,高职院校一定要加强师资队伍建设,不断完善旅游专业教师的知识结构,进一步增强他们的实践能力[3]。同时,高职院校应鼓励和支持旅游专业教师到企业进行挂职实践,并积极进行实践创新型课题研究,从而加强对旅游行业发展状况的了解,为旅游专业提供更为科学合理的教学服务。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验药物 “强心安神汤”组成为:炙黄芪、制首乌、酸枣仁、阿胶、香加皮、葶苈子、三七、黄连、肉桂等,采用超微颗粒,由湖南春光九汇现代中药有限公司提供;盐酸阿霉素注射液(批号:1004E1),由浙江海正药业股份有限公司提供;生理盐水,由四川科伦大药厂生产;注射用水,由天津药业焦作有限公司生产;倍他乐克,由阿斯利康制药有限公司生产;卡托普利,由浙江南洋药业有限公司生产。

1.1.2 实验动物 Wistar大鼠80只,由湖南中医药大学动物中心提供,雌雄各半,体质量(200±20)g,随机分为造模组68只及空白组12只。饲料、垫料均由湖南中医药大学动物中心提供。动物实验室环境:温度20~25 ℃,湿度 45%~55%。

1.1.3 主要试剂与仪器设备 血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)检测试剂盒由北京北方生物技术研究所生产;RT-PCR试剂盒由宝生物工程(大连)有限公司生产。TC48/T/H(a)型PCR仪由杭州大和热磁电子有限公司生产;GE-100型水平电泳仪由杭州大和热磁电子有限公司生产。

1.2 实验方法

[5]郭志坤,武俊芳,单卫华,等.异丙肾上腺素诱导的大鼠肥厚心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达[J].解剖学报,2012,43(1):93-97.

[1]颜 旭,刘春华,蔡光先,等.超微强心安神汤治疗慢性心力衰竭48例疗效观察[J].湖南中医杂志,2011,27(2):1-3.

1.2.3 标本采集与检测 (1)血清AngⅡ测定:各组大鼠连续干预4周,于最后一次给药后禁食12 h,麻醉后于股静脉处采血6 mL,分别置于EDTA、肝素抗凝试管中,4℃、3 000 r/min离心,分离血浆,低温下保存待测,由湖南省中西结合医院免疫生化室完成。(2)心衰大鼠AT1 mRNA的检测:处死大鼠,取心肌组织75 mg置于DECP处理过的研钵内,倒入液氮,迅速研磨成粉末状,加入Trizol反应液1 mL裂解细胞,室温孵育5~10 min。加入氯仿0.2 mL,剧烈震荡15 s, 室温孵育3 min。 12 000 r/min,4 ℃离心15 min,收集无色上层水相于1.5 mL于另一离心管中,弃沉淀管,加入0.5 mL异丙醇,振荡混匀,室温孵育 5~10 min。 12 000 r/min,4 ℃离心 10 min,弃上清,加入1 mL 75%乙醇并振荡。9 000 r/min,4℃离心5 min,弃上清,空气中干燥5~10 min。加入20 μL DEPC处理的无RNA酶的水溶解RNA,置-70℃保存。以A260/280法检测RNA纯度及浓度表示无严重DNA污染,RNA纯度较高,样本无严重RNA降解,符合试验要求。按M-MLV逆转录酶说明书合成cDNA。引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 (具体见表1);扩增条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s;57℃退火40 s;72℃延伸40 s;35个循环扩增后,72℃延伸10 min。通过图像分析软件读取凝胶电泳条带光密度扫描值,将条带与内参电泳条带的比值作为目的基因m-RNA的表达量。即:mRNA相对表达=样品扫描值/内参扫描值。

 

表1 引物名称及序列

  

引物AT1 Forward AT1 Reverse GAPDH Forward GAPDH Reverse序列(5'-3')5′-TCCACCCAATGAAGTCTCGC-3′5′-GCACAATCGCCATAATTATC-3′5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′5′-ACAACCTGGTCCTCAGTGTA-3′长度348 bp 600 bp

1.3 数据处理及统计学分析

采用SPSS 15.0软件处理数据。计量资料采用“±s”进行统计描述。多组数据分析采用单因素方差分析检验,方差齐时采用最小显著差数法(LSD)法;方差不齐时选用Tamhane's T2法。取P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

参考文献

 

表2 各组大鼠AngⅡ含量及AT1 mRNA表达比较 (±s)

  

注:与空白组比较 **P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01;与西药组比较,△P<0.05,△△P<0.01。

 

组别空白组模型组西药组中药高剂量组中药低剂量组F值P值n 12 12 12 12 12 Ang Ⅱ(pg/mL)98.12±9.37 243.15±14.84**151.36±10.43##135.83±9.78△△##127.61±9.69△#298.3<0.01 AT1/GAPDH mRNA 1.83±0.37 3.96±0.54**3.17±0.49##2.29±0.41△△##2.45±0.47△#39.10<0.01

  

图1 AT1 mRNA电泳条带

 

注:左起各条带分别为空白组、模型组、西药组、中药高剂量组、中药低剂量组

  

图2 各组细胞的RNA1.5%琼脂电泳

 

注:左起各条带分别为空白组、模型组、西药组、中药高剂量组、中药低剂量组

3 讨论

现代医学研究发现,慢性心衰的基本机制是神经内分泌介导的心室重构,肾素-血管紧张素系统的过度激活促进了心衰的发生与发展[4]。肾素活性增加,作用于血管紧张素原,刺激血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)分泌增加,AngⅠ被ACE分解为AngⅡ,AngⅡ通过自分泌和(或)旁分泌机制作用于AT1来活化心肌细胞G蛋白与磷酯酰肌醇特异性磷酸脂酶C耦联,引起心肌细胞钙离子内流和胞浆内钙离子贮存池释放增加,表现为收缩血管,增强心肌收缩力,并诱导相关蛋白激酶激活,继而诱导蛋白质合成的增加,触发心肌肥大、纤维组织和血管增生。郭志坤等[5-7]研究证实,AngⅡ通过其特异的AT1受体介导,参与细胞增殖、迁移,最终导致血管壁及心肌增生肥厚,心室重构。何松坚[8]、徐建辉[9]、LI M[10]、杨艳峰[11]等人的研究表明,通过抑制肾素-血管紧张素系统过度激活,从而抑制AngⅡ引起的AT1 mRNA表达上调,可以阻断心肌肥厚的发生,改善早期心肌纤维化、减轻早期心室重构、改善预后。

为确保结果准确性,对模型进行帕克检验确定其是否具有异方差性。验证结果显示,F统计量的值为1.988844,Prob(F-statistic)=0.108443大于显著性水平α=0.05,说明模型不存在异方差性,证明模型不存在异方差性,模型设定完全可靠,回归分析结果可以作为分析结论以及政策建议的依据。

本实验研究结果表明:强心安神汤可显著降低大鼠血清的AngⅡ水平,抑制AT1 mRNA表达,与西药组及模型组比较差异有统计学意义(P<0.05),其作用结果无明显量-效依赖关系。本实验为临床应用强心安神汤治疗慢性心衰提供了一定的实验依据,但是,中药复方汤剂组分复杂,煎煮后可能产生更多的变化,因此强心安神汤除了对肾素-血管紧张素系统的影响以外,是否还有更多更重要的作用机制和作用靶点,还有待于进一步临床及实验研究。

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如表2和图1-2所示,模型组心衰大鼠AngⅡ水平及大鼠心肌组织AT1 mRNA表达显著高于空白组(P<0.01);分别给予强心安神汤及西药干预后,各干预组AngⅡ水平及AT1 mRNA表达均较模型组显著降低(P<0.05或P<0.01);强心安神汤高剂量组及低剂量组与西药组比较,AngⅡ水平及AT1 mRNA表达差异有统计学意义 (P<0.05或P<0.01)。而强心安神汤高、低剂量组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2.2 实验分组及干预 将复制心衰模型成功的55只大鼠,选取48只,随机分为模型组、西药对照组、强心安神汤高剂量组、强心安神汤低剂量组,另设一组作为空白组,每组12只,各组动物给予同等条件下饲养。空白组和模型组每日予以同等容量的生理盐水灌胃;西药组,将倍他乐克及卡托普利配制成水溶液,按 2.7 mg/(kg·d)灌胃;中药给药剂量按临床成人剂量×动物等效剂量系数换算后为强心安神汤低剂量组每日给药剂量,其4倍值为高剂量组每日给药剂量。具体为低剂量组按6.93 g/(kg·d)灌胃;高剂量组按 27.72 g/(kg·d)灌胃,连续干预 4 周。

[6]李 雅,郭志华,郭慧芳,等.心痛泰对冠心病大鼠肾素-血管紧张素-醛固酮系统及血管重塑的调控作用[J].湖南中医药大学学报,2017,37(9):943-946.

胃切除术引起的体内神经-内分泌紊乱可导致继发性PEI[8]。胃切除患者体内碳酸氢盐和脂肪酶分泌显著降低。胃部分切除患者 PEI的发生率约70%,全胃切除患者PEI发生率高达100%[9]。

[2]颜 旭,刘春华,庄 红,等.超微养心安神汤对慢性心力衰竭大鼠神经内分泌因子及心肌组织结构的影响[J].北京中医药,2016,35(7):660-663.

[3]李梅秀,田国忠,欧叶涛,等.大鼠阿霉素慢性心衰模型的制备与心衰指标的判定[J].解剖学研究,2005,27(3):176-178.

[4]RAM CV.Reappraisal of role of angiotensin receptor blockers in cardio-vascular protection[J].Vasc Health Risk Manag,2011,7:315-319.

慢性心衰属于中医学“心衰”范畴,既往主要根据临床表现分别归属于“心悸、胸痹、喘证、痰饮、水肿”等病证范畴。“心衰”病位在心,与肺、肾、脾关系密切。本病基本病机为“本虚标实,虚实夹杂”,本虚指“心气虚、心阳虚”,标实主要是寒凝、气滞、痰浊、水饮、瘀血。其中,心气亏虚为本病之始,心气亏虚导致气阴两虚,渐至心阳亏虚,阳虚血瘀,心阳虚损,累及肾阳,从而心肾阳虚,阳虚则寒痰凝滞,水湿不行,痰饮阻肺或阳虚水泛,阴竭阳脱。本病后期总是伴随心阴的损伤或心阴阳两虚。由此可见 “益气”与“滋阴”是治疗心衰的两个重要方面,而且心衰患者在长期的治疗过程中因利水消肿及温壮心阳叠进更加耗气伤阴从而导致心气阴亏虚尤甚。心阴(血)亏虚,血不养心,滋生内热,扰动心神;肾阴(精)亏虚,不能上济以“滋心阴、涵心阳”,以致心火内动,扰动心神。所以,可以认为“气阴两虚、心神不宁”是“心衰”中的一个常见证型,故以“益气滋阴,强心安神”立法,组方“强心安神汤”,以期标本同治之功。

1.2.1 Wistar大鼠慢性心衰模型的复制 根据文献[3],造模组采用腹腔内注射阿霉素法,第1~3周按3 mg/kg剂量进行腹腔注射,第4~6周按2 mg/kg剂量进行腹腔注射;1次/周,复制心力衰竭模型。空白组注射等容量生理盐水,每周1次,连续6周。每天观察记录大鼠的精神状态、活动、饮食、体质量的变化及呼吸频率等日常习惯的改变情况,6周后,根据大鼠行为方式的改变及心脏超声测量大鼠左室射血分数(LVEF)、左室收缩率(LVFS)及ELISA法检测大鼠血清脑利钠肽(BNP)水平的变化判断造模成功与否。

2018年亚太美容展开幕。2018年亚太展的场馆面积达到11.38万平方米,共有来自53个国家的3 030家企业参展,场馆面积和参展数量都在2017年的基础上增长了5%。来自亚洲的参展商数量较2017年增长近30%,其中韩国展商数量提升12%,日本展商数量增加28%。来自中国的展商数量占到整个亚太展的1/3左右,在2017年的基础上提升2%。中国电商平台天猫国际2018年也首次在亚太展亮相。

[7]LORENZO O, RAMIREZ E, PICATOSTE B, et a1.Alteration of energy sub-strates and ROS production in diabetic cardiomyopathy[J].Mediators of Inflammation, 2013,2013:461967.

为了解消费者对跨境进口电商网站标价方式的感知状况,帮助线上零售商选择最佳的网站商品标价方式和营销策略,以使商家与消费者的收益最大化,特此展开问卷调查。问卷内容主要涉及消费者对跨境电子商务零售进口税收政策的了解以及购物决策受线上零售商标价方式的影响程度。本次调查共发放纸质问卷60份,网络问卷110份,共回收170份,有效问卷150份,其中有购买过进口商品的有97份,没有购买过进口商品的有53份。

[8]何松坚,吴 铿,游 琼,等.厄贝沙坦联合缺血后适应对糖尿病大鼠缺血再灌注损伤早期心肌纤维化及心室重构的影响[J].临床医学工程,2015,22(3):279-282.

Breeding of purple-fleshed sweetpotato Nanzishu 014 and its cultivation

[9]徐建辉,杨 波.姜黄素对心力衰竭大鼠心脏AT1受体表达的影响[J].实用预防医学,2015,22(9):1069-1072.

[10]LI M,ZHENG C,KAWADA T,et al.Adding the acetylcholinesterase inhibitor,donepezil,to losartan treatment markedly improves long-term survival in rats with chronic heart failure[J].European Journal of Heart Failure,2014,16(10):1056-1065.

[11]杨艳峰,王献民,李 焰,等.AT1受体拮抗剂和ACEI对大鼠心肌肥厚时AT1 mRNA表达的影响[J].中国当代医药,2013,20(27):4-6.

 
颜旭,刘春华,庄红,陈琪,张婷,赵启,蔡雷
《湖南中医药大学学报》2018年第04期文献

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