慢加急肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是指在慢性肝病基础上，由于病毒、细菌感染，药物性肝损伤，机体炎症反应等因素刺激而发生的爆发性肝细胞大块或亚大块坏死，短时间内发生肝功能或多脏器功能衰竭的一组临床症候群[1]。ACLF是中国肝衰竭中常见的类型，因其症候复杂，变证多，兼夹证多，病情凶险，发展迅速，预后差，而成为中国临床亟待攻克的难题。因ACLF是在慢性肝病基础上发生的急性肝功能衰竭，从发病到肝衰竭有一定的过渡期，故如果在此期间进行预防性干预治疗，部分肝功能有可能逆转[2]。课题组前期采用截断逆挽方对ACLF大鼠模型进行预防治疗，结果验证该方可通过抑制肝细胞过度凋亡来保护肝功能及肝组织以达到延缓肝衰竭的目的[3-9]。本实验旨在通过观察截断逆挽方对E2F1介导的肝细胞增殖途径的影响，进一步探讨该方对ACLF大鼠的干预机制。

1　材料与方法

1.1　实验动物

Wistar雄性大鼠150只，SPF级，体重180～200 g，于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心采购，合格证号：SCXK(京)2014-0001。首都医科大学动物房饲养，每笼三只，水食由动物房提供，自由饮食，室温19～22℃，湿度为(48.0±3.0)%，12/12小时昼夜交替。

1.2　主要试剂

人血清白蛋白(HSA)A9731-5G；D-氨基半乳糖(D-GalN)，G0500-25G；脂多糖(LPS)109K4075均购自美国Sigma公司；Anti-E2F1(Abcam)；RNA Prep Pure动物组织总RNA提取试剂盒(离心柱型)(DP431)，TIAN Script cDNA第一链合成试剂盒(KP104)，Real Master Mix(SYBR Green)试剂盒(FP204)，50bpDNA Ladder(MD108)，MarkⅢ(MD103)，Gene Green 核酸染料(RT210)均购自天根生化科技有限公司。

1.3　药物

截断逆挽方：叶下珠30 g、瓜蒌30 g、金钱草30 g、生黄芪30 g、槲寄生30 g、三七6 g、莪术6 g、丹参20 g、生地黄20 g、炮附子15 g，药材购自北京同仁堂中药房，水煎浓缩成4.34 g/mL，4℃保存，使用前50℃水浴加热。

1.4　主要仪器

1-14高速离心机(美国Sigma)；Universal 320R低温离心机(Hettich)；F6/10超细匀浆器(Fluko)；EG720EAU-SS微波炉(美的)；Model680酶标仪(Bio-Rad)；165-8003s水平电泳仪(Bio-Rad)；165-8003垂直电泳仪(Bio-Rad)；170-3930湿转电转仪(Bio-Rad)；凝胶、化学发光成像分析仪；高衬度投射电子显微镜(日立HT7700)；TGem Plus全波长分光光度计。

1.5　ACLF大鼠模型的建立

与正常组相比，模型4小时组E2F1蛋白表达升高(P<0.05)，并随时间的推移呈逐渐降低趋势，至12小时表达最少，但仍较正常组略高，差异无统计学意义。与4、8小时模型组相比，截断逆挽方组蛋白表达有升高趋势，差异无统计学意义，而至12小时末表达量明显高于模型组(P<0.01)，见表1、图1。

6.坚持规范文明执法。坚持“法定职责必须为、法无授权不可为”，全面公开行政执法部门权责清单，明确执法主体、执法程序、执法事项范围，从制度上推动解决行政执法“不作为”“乱作为”问题。凡无法律依据的，一律不得开展执法检查，严防执法扰企。切实改进执法方式，增强服务意识，做到行为规范、程序规范。切实防止一些部门在执法中对民营企业采取“一刀切”等简单粗暴做法，对民营企业经营中的一般违法行为，要审慎研究、妥善处理，可以通过说服、建议、协商等手段解决的，要以教育为主，不能一味处罚、一罚了事，坚决避免对市场活动的过度干预。

1.6　分组与给药方法

课程目标是在一定时期范围内的长期教育目标，而课堂目标是短期的能够在课堂教学中实现的目标，但教师往往会搞混两者之间的概念。有的教师把情感态度价值观教育理想层面的长期目标视为课堂教学目标，例如“使学生喜欢英语”、“让学生感到学习英语的乐趣和信心”、“培养学生的英语思维”等，力图在一节课或几节课的时间就实现这些目标，实际上却难以实施，最终在课堂教学中落空。

急性攻击前，中药组根据课题组前期实验得出的最佳剂量[10]给予生药量为21.7 g/(kg·d)的截断逆挽方，浓度为4.34 g/mL连续灌胃三天，正常组及模型组给予同等剂量生理盐水灌胃。各组大鼠分别于急性攻击4、8、12小时后进行平行取材，每组每个时间点14只。另外模型、中药组各设24小时生存组各7只。大鼠麻醉后腹主动脉取血，摘取肝右叶同一部分置于2.5%戊二醛溶液固定以备电镜，余下部分于液氮中快速冻存待检测蛋白。

1.7　检测指标

1.7.2　实时荧光定量法检测Cdc25 mRNA的表达量　称取20 mg肝组织，加入300 uL组织裂解液充分研磨，根据动物组织总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。用全波长分光光度计检测总RNA的浓度和纯度，取A260/A280在1.8～2.2的RNA样品做下一步实验，利用2%琼脂糖凝胶检测其完整性。根据TIAN Script cDNA第一链合成试剂盒说明书将总RNA反转为cDNA。引物由TaKaRa公司设计并合成，引物序列为：上游：GTCAGAGCCTGCACCAACCA，下游：CCTGGGACCAGGAGTACAGACAA。依据95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，54℃退火10秒，72℃延伸10sec的原则进行定量实验，共循环40次。以基因β-actin为内参对照，引物序列为：上游：CCTAAGGCCAACGTGAAAA，下游：CAGAGGCATACAGGGACAACAC用2-△△Ct(Ct代表循环阈值)表示Cdc 25 mRNA相对表达量。

1.7.1　Western Blot法检测肝组织中E2F1蛋白的表达量　各组取6只大鼠肝组织50～100 mg进行匀浆、蛋白定量，按照蛋白定量试剂盒说明书步骤测定蛋白浓度。每支上样蛋白30 μg，经10%SDS-聚丙烯凝胶120V电泳分离1小时后300 mA电转1小时至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1小时，E2F1抗体(1∶500)4℃孵育过夜，TBST洗涤4次，每次5分钟。加二抗(1∶10000)室温孵育1小时，1×TBST洗膜4次，每次5分钟，凝胶、化学发光成像分析仪上分析条带。以β-actin作为参照蛋白，用ImageJ图像分析软件分析目标条带的灰度值，通过灰度比较的方法来确定目的蛋白相对于内参的表达量，以分析样本之间目的蛋白表达量差异。

为什么大部分学校并没有优先向普通学生开放呢？相对于社会上办的红红火火的体育俱乐部，中小学校建有体育俱乐部的数量为什么很少？这其中主要的阻力是什么呢？

③采用多站点的内容管理，实现信息的协同管理和多站点发布相结合。支持各子站独立地对信息进行维护和更新，同时也支持多站之间的协同工作，信息互相共享呈送，实现网站群内的数据信息协同维护。支持一个站点设置多个同步目标。

1.8　统计学处理

与正常组相比，模型4小时组Cdc25 mRNA表达量明显升高(P<0.05)，模型8、12小时组表达量虽高于正常组，但相对于4小时逐渐降低。与模型组相比，截断逆挽方组4、8小时组Cdc25 mRNA表达量有所升高，但无统计学意义，12小时截断逆挽方组表达量明显高于模型组(P<0.05)。见表2。

2　结果

2.1　截断逆挽方对ACLF大鼠肝组织E2F1蛋白表达的影响

参照刘旭华等[10]造模方法，造模分为两个阶段：(1)肝硬化模型阶段：将Wistar雄性大鼠150只，按Excel随机数字表分组法分为正常组10只和处理组140只，处理组采用皮下注射人血清白蛋白致敏，检测人血白蛋白抗体是否阳性，取阳性大鼠进行尾静脉注射人血清白蛋白，每次0.5 mL/只，每周两次。正常组大鼠注射同等剂量生理盐水，六周后对全部大鼠行肝活检。取肝纤维化三级以上大鼠继续尾静脉注射两周，最后成模98只，将98只成模大鼠随机分为模型组、中药组各49只；(2)慢加急肝衰竭模型阶段：模型组、中药组同时给药。

 

表1　各组大鼠E2F1表达IOD值比较±s，n=6)

  

组别E2F1表达IOD值4小时组8小时组12小时组正常组0．50±0．160．50±0．160．50±0．16模型组0．82±0．40a0．73±0．270．52±0．10截断逆挽方组0．97±0．470．75±0．351．26±0．37b

注： 与同一时间点模型组比较，aP<0.05；与正常组比较， bP<0.01。

 

注： A.正常组；B.截断逆挽方4小时组；C.截断逆挽方8小时组；D.截断逆挽方12小时组；E.模型4小时组；F.模型8小时组；G.模型12小时组

图1　Western Blot法检测大鼠各组肝组织E2F1蛋白表达情况

2.2　截断逆挽方对ACLF大鼠肝组织Cdc25 mRNA表达的影响

采用SPSS 20.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差±s)表示。方差齐时用LSD检验，方差不齐用Tamhane’s T2检验。P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示有极显著差异。

 

表2　各组大鼠Cdc25 mRNA表达量的比较±s，n=6)

  

组别Cdc25mRNA表达值4小时组8小时组12小时组正常组1．02±0．241．02±0．241．02±0．24模型组2．85±1．32a2．12±0．931．76±1．64截断逆挽方组3．05±1．112．49±1．283．41±2．27b

注： 与同一时间点模型组比较，aP<0.05；与正常组比较， bP<0.05。

2.3　截断逆挽方对大鼠肝细胞及线粒体超微结构的影响

正常组大鼠肝细胞膜完整，胞质均匀，细胞核圆且居中，胞质内可见丰富的粗面内质网、核糖体、线粒体等细胞器，线粒体形态多为圆形，嵴及双层膜结构完整。模型组4小时组大鼠肝细胞核染色质凝聚，粗面内质网脱颗粒，线粒体增多、聚集。模型8小时组可见核变形，染色质边集，胞质空淡，内质网扩张，线粒体形态发生变化，呈哑铃样改变，嵴内腔扩张。嵴断裂部分细胞内细胞器浓缩，形成高电子密度粗颗粒样凋亡小体，周围有空晕环绕，此时线粒体肿胀、聚集，基质中空，嵴乱而减少。模型12小时组可见肝细胞核皱缩呈不规则形或破裂，质膜破坏中断，kupffer细胞侵入坏死细胞内吞噬凋亡小体，粗面内质网明显脱颗粒及多聚体降解，线粒体皱缩，形成空泡化，外膜破裂。与对应时间点模型组相比，截断逆挽方组肝细胞超微结构损害较轻，肝细胞核变形不明显，细胞基质尚存，至急性攻击后12小时，内质网扩张脱颗粒，但尚未降解，凋亡小体形成较少，炎性细胞浸润情况较轻，线粒体肿胀变形，但尚可见到一定的嵴，双层膜结构完整。见图2、图3。

1.7.3　透射电镜观察肝细胞超微结构变化　肝脏标本经由2.5%戊二醛4℃固定两小时，经PB洗脱三次，每次10分钟。乙醇、丙醇脱水后，环氧树脂包埋、切片，饱和醋酸铀、枸橼酸铅双重染色，透射电镜观察肝细胞超微结构并拍照。

注： A.正常组肝细胞；B.模型4小时肝细胞；C.截断逆挽方4小时肝细胞；D.模型8小时肝细胞；E.截断逆挽方8小时肝细胞；F.模型12小时肝细胞；G.截断逆挽方12小时肝细胞

图2　各组大鼠肝细胞超微结构(Bar=2 μm)

 

注：A.正常组肝细胞；B.模型4小时肝细胞；C.截断逆挽方4小时肝细胞；D.模型8小时肝细胞；E.截断逆挽方8小时肝细胞； F.模型12小时肝细胞；G.截断逆挽方12小时肝细胞

图3　各组大鼠线粒体超微结构图(Bar=500 nm)

3　讨论

研究证明，ACLF的发生主要是由于体内炎性细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1分泌增多，导致炎症反应，从而引起肝细胞坏死、过度凋亡以及肝细胞增殖再生障碍[11-12]。课题组前期已证实截断逆挽方可有效的降低TNF-α、IL-6等炎性因子的表达，减少肝细胞坏死和凋亡[3-9]。本实验旨在从肝细胞增殖角度进一步探讨该方对ACLF大鼠肝脏的保护机制。

E2F1是细胞周期相关转录因子，在细胞从G0/G1进入到S期的过程中发挥着重要作用[13-14]。E2F1与分化调控因子蛋白DP1的复合物调控下游基因的表达，产生细胞进入S期所必须的蛋白产物，细胞周期调控因子Cdc25。正常情况下肝细胞为暂不增殖细胞群，在一些炎症因子的刺激作用下，肝细胞可重新进入细胞周期，此时E2F1与Cdc25表达上调，肝细胞增殖再生。本实验中，模型4小时组的肝组织中E2F1及Cdc25的表达量均显著高于正常组，推测这是由于肝细胞大量凋亡、坏死，刺激肝细胞重新进入细胞周期，E2F1及Cdc25的表达量增加。随着时间的推移，模型组8、12小时E2F1及Cdc25表达量逐渐降低，可见，随着时间的推移模型组的肝细胞增殖减弱，课题组前期实验结果显示，此时大鼠肝细胞凋亡逐渐增多，细胞凋亡增多，增殖减弱，则必然导致肝衰竭。与模型组比较，截断逆挽方4、8小时组E2F1及Cdc25表达量有上升趋势，但无统计学意义。12小时组E2F1及Cdc25表达量较模型组明显升高(P<0.05)，说明截断逆挽方可以通过调节E2F1及Cdc25表达量，促进肝细胞的代偿性增殖，其作用在12小时最明显。另外，通过电镜可以直观的看到，模型组大鼠肝细胞超微结构遭到了严重破坏，且随着时间的推移，损伤程度逐渐加重，至12小时细胞形态发生严重改变，细胞核碎裂，线粒体呈空泡化，凋亡小体形成。而各时间点截断逆挽方组细胞核、线粒体等超微结构变形损伤程度较模型组均有所减轻，凋亡小体形成较少。说明截断逆挽方对肝细胞超微结构有一定保护作用。

临床研究表明，ACLF的病位主要在肝、胆、脾、肾，病机以肝脾气虚、肝肾阴虚为本，湿热瘀毒胶着为标[15]。清热解毒化瘀兼调补肝脾肾是治疗ACLF的基本方法。其中调补肝脾肾为治本，清热解毒化瘀为治标。截断逆挽方是钱英教授临床治疗慢性重型肝炎的经验方，在临床取得了显著的疗效[16]。其主要功效为解毒化瘀，扶助正气，与ACLF病机相符。药理学研究[17-19]也表明叶下珠、金钱草、黄芪等有抗炎、抗病毒作用，三七、生地黄、丹参等有保肝护肾、抗血栓的作用。

（3）网络环境下企业财务会计管理的特征体现在虚拟化主体上，这是和传统的财务管理主体有着不同之处。网络环境下游诸多虚拟公司，对于市场环境变化所作出的反应也比较及时。在财务会计管理的组织结构以及管理的方式也发生了变化，如组织方式向着扁平化转变，扩大了企业财务管理范围。

综上所述，截断逆挽方能有效的减轻肝细胞超微结构的损伤程度，并能上调细胞增殖相关蛋白与基因的表达，促进肝细胞代偿性增殖，延缓肝衰竭，延长患者的生存时间。

参考文献

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