在慢性肝病中，持续的肝细胞损伤和炎症反应导致肝星状细胞活化，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积，形成肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)[1]。肝纤维化是重要的公共卫生问题之一，具有高发病率和高死亡率[2]，晚期可进展为肝硬化，目前国内外对肝硬化的治疗尚无特效药和方法。研究表明，肝纤维化是一种可逆性病变，在肝纤维化发展期去除损伤因素或应用抗肝纤维化药物，是可以部分或完全逆转恢复的[3-4]。肝星状细胞激活和转化为成纤维细胞是纤维化发生和发展的核心，因此，抑制肝星状细胞的活化成为逆转肝纤维化转变为肝硬化的关键所在[5-6]。一贯煎记载于魏玉璜的《续名医类案》，是临床治疗肝肾阴虚的代表方剂，更有实验表明，一贯煎具有保肝护肝，抑制肝纤维化等作用[7-10]。本实验用TGF-β1建立肝星状细胞活化模型[6]，通过研究一贯煎对肝星状细胞的活力、胶原蛋白表达和细胞周期的影响，探讨一贯煎抑制肝纤维化的作用机制。

1　材料与方法

1.1　细胞及动物

永生化大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)，购自北京普京康利科技有限公司，品牌为keygen凯基生物。

雄性Sprague-Dawlay大鼠45只。体重180～220 g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK(京)2016-0006，饲养于首都医科大学实验动物科学部SPF级动物室。

1.2　药物及试剂

一贯煎根据原方比例，于北京同仁堂药店选购标准中药材，北沙参9 g、麦冬9 g、当归9 g、生地黄20 g、枸杞子12 g、川楝子4.5 g，将饮片置煎煮容器内，加药材量约6倍的冷水浸泡1小时，煮沸30分钟，过滤并收集滤液。药渣加3倍量水继续煎煮，煮沸20分钟，过滤并收集滤液，将两次滤液合并为一贯煎浓缩液，待冷却后装入灭菌药瓶中，于4℃冰箱中保存备用。秋水仙碱片(西双版纳药业有限责任公司，国药准字：H53021369)。

DMEM培养基(corning，美国)、PBS(HyClone，美国)、胎牛血清(corning，美国)、cck8(Dojindo，日本)、Human TGF-β1(peprotech，美国)、蛋白质印迹法一抗：Anti-Collagen Type I abt123(Merck Millipore，美国)、Anti-Collagen Ⅲ antibody ab6310(abcam，美国)。

4.2 固定资产管理 固定资产管理是整个系统的核心部分，在该部分可以看到每台设备的详细状况，包括固定资产卡片、安装培训、验收、合同、招标、购置申请等整个生命周期的信息，具体运行效果见图5。

1.3　仪器

1.4.3　Cell Counting Kit-8( CCK-8) 法检测细胞活力　取指数生长期，生长状态良好的肝星状细胞，按每孔5000个细胞接种于96孔板中，每组设6个复孔。待细胞贴壁融合至50%～60%，更换无血清培养基饥饿培养24小时。正常组更换不含TGF-β1的无血清培养基，其他各组更换含TGF-β1的无血清培养基，培养24小时后各组更换含药血清，继续培养24小时，吸弃培养液，用PBS冲洗，每孔加100 μL含10%CCK-8的培养基培养，0.5小时后于450 nm波长处在酶标仪上测收值。重复3次。

1.4　方法

1.4.5　流式细胞仪检测细胞周期　取指数生长期，生长状态良好的肝星状细胞接种于细胞培养瓶中，每组3瓶，各组细胞含药血清培养结束后，消化并收集，PBS冲洗2次，1000转/分，离心5分钟，去上清。1 mL PBS悬浮缓慢滴入4 mL冰乙醇中，-20℃固定过夜。PBS 冲洗2次离心去上清。加入400 μL样品染色液(400 μL细胞染色液+15 μL PI+2 μL RNA酶)，37℃避光孵育30分钟。加100 μL PBS进行细胞周期检测并计算各期细胞百分率。实验重复3次。

取系统适用性溶液进样测定，在上述色谱条件下，理论板数按度洛西汀计为6 255，度洛西汀峰与杂质Ⅴ峰、杂质Ⅲ峰及杂质Ⅷ峰之间的分离度分别为 2.32，3.36 和 11.48。

与正常组比较，其余四组均有显著性差异(P<0.05)，其中模型组OD值显著增高(P<0.05)，提示造模成功。与模型组比较，阳性组、一贯煎小剂量组和一贯煎大剂量组OD值均有显著下降(P<0.05)，其中一贯煎大剂量组OD值下降最明显(P<0.05)且增殖抑制率最高。提示一贯煎具有抑制肝星状细胞活力的作用。见表1。

正置荧光显微镜(Lecia Qwin，德国)、低温离心机(Heraeus，Biofuge 15r)、 酶标仪(Bio-Rad Model680，美国)、垂直电泳槽(Bio-Rad，美国)、Fujifilm成像系统(LAS-3000，日本)、流式细胞仪(ACEA，美国)。

其中：C1—企业存款C2—储蓄存款C3—外汇存款C4—手持现金C5—用于证券期货基金外汇黄金投资持仓保证金

1.4.4　Western Blot法检测目的蛋白的表达　取指数生长期，生长状态良好的肝星状细胞接种于6孔板中，每组设3个复孔，各组细胞含药血清培养结束后，用PBS清洗3遍，加入预冷的细胞裂解液(RIPA和蛋白酶抑制剂混合液)，用细胞刮刮取细胞蛋白至离心管中，漩涡震荡30秒/次，每5分钟1次，共5次，12000转/分，4℃离心2分钟，收集上清液，得到蛋白。蛋白定量后，用5%浓缩胶90V电泳约20分钟，6%分离胶120V电泳至溴酚蓝到底，冰浴转膜，于室温下封闭1小时，分别加入到1∶2000稀释的COL-I一抗和1∶1000稀释的COL-Ⅲ一抗中，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10分钟，二抗室温孵育1小时，TBST洗膜3次后扫膜分析。实验重复3次。

与正常组比较，模型组COL-Ⅰ和COL-Ⅲ蛋白表达的最多(P<0.05)；与模型组比较，阳性组、一贯煎小剂量组和一贯煎大剂量组均有减少(P<0.05)，其中一贯煎大剂量组表达的最少。提示一贯煎具有抑制肝星状细胞COL-Ⅰ和COL-Ⅲ蛋白表达的作用。见图1和表2。

1.4.1　含药血清的制备　大鼠随机分为正常组、模型组、阳性组、一贯煎小剂量组和一贯煎大剂量组，每组9只。正常组和模型组每次每只大鼠灌服蒸馏水1 mL/100 g；阳性组灌服秋水仙碱溶液，给予成人用量的10倍1 mL/100 g(浓度为0.05 mg/mL)；一贯煎大剂量组给予成人用量的10倍1 mL/100 g；一贯煎小剂量组稀释一贯煎浓缩液，给予成人用量的5倍1 mL/100 g；以上各组分别灌服2次/天，间隔6小时，连续2天。第3天完成2次给药后，等待2小时，再次给药1小时，采用腹主动脉取血，室温静止2小时，3000 r/min 4℃离心20分钟，吸取上清液，0.22 um微孔滤膜过滤除菌，56℃水浴灭活30分钟，分装后-80℃保存备用。

1.4.2　细胞培养与分组　将复苏后的肝星状细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2的培养箱内培养，待细胞生长至指数期，按照1∶3比例传代，观察细胞生长状况，约1～2天更换培养基。待细胞生长至状态良好，将细胞随机分为5组，用不含血清的培养基饥饿培养24小时，使细胞周期同步。正常组更换不含TGF-β1的无血清培养基，其余各组更换含TGF-β1 (10 ng/mL)[11]的无血清培养基培养。24小时后各组更换含药血清，继续培养24小时。

1.5　统计学处理

采用SPSS 22.0对数据进行统计学处理，以均数±标准差±s)表示，组间差异的比较采用单因素方差分析法(One-way ANOVA)，方差齐采用LSD检验，方差不齐采用Dunnett-T3检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1　一贯煎对肝星状细胞活力的影响

与非侵袭性乳腺导管癌相比，在侵袭性乳腺导管癌中包括TEX14在内的86个CTAs mRNA表达量升高（P＜0.05），其中TEX14的升高倍数最大为3.344倍，见表1，图1。即TEX14在侵袭性乳腺导管癌中mRNA表达升高最明显。43个CTAs在侵袭性乳腺导管癌中mRNA表达量降低（P＜0.05）；另有89个CTAs在侵袭性乳腺导管癌中的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2　一贯煎对肝星状细胞COL-Ⅰ和COL-Ⅲ蛋白表达的影响

SA-DLLME用表面活性剂Triton X-114代替了DLLME中传统的有机分散剂。实验操作程序如下：准确移取待测元素标准工作液置于10 mL具塞离心管中，然后加入适量络合剂，充分摇荡后调节酸度，加入适量Triton X-114，加入萃取剂，用纯水定容至10 mL，充分振摇1 min。充分摇匀后，以3 000 r∕min的转速离心5 min。待水相和有机相完全分离后，弃去水相，用注射器小心抽取有机相10 μL注入非水相CVG反应器进行测定。

气体渗透系数的测定亦采用图4所示装置，根据RILEM推荐的Cembureau气体渗透法[18]进行，使用高纯N2作为渗透介质。气体渗透性测试之前，将切割好的混凝土试件放入105±5℃的YF101-2A型鼓风干燥箱中连续干燥48 h，取出冷却至室温后待测。测试过程的封蜡处理与上述水的渗透性测试相同；再将试样一端连通大气，另一端施加0.3 MPa的气体恒压，30 min(为确保试样内气体流速达到恒定状态)后测定气体流速。

 

表1　一贯煎对肝星状细胞OD值及增殖抑制率的影响±s，n=6)

  

分组OD值增殖抑制率/%正常组1．21±0．15-模型组1．98±0．23a-阳性组1．42±0．13ab46．85±2．20一贯煎小剂量组1．41±0．13ab46．90±0．64一贯煎大剂量组1．32±0．17ab54．58±2．26

注： 与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

 

注：A：正常组 B：模型组 C：阳性组 D：一贯煎小剂量组 E：一贯煎大剂量组

 

图1　各组细胞COL-I和COL-Ⅲ蛋白的表达

 

表2　一贯煎对肝星状细胞胶原蛋白表达的影响±s，n=3)

  

分组COL⁃ICOL⁃Ⅲ正常组0．134±0．0100．208±0．045模型组0．543±0．038a0．650±0．034a阳性组0．228±0．028ab0．394±0．069ab一贯煎小剂量组0．310±0．035ab0．351±0．031ab一贯煎大剂量组0．223±0．028abc0．299±0．008b

注： 与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与一贯煎小剂量组比较，cP<0.05。

2.3　一贯煎对肝星状细胞周期的影响

正常组与模型组细胞周期无统计学差异。与正常组和模型组比较，阳性组在G0/G1期和G2/M期细胞百分率均减少(P<0.05)，而在S期细胞百分率增加(P<0.05)。一贯煎小剂量组和一贯煎大剂量组在G0/G1期细胞百分率均减少(P<0.05)，而S期和G2/M期细胞百分率增加(P<0.05)。由此推测，阳性组可能通过将细胞周期阻滞于S期；一贯煎可能通过将细胞周期阻滞于S期和G2/M期，达到抑制肝星状细胞活化的目的。见图2和表3。

  

图2　一贯煎对肝星状细胞周期的影响

 

表3　一贯煎对肝星状细胞周期的影响±s，n=3)

  

分组G0/G1/%S/%G2/M/%正常组61．16±0．6019．69±1．1019．08±1．30模型组62．53±0．9618．34±0．7918．50±0．49阳性组36．96±1．12ab50．80±0．46ab11．95±0．70ab一贯煎小剂量组39．49±0．96ab28．70±0．62ab31．55±0．38ab一贯煎大剂量组39．05±1．32ab31．27±1．04abc29．37±0．30abc

注： 与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，b P<0.05；与一贯煎小剂量组比较，cP<0.05。

3　讨论

“证”是中医诊断疾病的基本理论和关键所在。中医学并无肝纤维化这个病名，根据其临床表现，可参考“胁痛”“肝积”“臌胀”“黄疸”等病证。病因可为久病耗伤、劳欲过度、饮食不节，或各种原因引起的精血亏虚。又因肝肾同源，肝藏血，肾藏精，精血互生，生理上相互影响，病理上一损俱损。肝肾功能失调，阴液亏虚，正气不足，病理呈现复杂的变化。《素问·经脉别论》所记载的“怯者则著而为病”，提示了“正虚”在发病中的重要影响。总之，肝肾阴虚为肝纤维化的关键所在[12-13]。

一贯煎由生地黄、北沙参、麦冬、当归、枸杞子、川楝子六味中药组成，方中生地黄配伍枸杞子滋阴壮水，补肝肾阴血；麦冬、沙参清补肝胃之阴； 当归辛香走散补血活血；川楝子疏泄肝热，制诸药滋腻。纵观全方补、清、疏并用，补而不腻，疏而不散，刚柔并济，相辅相成。其主治如《续名医类案》卷18所述：“胁痛，吞酸，吐酸，疝瘕，一切肝病。”可治疗肝肾阴虚证。现如今，一贯煎的临床应用亦非常广泛，如治疗慢性肝炎、慢性萎缩性胃炎、干燥综合征、肝硬化、肝癌等疾病[14-15]。曹健美等[16]研究结果表明一贯煎能够通过降低CCl4模型大鼠肝组织相关蛋白的表达，抑制CCl4大鼠肝纤维化肝细胞凋亡，从而实现保护肝脏避免实质细胞损伤。Lin等[17]研究发现，一贯煎可通过ROS介导内在的细胞凋亡途径，抑制α-SMA的表达，抑制肝星状细胞活化，从而达到抑制肝纤维化的目的。本课题组前期实验提示，一贯煎可以促进骨髓间充质干细胞改善病理肝组织，缓解肝纤维化大鼠的阴虚证症状[18]；一贯煎汤剂能降低I型胶原在肝细胞外的沉积，进而改善肝脏结构环境，并且可以通过调节MMP-1/TIMP-1，降解胶原纤维从而达到抗肝纤维化的目的[19-20]。

TGF-β1可通过活化肝星状细胞，增加细胞外基质的合成与沉积，是肝纤维化最重要的启动因子之一，与纤维化关系极为密切[21-23]。细胞外基质过度沉积与增生会导致肝脏出现异常改变，参与肝纤维化的细胞外基质主要包括胶原蛋白、蛋白多糖和粘连蛋白三类[24]，其中胶原蛋白与肝纤维化的关系最为紧密[19]。本实验在前期细胞培养过程中，采用无血清培养基饥饿培养24小时，使细胞处于同一细胞同期后，用TGF-β1激活的肝星状细胞为模型组，分别培养12小时、24小时、48小时，更换含药血清继续培养。结果发现，24小时各组细胞的增殖情况优于其他两组，因此笔者团队采用24小时组进行后续实验。

综上所述，一贯煎可能通过抑制肝星状细胞活化，减少COL-I和COL-Ⅲ蛋白的表达，阻滞细胞周期于S期和G2/M期，从而达到抑制肝纤维化的目的。但一贯煎抑制肝星状细胞活化的信号通路尚未明了。因此，深入研究一贯煎抑制肝星状细胞活化的作用机制，对寻找逆转肝纤维化的潜在靶点具有重要意义。

参考文献

[1]　Yin C, Evason KJ, Asahina K, et al. Hepatic stellate cells in liver development, regeneration, andcancer[J]. Journal Clinical Investigation,2013,123(5):1902-1910.

[2]　Sánchez-Valle V, Chávez-Tapia NC, Uribe M, et al. Role of oxidative stress and molecular changes in liver fibrosis: a review[J]. Current Medicinal Chemistry, 2012,19(28):4850-4860.

[3]　Florent Duval, Jorge E. Moreno-Cuevas, González-Garza MT, et al. Liver fibrosis and mechanisms of the protective action of medicinal plants targeting inflammation and the immuneresponse[J]. International Journal of Inflammation, 2015,2015(4):943497.

[4]　Czaja AJ. Hepatic inflammation and progressive liver fibrosis in chronic liverdisease[J]. World Journal of Gastroenterology,2014,20 (10):2515-2532.

[5]　Mederacke I, Hsu CC, Troeger JS, et al. Fate tracing reveals hepatic stellate cells as dominant contributors to liver fibrosis independent of itsaetiology[J].Nature Communications, 2013,4(7): 2823-2844.

[6]　Zan Y, Zhang Y, Tien P. Hepatitis B virus e antigen induces activation of rat hepatic stellate cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,435(3):391-396.

[7]　宁冰冰，边艳琴，张文萌，等. 一贯煎保肝作用研究[J].长春中医药大学学报,2012,28(3):546-548.

[8]　王晓柠，陶庆，冯琴，等. 一贯煎对CCL4诱导的肝纤维化大鼠组织胶原代谢的影响[J].中西医结合学报,2011,9(6):651-657

[9]　刘文兰，油红捷，赵青舟，等. 肝纤维化大鼠阴虚证表征的观察及一贯煎的干预作用[J].中国医药导报,2015,12(7):7-11.

[10]　刘文兰，油红捷，张红月，等.一贯煎治疗肝炎药理机制的研究[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(5):192-194.

[11]　Chen P, Cai S,YangY, et al. PTP1B confers liver fibrosis by regulating the activation of hepatic stllate cells[J]. Toxicology and Applied Pharmacology,2016,292:8-18.

[12]　Wang X, Xie G, Wang X, et al. Urinary metabolite profiling offers potential for differentiation of liver-kidney yin deficiency and dampness-heat internal smoldering syndromes in posthepatitis B cirrhosis patients[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2015,2015(2):464969.

[13]　赵余珠，周语平. 关于肝纤维化病因病机的若干思考[J].中国现代药物应用,2014,8(9):214-215.

[14]　李志刚，谷宁，王凤丽. 加味一贯煎联合黛力新治疗慢性萎缩性胃炎伴焦虑65例疗效观察[J].世界中西医结合杂志,2011,6(3):212-214.

[15]　张帅，杜羽，包洁，等. 范永升应用一贯煎治疗干燥综合征验案举隅[J].浙江中医药大学学报,2016,40(12):917-919.

[16]　曹健美，陶庆，慕永平，等.一贯煎对CCL4诱导肝纤维化大鼠肝细胞凋亡及其调控基因表达的影响[J].上海中医药大学学报,2012,26(5):70-75.

[17]　Lin H J, Tseng C P, Lin C F, et al. A chinese herbal decoction, modied yi guan jian, induces apoptosis in hepatic stellate cells through an ROS-mediated mitochondrial/caspase pathway[J].Evidence-Based Complementary and Alter Native Medicine,2011,2010(1):459-531.

[18]　乔天阳，刘文兰，孟月，等. 一贯煎及骨髓间充质干细胞对肝纤维化大鼠阴虚证表征影响的实验研究[J].环球中医药,2017,10(4):419-424.

[19]　白辰，车念聪，刘文兰，等. 一贯煎汤剂对肝纤维化大鼠肝脏I型胶原的影响[J].环球中医药,2015,8(8):901-904.

[20]　白辰，车念聪，刘文兰，等. 一贯煎对大鼠肝纤维化拮抗作用的影响[J].中华中医药杂志,2015,30(3):815-817.

[21]　Minghua Lin,Yuan Chang,Fang Xie, et al. ASPP2 Inhibits the Profibrotic Effects of Transforming Growth Factor-β1 in Hepatic Stellate Cells by Reducing Autophagy[J].Digestive Diseases And Sciences, 2018,63(1):146-154.

[22]　Kajdaniuk D, Marek B, Borgiel-Marek H, et al. Transforming growth factor beta1 (TGFbeta1) in physiology and pathology[J]. Endokrynologia Polsha,2013,64(5):384-396.

[23]　H. L. Reeves,S. L. Friedman. Activation of hepatic stellate cells: a key issue in liver fibrosis[J].Frontiers In Bioscience,2002,1(7):d808-d826.

[24]　法振鹏，车念聪，季巍巍，等. 乙肝系列中成药对免疫性肝纤维化大鼠肝功能和肝纤维化指标的影响[J].中华中医药杂志, 2012,27(5):1449-1451.