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大黄虫丸对博来霉素致肺纤维化模型大鼠MMP-2和TGF-β1的影响

更新时间:2009-03-28

肺间质纤维化是一种原因及发病机制不明、以肺泡炎症和肺间质纤维化为病理特点、病情呈进行性发展的呼吸系统常见疑难病。西医目前对肺间质纤维化的治疗以激素和免疫抑制剂为主,疗效并不理想。中医药对肺间质纤维化的研究日益深入,中医药的相关临床及实验研究表明:中医药对肺纤维化具有一定的防治作用。国内中医学者临床利用虫类药物治疗肺纤维化显示了良好的前景,初步验证了“肺系络病”与肺纤维化的相关性及药物的有效性[1]。基于中医“肺系络病”理论,本研究在此基础上进一步深化,提出“肺纤维化患者存在肺络干血”的假说[2],通过动物实验研究搜剔肺络法代表方大黄虫丸对肺纤维化形成过程中胶原代谢影响,探讨大黄虫丸对肺纤维化模型大鼠的治疗作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物与药品、试剂

SPF级雄性SD大鼠60只,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,生产许可证号:SCXK(京)2009-0007。博来霉素,日本化药株式会社产品(进口药品注册证号:H20090885,批号:810132)。醋酸泼尼松,西南药业股份有限公司产品,北京恒生药业有限公司分装(国药准字:H50020182,批号:110401,分装批号:110829)。大黄虫丸,由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂提供(国药准字:Z11020002,批号:2013066)。基质金属蛋白酶-2(MMP-2)一抗,由santacruz公司提供(货号:sc-13595),UltraSensitiveTM S-P (Mouse/Rabbit)超敏SP浓缩(鼠/兔)二抗试剂盒,由福州迈新生物公司提供(货号:KIT-0305)。ELISA检测转化生长因子β1(TGF-β1)试剂盒,由北京欣博盛生物科技有限公司提供(货号:ERC107b)。

图1部分进行复制粘贴到图2,得到我们本文待检测图像3。对图像进行小波变换,并对低频部分(图4)进行分块,得到图5。

1.2 动物分组、造模及给药方法

将大鼠随机分成:空白组10只、模型组10只、醋酸泼尼松组10只、大黄虫丸小剂量组10只、大黄虫丸中剂量组10只,大黄虫丸大剂量组10只。大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛(1 mL/100 g体重)麻醉,经气管插管注入博来霉素溶液(2 mg/kg BLM、0.25 mL/100 g)对模型组、醋酸泼尼松组、大黄虫丸各剂量组大鼠造模;空白组按同样方法经气管插管注射等体积的生理盐水。动物清醒后随意饮水进食。造模28天后,开始给药,每日1次,大黄虫丸各剂量组按照:小剂量组0.3 g/(kg·d)、中剂量组0.6 g/(kg·d)、大剂量组1.2 g/(kg·d)给药,醋酸泼尼松组按照5 mg/(kg·d)给药,各组按照1 mL/100 g灌胃量用去离子水配制成合适浓度的混悬液,连续给药1个月;模型对照组和空白组给予等体积的去离子水,每日1次。给药1个月后取材。

1.3 肺脏病理组织学检查

实验结束时称取动物体质量,麻醉后将大鼠固定于解剖台,腹主动脉取血,分离血清保存;处死动物,完整摘取肺脏,肉眼观察脏器病变情况,称取肺湿重,计算肺系数:肺系数=肺湿重(mg)/体质量(g);新鲜分离大鼠左肺,经4%多聚甲醛固定,常规脱水、包埋、切片,分别进行HE、Masson染色。按Szapiel等[3]提供的方法确定肺泡炎(-~+++级)及肺纤维化(-~+++级)的程度,-、+、++、+++分别对应计数0、1、2、3,采用Radit分析计算各组病理分级的R值,并对各组的差异性进行比较。

取分离血清,采用双抗体夹心ELISA法检测TGF-β1,具体操作严格按照北京欣博盛ELISA TGF-β1检测试剂盒步骤进行。

1.4 肺组织切片免疫组化染色及病理形态学定量分析

课题前期实验结果中对各组肺组织胶原沉积的比较显示:大黄虫丸各剂量组胶原沉积均明显低于模型组及醋酸泼尼松组,在此基础上进一步行免疫组织化学检查,对各组肺组织MMP-2的表达进行比较。空白组正常肺组织中,大部分肺泡间隔、血管内皮细胞及个别支气管上皮细胞胞浆MMP-2呈极微弱阳性;与空白组相比,模型组及各药物干预组MMP-2表达明显增强(P<0.05),以肺泡间质细胞、肺泡上皮、支气管上皮细胞及肺泡腔内巨噬细胞胞浆表达较明显;与模型组比较,醋酸泼尼松组MMP-2表达减弱不明显(P>0.05),大黄虫丸大、中、小剂量组MMP-2表达减弱明显(P<0.05),且均低于醋酸泼尼松组(P<0.05),而大黄虫丸各剂量组组间比较未见明显差异(P>0.05)。见表3、图1。

1.5 血清TGF-β1检测

GIS、GPS等技术在水利普查数据的采集、传输、存储、处理和利用中的应用,标志着闻喜水利工作开始逐步由传统水利走向现代水利。

1.6 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件,等级计数资料采用Radit分析,组间R值比较采用单因素方差分析;数据均以均数±标准差表示,经方差齐性检验后,空白组与模型组之间行两组间的t检验分析,模型组、醋酸泼尼松组及大黄虫丸大、中、小剂量组视为单因素设计,行单因素方差分析(One-way ANOVA)检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

肺纤维化属中医“肺痿”“肺痹”范畴,其基本病机为痰瘀互结、肺络痹阻,国内中医药研究表明:虫类药物具有一定的抗肺纤维化作用,初步验证了“肺系络病”与肺纤维化的相关性及虫类药物的有效性[1]。通过临床观察认为:肺纤维化与干血存在密切联系,并在中医“肺系络病”理论的基础上,提出“肺纤维化患者存在肺络干血”的假说[2]。张仲景在《金匮要略·血痹虚劳篇》中提出“此内有干血,当缓中补虚,大黄虫丸主之”。本实验即在此理论基础上,采用博来霉素致肺纤维化大鼠模型,研究大黄虫丸对肺纤维化大鼠胶原沉积的影响及治疗肺纤维化的作用机制。

2 结果

2.1 各组大鼠肺系数比较

光镜下观察,空白组未见纤维化病变;模型组及各药物治疗组可见慢性炎细胞浸润,纤维组织增生,肺泡隔增宽,按Szapiel等提供的方法确定各组肺泡炎及肺纤维化的程度并进行统计学分析,模型组、醋酸泼尼松组及大黄虫丸各剂量组肺泡炎及肺纤维化程度均较空白组严重(P<0.05);而模型组、醋酸泼尼松组及大黄虫丸各剂量组两两组间比较均未见明显差异(P>0.05)。见表2。

血清TGF-β1含量,模型组及各药物干预组与空白组比较无明显差异(P>0.05);模型组与醋酸泼尼松组及大黄虫丸大、中、小剂量组比较,两两比较均未显示出明显差异(P>0.05)。见表4。

 

1 各组大鼠肺系数比较±s)

  

组别n肺系数空白组100.9301±0.0839模型组101.3614±0.2418a模型+醋酸泼尼松组101.5432±0.2719a模型+大黄虫丸小剂量组101.4030±0.2780a模型+大黄虫丸中剂量组101.5293±0.3757a模型+大黄虫丸大剂量组101.5027±0.2936a

注:与空白组比较,aP<0.05。

2.2 各组大鼠肺组织病理程度分级比较

模型组、醋酸泼尼松组、大黄虫丸各剂量组大鼠肺系数均明显高于空白组(P<0.05),而模型组、醋酸泼尼松组与大黄虫丸小、中、大剂量组比较,均未见明显差异(P>0.05)。见表1。

2.3 各组大鼠肺组织MMP-2表达比较

4%多聚甲醛溶液固定,切片厚度3 μm。免疫组织化学检查严格按照SP试剂盒说明书进行,以细胞出现棕色或黄色颗粒沉积为阳性。采用NIS-Elements D 3.22.00(Build 710)拍摄系统、MIAS医学图像分析管理系统(4.0)分析软件测量切片染色阳性区域的平均光密度值:MMP-2阳性表达,400倍镜下拍摄面积固定的5个视野,最后取平均值。通过阳性表达部位的平均光密度值观察各组肺组织中MMP-2的表达。

 

2 各组大鼠肺组织病理程度分级比较(R值)

  

组别n肺泡炎程度肺纤维化程度空白组100.21670.3166模型组100.5925a0.5400b模型+醋酸泼尼松组100.5350a0.5933b模型+大黄虫丸小剂量组100.5925a0.5050b模型+大黄虫丸中剂量组100.5283a0.5166b模型+大黄虫丸大剂量组100.5350a0.5283b

注:肺泡炎程度与空白组比较,aP<0.05;肺纤维化程度与空白组比较,bP<0.05。

 

3 各组大鼠肺组织MMP-2平均光密度值比较±s)

  

组别nMMP⁃2表达空白组100.033±0.007模型组100.207±0.021a模型+醋酸泼尼松组100.159±0.036a模型+大黄虫丸小剂量组100.108±0.013ab模型+大黄虫丸中剂量组100.110±0.018ab模型+大黄虫丸大剂量组100.113±0.012ab

注:与空白组比较,aP<0.05;与模型组“+”醋酸泼尼松组比较,bP<0.05。

  

1 各实验组MMP-2免疫组化染色(×400)

2.4 各组大鼠血清TGF-β1比较

我的接近并最终投身文学,近一甲子矣。在此漫漫岁月,虽无骄人成绩,所幸终日矻矻,与文学相伴了一生。朋友曾与我谈及一同起步的同行许多已巍然成树,叹息我等才情有限,始终不成气候,最多算棵草而已,很没劲。我同意他的比喻,却不同意他的自卑。没有长成树木,长成了草,也是文学原野上的生命。而且,一粒种子,能长成一棵草,生动地活着,其实也并不容易。说树不是一天长成的,草又何尝不是?天时地利人和,一样不能少。就一个写作者而言,不说社会历史那么高大上的原因了,仅仅稿件的发表就不知耗费了编辑们多少辛劳。

 

4 各组大鼠血清TGF-β1含量比较±s, pg/mL)

  

组别nTGF⁃β1含量空白组10389.817±176.687模型组10228.147±195.653模型+醋酸泼尼松组10228.223±122.378模型+大黄虫丸小剂量组10128.363±184.152模型+大黄虫丸中剂量组10155.735±186.887模型+大黄虫丸大剂量组10187.526±164.780

3 讨论

根据课堂教学目标自设情境模拟教学方法评价问卷,内容详(见表1)。教学结束后对学生进行问卷调查,共发放调查问卷270份,收回有效问卷258份,有效回收率95%。

肺纤维化的机制研究方向从以炎性反应为重点转为以肺泡上皮损伤和细胞外基质(ECM)的过度沉积为重点[4-5],而胶原沉积是ECM沉积的最重要组成部分。肺纤维化的原发病因差异很大,但病情进展过程中ECM代谢异常是相似的[6]。现在认为MMPs是降解ECM最重要的蛋白酶类之一,其中Ⅳ型胶原酶MMP-2及MMP-9可降解基膜型(Ⅳ型)胶原和变性的间质型胶原(明胶)[7]。在肺纤维化的病理过程中,MMP-2能通过分解Ⅳ型胶原蛋白等成分,使肺基质成分降解,引起肺基膜结构的损伤,破坏肺泡壁结构的完整性,从而使成纤维细胞迁移到肺泡腔,造成肺泡腔内纤维化[8],引起肺间质纤维化的启动机制[9]。多位学者的研究均认为:肺组织内MMP-2的过度表达,可能是细胞外基质代谢异常、胶原沉积及特发性肺纤维化启动的重要原因[10-13]

滨水动态人文景观活动的开展,必然要依托于一定的场所,滨水活动的空间载体也与当地自然与人文环境息息相关,具有明显的地域化特征。广州市传统滨水动态人文景观活动的空间载体可分为三大类:点状空间、线状空间和面状空间。

本实验采用大黄虫丸治疗大鼠肺间质纤维化,课题前期实验结果显示在胶原沉积方面,大黄虫丸各剂量组均明显低于模型组及醋酸泼尼松组;在MMP-2蛋白表达方面,与模型组、醋酸泼尼松组相比,大黄虫丸大、中、小剂量组表达明显减弱,并与胶原沉积的高低相一致,说明大黄虫丸对肺纤维化模型大鼠具有一定的治疗作用,并优于西药激素的治疗效果,而这种治疗作用从本研究的结果而言,是通过对MMP-2的表达抑制实现的,其并不能抑制肺组织TGF-β1的产生。本实验研究结果中,模型组与各药物干预组间肺系数、病理程度分级两两比较未显示明显差异,可能与肺系数影响因素较多[14-15]、病理程度分级定性分析局限[16]有关。空白组与模型组血清TGF-β1并未显示出统计学差异,分析其可能原因主要有以下两点:(1)从本实验研究角度而言,TGF-β1不是参与胶原代谢的主要炎症因子;(2)有学者采用双抗体夹心ELISA测定支气管肺泡灌洗液中TGF-β1浓度[17],或采用免疫组化及PCR方法测定TGF-β1蛋白及mRNA的表达[18],实验结果显示出了统计学差异,而本实验参照学者文献报道[1]:检测的为血清样本中TGF-β1的浓度大小,结果未显示统计学差异,可能的原因为博来霉素致肺纤维化模型大鼠肺部病变部位的TGF-β1表达差异(与空白组比较),较之于血清中的表达差异(与空白组比较)更明显。

通过实验研究初步探明大黄虫丸对肺纤维化的治疗作用及其机制,有助于丰富肺系络病理论及临床对肺纤维化的认识,并初步验证了“肺纤维化患者存在肺络干血”假说的有效性。进一步详细揭示大黄虫丸对肺纤维化的治疗作用机制及肺纤维化发生发展的具体病理过程,是今后基础实验及临床研究的重点方向,以期为“肺纤维化患者存在肺络干血”假说提供更多有力证据,丰富和完善肺系络病理论,进而为中医药临床防治肺纤维化提供更多依据。

参考文献

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余松,张立山,王晓飞,赵明镜,张冬梅,马洁,周宸羽,陈飞凤,赵世同
《环球中医药》 2018年第03期
《环球中医药》2018年第03期文献

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