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蒙药熊胆对血小板减少性出血模型大鼠凝血、纤溶系统的影响

更新时间:2009-03-28

熊胆为熊科动物黑熊(selenarctos thibetanus G. Cuvier)或棕熊(Ursus arctos Linnaeus)的干燥胆囊[1],是中国传统名贵药材。目前国内外对熊胆的研究并不多,文献报道多以熊胆粉或化学成分为主。熊胆粉是通过活体引流熊胆汁而得的干燥品,又称引流熊胆,是熊胆的临床使用药物,属国家卫生部批准的一类新药[2]。蒙医认为,熊胆味苦、性凉,具有封脉窍、止血、祛“希日”、明目、防腐生肌、止泻等功效,主治鼻衄、吐血等出血性疾病,胆病,眼病,外伤,“齐素希日”性腹泻等;也是治疗出血性疾病的主要药物之一[3]。《四部医典》中记载“熊胆有封脉窍、止腐、生肌、明目之功效”[4]。《晶珠本草》有记载“熊胆乃胆中上品且有封脉窍,助于止血愈伤、祛希日、明目”的相关记载[5]。本研究采用环磷酰胺致大鼠血小板减少性出血模型,观察蒙药熊胆对止血作用的有效成分及作用机制,科学、合理应用熊胆以及从熊胆开发新药或寻找熊胆替代品提供科学依据。

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1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠104只,雌雄各半,6~8周龄,体重(200±20)g,由北京维通利华实验技术有限公司提供,动物许可证号:SCXK(京)2012-0004。

1.5 统计学分析 采用SPSS18.0软件进行统计学处理,计量资料用表示,采用t检验;计数资料用例(%)表示,采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

1.2 药品与试剂

熊胆粉(0.25 g/瓶×4 瓶/盒)(福建归真堂药业股份有限公司,批号:20091216,纯度98%);熊去氧胆酸(上海生工生物工程股份有限公司,批号:BB07BA0324,纯度98%);牛磺熊去氧胆酸(上海化成工业发展有限公司,批号:3MQWC-BP,纯度>98%);胆酸(美国Sigma公司,批号:SLBH1420V,纯度≥98%);止血红花-8味散(内蒙古国际蒙医医院国家蒙药制剂中心,批号:20160623,由熊胆50 g、藏红花50 g、菀豆花40 g、红檀35 g、地锦草35 g、石斛35 g、木鳖子25 g、朱砂25 g等组成。用法用量:每日1~3次,一次1.5~3 g,温开水送服。大鼠灌胃剂量为临床给药剂量按人的平均体重70 kg计算,根据人和大鼠给药剂量系数换算得出);咖啡酸片0.1 g(德州德药制药有限公司,国药准字H37020537,批号:2102160404);环磷酰胺0.2 g/支(山西普德药业股份有限公司,批准文号:国药准字H14023686);GMP-140 ELISA KIT,规格:96T,产品编号:E02G0338;TPO ELISA KIT,规格:96T,产品编号:E02T0059;PT ELISA KIT,规格:96T,产品编号:E02P0044;APTT ELISA KIT,规格:96T,产品编号:E02A0053;TT ELISA KIT,规格:96T,产品编号:E02T0011;FIB ELISA KIT,规格:96T,产品编号:E02F0007;T-PA ELISA KIT,规格:96T,产品编号:E02T0010;PAI-1 ELISA KIT,规格:96T,产品编号:E02P0028,由美国R&D公司生产。

1.3 仪器设备

2.3 作者 作者姓名在文题下按序排列,排序应在投稿时确定,在编排过程中不应再作更动。作者单位名称及邮政编码脚注于同页左下方。作者应是:①参与选题和设计,或参与资料的分析和解释者;②起草或修改论文中关键性理论或其他主要内容者;③能对编辑部的修改意见进行核对修改,在学术界进行答辩,并最终同意该文发表者。以上3条均需具备。仅参与获得资金或收集资料者不能列为作者,仅对科研小组进行一般管理者也不宜列为作者。对文章中的各主要结论,均必须至少有1位作者负责。集体署名的文章必须明确对该文负责的关键人物。其他对该研究有贡献者应列入致谢部分。作者中如有外籍作者,应征得本人同意,并有证明信。

1.4.2 实验方法 除空白组外,其余依据文献[6]介绍的方法,大鼠腹腔注射环磷酰胺100 mg/kg,每日1次,连续3天,第1、4天分别于大鼠尾尖部取血,用血球自动分析仪检测血小板计数,血小板下降至造模前的20%~30%为造模成功。空白组和模型组灌胃等容积的0.9%氯化钠注射液;咖啡酸片9 mg/kg,蒙药止血红花-8味散低剂量270.1 mg/kg、高剂量539.9 mg/kg,熊胆粉及主要有效成分低和高剂量组分别以45.7 mg/kg、91.5 mg/kg浓度的量100 g大鼠1 mL的灌胃量灌胃。各组每日给药1次,连续给药10天。给药期间每日观察动物进食、饮水、活动、精神状态、皮毛色泽和死亡等一般体征;给药第3、5、10天分别采血进行血小板计数;末次给药1小时后,分别于大鼠尾尖部取血,用血球自动分析仪检测各组大鼠血小板计数,用乙醚将大鼠致昏迷,背位固定,心脏穿刺取血5 mL,在室温放置2小时后3000 r/min离心10分钟,取上清液至EP管中,作为实验血清指标测定放至-80℃保存备用。一次性真空采血管(K2EDTA体积比1∶9抗凝),轻轻摇匀,血液标本放置不超过2小时,3000 r/min离心15分钟,取上液至EP管中,作为实验血浆指标测定放至-80℃保存备用。

1.4 方法

空白组大鼠实验过程中进食饮水正常,活动良好,对刺激反应灵敏,毛色光滑;模型组造模后大鼠出现明显皮下瘀血,以注射部位、四肢及尾部为多,鼻出血,有的变发绿等,同时出现精神萎靡,毛色泽变黯、散乱,进食、进水减少,体质量减轻。给药5天后开始熊胆粉及其主要有效成分及咖啡酸阳性组进食饮水及活动量有所好转,对刺激反应稍灵敏,毛色变得光滑些等变化出现;给药10天后开始熊胆粉及其主要有效成分及咖啡酸阳性组进食饮水接近正常,活动量良好,对刺激反应灵敏,毛色光滑,腹壁皮肤颜色几乎正常等变化,接近正常组大鼠情况。

1.苦练内功,减员增效,节能减耗,增收节支。减员增效层面,企业可进行适度的裁员,加强对员工的培训,减少不必要的开支。节能减耗层面,可采用节能技术,如照明使用节能光源、设备改用调频技术;减少纸张等物料损耗,提高工作效率和产能等。

1.4.3 检测指标 采用酶联免疫吸附(ELISA)双抗体夹心法测定血清GMP-140及TPO、血浆凝血四项(PT、TT、APTT、FIB)及纤溶系统(t-PA、PAI-1)的含量,严格按照试剂盒说明书步骤操作测定。

1.5 统计学处理

应用SPSS 19.00统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差±s)表示,两组间比较采用LSD分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况

1.4.1 实验分组 将104只SD大鼠随机分为空白组、模型组、咖啡酸阳性组、蒙药止血红花-8味散低和高剂量组、熊胆粉低和高剂量组、UDCA低和高剂量组、TUDCA低和高剂量组及CA低和高剂量组等13组,每组8只大鼠。

2.2 熊胆粉及主要有效成分对模型大鼠血小板功能的影响

熊胆粉及主要有效成分能缩短PT和TT(P<0.05);阳性组、TUDCA高剂量组的凝血酶原时间显著缩短(P<0.01);空白组、止血红花-8味散低和高剂量组、熊胆粉高剂量组、UDCA高剂量组、TUDCA低和高剂量组、CA低和高剂量组的凝血酶时间显著缩短(P<0.01);APTT无统计学意义(P>0.05)。

2.3 熊胆粉及主要有效成分对模型大鼠凝血四项的影响

造模3天后,除了空白组外各组血小板计数与造模前相比均下降20%~30%,说明造模成功。给药5天后,各组血小板计数均有提高趋势,与模型组比较,治疗组血小板计数有统计学意义(P<0.05)。给药10 g后,与模型组比较,治疗组血小板计数明显提高,均有统计学意义(P<0.05),咖啡酸阳性对照组、止血红花-8味散高剂量组、熊胆粉低和高剂量组、UDCA低和高剂量组与TUDCA低和高剂量组有非常显著性差异(P<0.01)。治疗组各组比较均数差异均无统计学意义(P>0.05)。蒙药熊胆及主要有效成分均显著性提高TPO水平(P<0.01);能上调GMP-140含量表达(P<0.05),熊胆粉高剂量组、UDCA高剂量组、TUDCA高剂量组有显著性上调表达(P<0.01),治疗组GMP-140、TPO水平与阳性组无统计学意义(P>0.05)。熊胆粉及主要有效成分各组之间相互比较,熊胆粉、UDCA与TUDCA低和高剂量组之间无显著性差异(P>0.05),它们分别与CA低和高剂量组之间有显著性差异(P<0.05)。表明蒙药熊胆及主要有效成分止血机制之一可能是通过提高外周血血小板计数、TPO含量及促进GMP-140表达,从而激活周围血小板、增加血小板含量、活化及释放、促进血小板聚集来发挥促凝止血作用。见表1、2。

 

1 蒙药熊胆对模型大鼠血小板计数的影响±sn=8)

  

组别CountofPLT(×109/L)给药前造模后3天给药后5天给药后10天空白组361.13±56.63359.01±55.62a337.79±56.62a347.06±52.18a模型组366.38±42.1844.87±11.4842.79±7.13198.01±17.31咖啡酸对照组346.50±85.9938.75±8.1369.04±12.55a379.50±181.66b止血红花⁃8味散低剂量组356.51±54.3850.25±32.9673.77±28.01a280.09±133.78a止血红花⁃8味散高剂量组325.13±90.9338.62±14.2583.90±10.68a325.34±137.10b熊胆粉低剂量组316.61±64.1553.68±15.3292.00±28.13a408.54±147.52b熊胆粉高剂量组357.25±46.4948.09±21.8689.50±33.78a413.71±135.94bUDCA低剂量组327.62±33.5938.58±15.0684.25±19.18a355.68±118.30bUDCA高剂量组346.28±43.4440.21±12.9478.03±21.58a466.81±235.48bTUDCA低剂量组438.13±57.9437.03±16.4983.24±20.62a405.63±219.19bTUDCA高剂量组397.49±25.3838.30±13.8165.37±12.28a453.87±217.97bCA低剂量组334.86±57.2136.87±16.3662.12±26.22a260.75±64.38aCA高剂量组342.62±34.8948.12±19.1453.62±26.52a266.89±162.61a

注:与模型组比较, aP<0.05, bP<0.01。

 

2 蒙药熊胆对模型大鼠血清GMP-140、TPO的影响±s,n=8)

  

组别GMP⁃140(ng/L)TPO(ng/L)空白组50.97±20.73b258.89±53.59b模型组22.93±11.14108.55±55.13咖啡酸对照组54.75±13.44178.76±44.45b止血红花⁃8味散低剂量组46.68±11.71b155.76±23.36b止血红花⁃8味散高剂量组42.83±15.56b208.94±46.22b熊胆粉低剂量组39.18±15.03b182.51±51.31b熊胆粉高剂量组43.18±17.68b160.66±64.78bUDCA低剂量组51.63±20.67b117.53±51.40UDCA高剂量组43.07±13.82b166.98±65.09bTUDCA低剂量组40.53±19.69b133.72±40.02TUDCA高剂量组35.33±16.40157.33±35.69bCA低剂量组37.73±13.73174.83±52.63bCA高剂量组49.96±6.13b172.83±16.16

注: 与模型组比较, aP<0.05,bP<0.01。

与模型组比较,熊胆粉及主要有效成分、空白组及阳性组均能提高模型大鼠血浆t-PA的水平,有显著性差异(P<0.05);熊胆粉、UDCA、TUDCA低和高剂量组及阳性组均能降低PAI-1的水平,有显著性差异(P<0.05)。结果表明:熊胆粉及主要有效成分通过调整纤溶系统来防止血栓的形成。见表4。

超净工作台;电子天平;全自动多功能酶标仪(MULTISKAN MK3,Thermo,USA);水平离心机;MK3型酶标仪;电热恒温培养箱(DH4000A,天津泰斯特);MINI shaker(MH-1,kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER);移液器;EP(0.1 mL,0.2 mL,1 mL)等。

2.4 熊胆粉及主要有效成分对模型大鼠纤溶系统的影响

同时增加大鼠血液中FIB的含量(P<0.05),熊胆粉高剂量组有显著增加(P<0.01)。结果表明:熊胆粉及主要有效成分止血作用机制之一可能是通过缩短凝血时间,尤其是通过外源性凝血途径来缩短凝血酶原及凝血酶时间、同时增加出血处大鼠血浆纤维蛋白原的含量来发挥促凝止血作用。见表3。

 

3 蒙药熊胆对模型大鼠血浆凝血四项(PT、APTT、TT、FIB)的影响±s,n=8)

  

组别PT(秒)APTT(秒)TT(秒)FIB(g/L)空白组56.44±18.24a65.55±24.0761.77±22.01b22.75±8.73模型组98.75±10.5674.84±13.1491.95±9.4231.03±5.83咖啡酸对照组61.58±29.10b66.58±33.6361.58±29.10b35.98±9.82止血红花⁃8味散低剂量组66.93±16.75a71.93±22.2866.93±16.75b33.10±6.17止血红花⁃8味散高剂量组58.62±19.51a63.63±24.3758.62±19.51b33.71±9.01熊胆粉低剂量组70.60±12.53a83.11±10.8970.61±12.54a41.64±6.76a熊胆粉高剂量组64.58±18.89a69.51±21.5262.08±16.89b43.85±11.30bUDCA低剂量组74.10±11.11a75.35±12.8574.01±11.11a38.40±5.65UDCA高剂量组67.47±17.08a71.22±19.9462.47±12.77b43.18±12.69aTUDCA低剂量组69.99±11.92a60.15±19.7455.15±14.89b34.24±7.43TUDCA高剂量组55.15±14.89b69.99±11.9265.05±12.85b40.43±10.09aCA低剂量组72.73±11.89a77.73±15.4568.99±10.49b34.58±6.85CA高剂量组69.87±13.73a71.12±15.5369.87±13.73b41.27±14.51a

注: 与模型组比较, aP<0.05,bP<0.01。

 

4 蒙药熊胆对模型大鼠血浆纤溶系统的影响±s,n=8)

  

组别T⁃PA(ng/mL)PAI⁃1(ng/mL)空白组467.67±79.47a2.58±0.82a模型组316.33±62.145.88±1.11咖啡酸对照组452.72±75.77a2.91±0.86a止血红花⁃8味散低剂量组359.13±87.594.19±0.71a止血红花⁃8味散高剂量组380.62±79.263.74±0.79a熊胆粉低剂量组422.29±86.95a3.61±0.89a熊胆粉高剂量组429.65±44.99a2.96±0.81aUDCA低剂量组466.39±69.84a2.89±0.80aUDCA高剂量组466.46±82.12a2.42±0.57aTUDCA低剂量组442.36±83.68a3.06±0.92aTUDCA高剂量组431.25±54.36a2.86±0.79aCA低剂量组374.48±81.574.38±0.96aCA高剂量组379.41±84.663.81±0.68a

注: 与模型组比较, aP<0.05。

3 讨论

环磷酰胺具有明显的抗癌和免疫抑制作用。文献报道其可应用于白细胞减少、血小板降低和免疫抑制模型[7-8]。国内外关于用环磷酰胺诱发大鼠血小板障碍模型的报道主要是采用腹腔注射给药,存在给药时间长等特点[9-10]

机体的正常止血与凝血机制有赖于血管壁、血小板、凝血因子、抗凝因子、纤溶系统以及它们之间的生理性调节和平衡[11],在机体凝血过程中,血小板受刺激被活化后会释放其包浆内容物(如致密颗粒、α颗粒等),这个过程称为血小板激活,因此可以通过测定血小板活化标记物来判断血小板活化程度。血小板颗粒膜糖蛋白-140(GMP-140)是目前所知较能反映血小板活化和释放反应的特异性标记物。GMP-140指标的监测,对血小板活化有关的疾病有着重要的诊断价值[12-13]。血小板生成素(TPO)又称巨核细胞生长发育因子(MGDF),是巨核细胞-血小板系统最重要的调控因子和促进血小板生成的最重要的细胞因子。它通过与其受体C-MPL结合而刺激巨核细胞增殖与分化,并促进血小板的生成和释放,控制循环血中血小板的数量和功能[14]。凝血过程是复杂的,医学上常用瀑布流学说来解释凝血机制。PT、APTT、TT和FIB是检测凝血最常用的指标[15]。PT主要反映外源性凝血系统状况;APTT主要反映内源性凝血系统状况;TT主要反映纤维蛋白原转为纤维蛋白所需时间,是内、外源凝血途径的共同途径;FIB主要反映纤维蛋白原来生成纤维蛋白的能力,通过这4项凝血因子可判断离体血浆在凝血反应中的内、外源性凝血途径是否通畅以及纤维蛋白原功能是否完好[16]。纤溶系统是指血液凝固过程中形成的纤维蛋白,被分解液化的过程。纤溶是体内重要的抗凝血过程。血液中凝血系统与纤溶系统之间既相互矛盾又相互动态平衡的过程,是正常机体维持体内血液流动和防止血液丢失的关键。纤溶系统失衡是形成机体血瘀的重要因素之一,因此在止血类药物发挥促凝作用时,如果导致纤溶系统失衡,止血太过则会有引起血瘀证的可能。

去年7月起,身份证可在全国范围内异地换证、补证、挂失。只需携带身份证、户口本、居住证等有效材料,即可在就近的公安机关办理业务。

通过本次实验结果发现,蒙药熊胆对于临床血小板减少性出血疾病有着显著性的治疗作用,并模型大鼠的促凝止血、调整纤溶系统的主要有效成分为UDCA和TUDCA;作用机制一方面提高外周血血小板计数、显著性的提高TPO水平及上调GMP-140的表达来激活周围血小板、增加血小板含量、促进血管收缩及血小板聚集活化释放来发挥止血促凝作用;另一方面激活外源性凝血途径的某些凝血因子及增加大鼠血浆纤维蛋白原的含量来发挥止血作用的同时通过调整纤溶系统来防止血栓的形成,调整凝血系统和纤溶系统,发挥双向调节作用来达到治疗目的。为科学、合理应用熊胆以及从熊胆开发新药或寻找替代品提供科学依据。

参考文献

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萨茹拉,吴玉小,莲花,白珍,白长喜
《环球中医药》 2018年第03期
《环球中医药》2018年第03期文献

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