马氏珠母贝(Pinctada fucata)是人工培育海水珍珠的主要母贝,超过 90%的海水珍珠产量来自于马氏珠母贝,在我国海水养殖业中占有重要地位(Zhan et al,2016)。然而,由于长期的人工养殖和近亲繁殖,马氏珠母贝已呈现出种苗活力下降、生长速度减慢、死亡率增加、育珠贝变小、珍珠质量差等明显的种质退化现象,严重制约了我国海水珍珠产业的健康持续发展(Wang et al,2009)。因此,马氏珠母贝的遗传改良和优良品种培育是当前提高珍珠贝养殖效益和健康养殖水平的首要任务。

规模化开发马氏珠母贝分子标记是其种质资源发掘、经济性状关联分析、分子遗传育种技术建立和优良品种培育的基础性工作之一。单核苷酸多态性标记(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是指单个核苷酸发生改变而引起的 DNA序列多态性,最早由美国学者Lander于1996年提出,是继扩增片段长度多态性(AFLP)、微卫星(SSR)等之后的新一代分子标记(Lander,1996)。由于具有数量多、密度大、遗传稳定性高、便于高通量自动化检测分析等优点,SNP标记被广泛应用于高密度遗传连锁图谱构建、基因定位、品种鉴定、群体遗传学研究和分子辅助育种等领域(Liu et al,2004;Mir et al,2013;张晓萌等,2013)。

近年来,水产动物中 SNP标记的开发和应用已有若干报道,如鱼类的大菱鲆(Scophthalmus maximus)(王婷等,2014)、斑点叉尾(Ictalurus punctatus) (Li et al,2014)、大西洋鲑(Salmo salar) (Houston et al,2014;Tsai et al,2016),甲壳类的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) (Yu et al,2014)、斑节对虾(Penaeus monodon) (Sellars et al,2014)、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis) (Cui et al,2013)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) (张德宁等,2015),贝类的栉孔扇贝(Chlamys farreri) (李纪勤等,2013)、长牡蛎(Crassostrea gigas) (Wang et al,2017)。马氏珠母贝中也开发了少量经济性状相关 SNP标记,但数量还未达到高密度遗传连锁图谱构建和 QTL精细定位的要求(Zhan et al,2016)。

目前,SNP标记的大规模开发主要依靠基因组测序和序列的拼接比对,但这种方法费用高、适用范围有限,限制了 SNP标记在缺乏全基因组信息的非模式生物中的开发和利用。随着高通量测序技术的快速发展,转录组测序成本大幅下降,比较转录组学方法筛选性状相关基因已成为研究特定机理的普遍方法,同时通过序列比对可识别大量的SNP位点(Pante et al,2012;Núñez-Acuña et al,2013;Cui et al,2014;Yu et al,2014;Mastrochirico-Filho et al,2016;Li et al,2017)。本文基于前期马氏珠母贝血细胞转录组测序数据进行 SNP标记的开发和关联基因的功能注释分析,以期为马氏珠母贝遗传多样性分析、遗传图谱构建和分子辅助育种研究等提供候选标记资源,促进马氏珠母贝种质资源保护、优良品种培育和珍珠养殖业的健康发展。

从参赛作品以及最终获得十杰和提名奖的作品可以看出，本届参评作品题材多样，制作精良，技术上精益求精，整体水平较高，作品在构思、创意、光影、构图等方面有了新的突破，从中可以看出近年来人像摄影的发展水准。一批优秀的摄影师突破了传统模式、汲取多种艺术营养，为我们带来了新鲜的表达方式和视觉享受。从摄影风格来看，时尚风格以及对时尚元

1 材料与方法

1.1 马氏珠母贝及高通量转录组测序数据

SNP类型分析表明,来源于BI转录组的纯合SNP位点中,颠换位点 33713个(66.49%),转换位点 16989个(33.51%);来源于AI转录组的纯合SNP位点中,颠换位点36327个(66.62%),转换位点18203个(33.38%)。BI转录组和AI转录组转换SNP数目与颠换SNP数目比值分别为0.504和0.501;6种单核苷酸变异类型中,以 A/T颠换 SNP最多,分别占纯合 SNP总数的25.45%(BI:12906 个)和 25.72%(AI:14024 个)(图3)。

当未选择棋子时：如果选择位置为空，则输出结果。如果选择位置不为空，先判断当前执方，再对执行次数进行判断，选中时，执行次数为 1，落下时为2.如果大于1，则执行另一方棋子，输入已落子，请另一方落子。

同时,根据转录组中unigene的SNP位点分布情况及KEGG功能注释信息筛选BI和AI转录组中特异分布的免疫防御相关基因 SNP位点,共获得 123个特异分布的SNP位点,其中BI转录组中36个SNP位点,存在于 12个免疫防御相关基因中;AI转录组中87个SNP位点,存在于22个免疫防御相关基因中(表3)。

1.2 SNP位点的检测

首先应用 SOAP软件将各样本测序所得 Clean Reads与Trinity拼接的转录本进行比对(错配≤2);合并单端和双端比对结果,过滤掉Duplicated Reads和Multi-mapped Reads,并将比对结果按转录本和坐标位置进行排序;应用SOAPsnp软件(Li et al,2009)对排序后的文件进行SNP位点检测,将得到的SNP结果;按质量值(≥20)、测序深度(≥10和≤100)和SNP间距(≥5)等条件进行过滤并去杂合,最终获得纯合SNP位点数据(Du et al,2014;Lv et al,2014)。

1.3 SNP位点所在unigene的注释与功能分析

应用 BLAST程序将含有 SNP的 unigene(SNP-unigene)序列比对到 nr、nt、Swiss-Prot和COG(直系同源簇,Cluster of Orthologous Groups)等数据库,从而获得该 unigene的注释信息(E-value＜1.0E−5);采用 Blast2GO 软件获得 unigene的 GO(基因本体论,Gene ontology)注释,并使用 WEGO软件对所有unigene做GO功能分类统计;通过BLASTx比对SNP-unigene到COG数据库和KEGG(京都基因与基因组百科,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库,分别获得COG分类注释和 KEGG信号通路注释。

2 结果与分析

2.1 转录组数据及SNP位点数据分析

本研究的数据来源于对照组转录组(BI)和溶藻弧菌感染组转录组(AI)。经SOAPsnp软件检测,67632条unigenes中共获得962995个SNP位点(BI:493243个;AI:469752个)(表1);BI转录组和 AI转录组的SNP发生频率分别为 0.0098和 0.0093(约 1个SNP/100bp);SNP密度频数分析显示,每1000碱基含0—5个SNP位点的unigene最多(图1)。所有SNP位点中,纯合 SNP位点 105232个(BI:50702个;AI:54530个)(表1);Unigene中所含SNP位点数目统计表明,BI转录组中含有1个SNP位点的unigene 4597条(13.64%),含有 2—10个 SNP位点的 unigene 14354条(42.60%),含有 10个以上 SNP位点的 unigene 14746条(43.76%);AI转录组中含有1个SNP位点的unigene 4632条(13.65%),含有2—10个SNP位点的unigene 15140条(44.61%),含有10个以上SNP位点的 unigene 14163条(41.74%)(图2)。

马氏珠母贝(Pinctada fucata) (平均壳长70mm)购自广东省湛江市雷州后洪珍珠贝养殖场;暂养于室内玻璃钢水槽中(80L水体),每槽饲养 20只;水温25±1℃,盐度28,饲养期间连续充气;暂养过程中以螺旋藻粉为饵料投喂,每天换水(100%)一次。室内暂养一周后将珠母贝分为溶藻弧菌感染组(AI)和对照组(BI);AI组珠母贝闭壳肌注射0.1mL、浓度为5×107 CFU/mL的溶藻弧菌悬液,BI组注射同体积的 PBS;细菌感染 4h后闭壳肌采集血淋巴,800×g、4℃离心10min收集血细胞;TRIzol法提取总RNA,经浓度和纯度检测后用于Illumina/Hiseq-2000高通量转录组测序(Wang et al,2016)。

(1)单个资料可以预测地质浅层，但是准确度不够。多种资料相互结合，通过多种特征判断浅层的位置，有利于提高预测精度，降低钻井风险。

 

表1 SNP位点数量概况Tab.1 Summary of the SNP identified in BI and AI transcriptomes

  

类别 BI转录组 AI转录组 总计SNP-unigene 33697 33935 67632 SNP位点总数 493243 469752 962995纯合SNP位点 50702 54530 105232颠换SNP 33713 36327 70040转换SNP 16989 18203 35192

  

图1 SNP密度频数分布图Fig.1 SNP frequency in BI and AI transcriptomes

  

图2 SNP的分布统计Fig.2 SNP distribution in BI and AI transcriptomes

  

图3 SNP类型分析结果Fig.3 SNP numbers of different mutation types in BI and AI transcriptomes

  

图4 SNP-unigenes GO功能注释分析Fig.4 Gene ontology (GO) classification of SNP-unigenes

2.2 SNP-unigene的注释与功能分析

根据 KEGG信号通路的富集分析,共有 629个SNP-unigenes注释到“Platelet activation”等 15 条与“病原感染”和“免疫功能”相关的一条或多条信号通路中,其中以“Platelet activation”信号通路中注释的 unigene最多(86 条),其次分别为“Chemokine signaling pathway”、“Fc gamma R-mediated phagocytosis”、“Fc gamma R-mediated phagocytosis” 和 “Leukocyte transendothelial migration”等信号通路(表2)。

1.3.2 提取 样本DNA模板 ：碘化钠法(改良)。取量为100 μl经抗凝样本全血，吸入双蒸水，量为100 μl，均匀后，注入浓度为6 mol/L NaI ，量为200 μl，震荡均匀30 s，再加同体量的异戍醇/氯仿(1∶24)均匀震荡30 s，经离心分出上清液和下沉物，取上清液，加注异丙醇，按1∶0.6比例，并进行涡旋均匀混合液， 4℃低温置放15 min，再进行离心提取下沉物，沉淀物通过70%酒精洗涤1次后，晾沉淀物至干后，再溶在Tris-Hcl+EDTA溶液之中，最后提取DNA样本，放置紫外分光光度计定量测量，放置低温(-20℃)待用。

2.3 免疫防御相关SNP-unigene的富集及特异SNP位点分析

基于所有67632条SNP-unigenes序列与Nr、Nt及Swiss-prot数据库比对后获得的蛋白功能注释信息,分别进行GO、COG基因功能分类及 KEGG信号通路富集分析。GO分析结果表明,共有 30376条SNP-unigenes(44.91%)匹配到 GO 条目(GO term),并被分配到生物过程、细胞组分及分子功能三大功能分类中的42个亚类(图4);COG结果显示,共有18150条 SNP-unigenes(26.84%)能够匹配相应的 COG注释信息;根据功能信息可分为26类,其中以“一般功能预测”类最多,包含 3690条 SNP-unigenes(图5);KEGG富集分析显示,共有 10981条 SNP-unigenes(16.24%)富集到 32条 KEGG 子集中,其中以“信号转导”子集中富集的SNP-Unigene最多,共计1450条(图6)。

  

图5 SNP-unigenes GOG功能注释分析Fig.5 The cluster of orthologous groups (COG) classification of SNP-unigenes

 

表2 免疫防御相关SNP-unigene的KEGG富集分析Tab.2 The Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) enrichment analysis of immune-related SNP-unigenes

  

免疫防御相关KEGG信号通路 信号通路ID SNP-unigene数目Platelet activation ko04611 86 Chemokine signaling pathway ko04062 78 Fc gamma R-mediated phagocytosis ko04666 69 Leukocyte transendothelial migration ko04670 63 T cell receptor signaling pathway ko04660 50 Toll-like receptor signaling pathway ko04620 46 Fc epsilon RI signaling pathway ko04664 39 B cell receptor signaling pathway ko04662 35 NOD-like receptor signaling pathway ko04621 35 Natural killer cell mediated cytotoxicity ko04650 34 RIG-I-like receptor signaling pathway ko04622 30 Cytosolic DNA-sensing pathway ko04623 27 Antigen processing and presentation ko04612 19 Complement and coagulation cascades ko04610 9 Hematopoietic cell lineage ko04640 9合计 629

  

图6 SNP-unigenes的 KEGG信号通路富集分析Fig.6 The Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) classification of SNP-unigenes

转录组测序共产生70407878条Raw Reads,经去除含有接头、重复及测序质量较低的原始读数后获得56345139条 Clean Reads;使用 de novo组装软件Trinity (Grabherr et al,2011)对Clean Reads进行组装,并进行去冗余处理和进一步拼接,共得到 74007条unigenes (Raw Reads数据的 SRA 登录号为SRP041567) (Wang et al,2016)。

在公司的财务风险管理创新优化方面，应该深入分析当前公司财务管理面临的主要问题，从资本结构优化、筹资渠道拓宽、投资管理完善等方面加强管控，严格执行公司的内部控制管理制度，增强公司的财务风险预警应对能力，有效防范财务风险问题的发生，确保公司经营发展的正常稳定。

2.4 差异表达免疫防御相关基因SNP位点分析

基于标准化的基因表达水平分析,在溶藻弧菌感染前、后的血细胞转录组中共检测到636个差异表达的unigenes (Differentially Expressed Genes,DEGs)(Wang et al,2016)。根据KEGG信号通路分析结果及unigene的SNP位点检测信息,获得了部分重要差异表达免疫防御相关基因 SNP位点的分布情况。结果显示,在BI和AI转录组中分别检测到700和894个SNP位点(共1594个SNP位点),并分布于17个差异表达免疫防御相关基因中(表4)。

3 讨论

在基因组中,SNP标记相比于SSR等分子标记具有更高的稳定性,且符合孟德尔遗传规律,方便用于遗传研究分析中;同时,SNP标记的准确性和重现性也优于其它分子标记。因此,作为第三代分子标记的SNP具有广阔的应用前景。然而,SNP开发、检测的技术难点限制了 SNP标记在非模式生物中的开发和应用。目前,SNP标记的大规模开发主要是利用基因组测序及序列的拼接比对产生,但这种途径成本较高(庄伟,2010);而对于没有基因组参考序列的非模式生物,多利用公共数据库的EST序列进行筛选,但EST序列与实际序列间可能存在差异,所以这种方法的工作量大、开发效率低,且覆盖不广(刘庆明,2012)。随着高通量测序技术的发展,转录组测序很好地弥补了以上方法的不足和缺陷,其不仅成为研究生物免疫防御、生长发育、环境互作等复杂分子机制的重要手段,也是多态性 SNP分子标记鉴定的重要数据来源(周华等,2012)。

 

表3 BI及AI转录组特异分布免疫防御相关基因SNP位点分析Tab.3 Specific immune-related SNPs identified in BI and AI transcriptomes

  

转录组 SNP-unigene ID 所属KEGG信号通路 SNP数目 合计BI comp39780_c0 B cell receptor signaling pathway/ Toll-like receptor signaling pathway/ T cell receptor signaling pathway/ Fc epsilon RI signaling pathway/ Fc gamma R-mediated phagocytosis/ NOD-like receptor signaling pathway/ Platelet activation 7 36 comp671474_c0 Complement and coagulation cascades/Platelet activation 3 comp290115_c0 Cytosolic DNA-sensing pathway 5 comp732503_c0 Cytosolic DNA-sensing pathway 4 comp51341_c0 Fc gamma R-mediated phagocytosis 1 comp57855_c0 Hematopoietic cell lineage 1 comp44879_c0 Leukocyte transendothelial migration/ Platelet activation 3 comp59941_c0 Leukocyte transendothelial migration/Platelet activation / T cell receptor signaling pathway 3 comp1007_c0 NOD-like receptor signaling pathway 3 comp653385_c0 NOD-like receptor signaling pathway 2 comp229504_c0 Platelet activation 2 comp738091_c0 RIG-I-like receptor signaling pathway 2 AI comp1306306_c0 Leukocyte transendothelial migration/Platelet activation 1 87 comp14833_c0 Hematopoietic cell lineage 1 comp1620486_c0 Chemokine signaling pathway 4 comp19568_c0 Leukocyte transendothelial migration/Platelet activation 1 comp22997_c0 B cell receptor signaling pathway/Chemokine signaling pathway/Fc epsilon RI signaling pathway/Fc gamma R-mediated phagocytosis/Leukocyte transendothelial migration/Natural killer cell mediated cytotoxicity/Platelet activation/T cell receptor signaling pathway/Toll-like receptor signaling pathway 4 comp2349_c0 Complement and coagulation cascades/Platelet activation 2 comp340170_c0 Chemokine signaling pathway/Platelet activation 5 comp35583_c0 Cytosolic DNA-sensing pathway 3 comp364321_c0 Fc epsilon RI signaling pathway/Fc gamma R-mediated phagocytosis/Platelet activation 5 comp44949_c0 Fc gamma R-mediated phagocytosis 9 comp47012_c0 Fc gamma R-mediated phagocytosis 5 comp509876_c0 Hematopoietic cell lineage 3 comp51181_c0 Complement and coagulation cascades 8 comp524944_c0 Chemokine signaling pathway/Platelet activation 1 comp54383_c0 Leukocyte transendothelial migration/Platelet activation 1 comp55367_c0 Chemokine signaling pathway/Fc epsilon RI signaling pathway/Fc gamma R-mediated phagocytosis/Leukocyte transendothelial migration/Natural killer cell mediated cytotoxicity/Platelet activation/T cell receptor signaling pathway/Toll-like receptor signaling pathway/Platelet activation 2 comp57390_c0 Hematopoietic cell lineage/Platelet activation 7 comp579306_c0 Fc gamma R-mediated phagocytosis 6 comp60708_c0 Fc epsilon RI signaling pathway/Fc gamma R-mediated phagocytosis/Leukocyte transendothelial migration/T cell receptor signaling pathway 6 comp631969_c0 Hematopoietic cell lineage/Platelet activation 1 comp63931_c0 Cytosolic DNA-sensing pathway 5 comp748376_c0 Platelet activation 7合计 123

 

表4 差异表达免疫防御相关基因SNP位点分析Tab.4 SNPs identified in differentially expressed immune-related unigenes

  

基因名称 免疫后表达水平 BI-SNP数目 AI-SNP数目Alpha-L-iduronidase 上调 14 49 Apoptosis regulator R1 上调 51 95 Arrestin 上调 79 45 cAMP-responsive element modulator 上调 64 69 Cytosolic phospholipase A2 上调 41 37 Dual specificity protein phosphatase 10 上调 29 43 Dual specificity protein phosphatase 7 上调 49 46 Heat shock protein 90 上调 56 47 Interleukin-1 receptor 上调 53 60 MAP kinase-activated protein kinase 2 上调 75 77 myeloid differentiation primary response protein 88 上调 0 41 Nuclear transcription factor Y subunit alpha 上调 34 62 Putative inhibitor of apoptosis 上调 6 15 Serine/threonine protein kinase NLK 上调 20 68 Toll-like receptor 2 下调 39 37 Toll-like receptor 3 上调 38 45 Tumor necrosis factor 上调 52 58合计 700 894

本研究基于 Hiseq-2000测序技术从 67632条unigenes中共获得962995个候选SNP位点,SNP发生频率为 0.0098和 0.0093(平均约 100bp含有 1个SNP),研究结果与女王扇贝(Aequipecten opercularis)和黑扇贝(Mimachlamys varia)SNP分布频率相近(1个SNP/100bp) (Arias et al,2009),稍低于长牡蛎的SNP分布频率(1个SNP/40—60bp) (Sauvage et al,2007),但明显高于栉孔扇贝的 SNP分布频率(1个 SNP/426.5bp) (李纪勤等,2013)。各物种SNP分布频率的差异可能与其生长环境的复杂程度及遗传背景的差异有关(张德宁等,2015),另一个可能的原因是在EST序列中SNP的筛选条件不同(李纪勤等,2013)。SNP碱基替换类型分为转换(由嘌呤置换嘌呤或嘧啶置换嘧啶)和颠换(由嘌呤置换嘧啶或由嘧啶置换嘌呤)两类,理论上发生转换的概率与发生颠换的概率比值应该为0.5。本研究中,BI转录组和AI转录组转换SNP数目与颠换SNP数目比值分别为0.504和0.501,与理论比率相符。然而,长牡蛎、三疣梭子蟹、中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)等无脊椎动物SNP标记中转换的比例远大于颠换,转换/颠换比值大于0.5(王家丰,2013;张德宁等,2015;逄锦菲,2013)。这种差异被称为“转换偏差”(Gojobori et al,1982;Li et al,1984;Collins et al,1994)。这种不同物种间转换/颠换比值的较大差异可能与不同生物在进化中承受的压力不同有一定关系(Zhao et al,2002)。

利用转录组测序数据开发 SNP标记具有一个极为显著的优点,即标记位点来自与功能基因直接相关的编码序列,便于开展进一步的基因功能及遗传性状解析研究(王婷等,2014)。本研究获得的 67632条 SNP-unigenes中,分别有 30376条、18150条和10981条SNP-unigenes在GO、COG及KEGG数据库中获得功能注释,大部分 unigene参与细胞代谢、生物合成、生物(非生物)胁迫(刺激)反应、信号转导、机体组成及激素分泌等过程,表明这些 SNP-unigene广泛参与马氏珠母贝的各种生命活动,并影响其各种遗传性状的建立;同时,这些SNP标记的开发为将来的基因功能、基因表达调控模式等研究提供了跟踪标志。此外,来自于编码区的SNP因其对氨基酸编码的影响可能导致疾病发生或对环境毒物敏感度的改变,因此 SNP也被用于疾病遗传学和抗病性状关联性研究中。如刘敬文(2014)开展了凡纳滨对虾免疫相关基因SNP标记与WSSV抗性的关联分析,最终确定了681个SNP组成的免疫基因候选标记库以指导抗性品种的选育;逄锦菲(2013)利用开发的 SNP 候选位点,以中国对虾的抗病群体和敏感群体为研究材料进行 SNP 基因型与抗病性状的相关性分析,并鉴别出抗病相关 SNP 位点。为了进一步研究马氏珠母贝免疫防御机制,筛选抗病相关SNP位点,本文根据转录组unigene的注释信息,共获得了629个含有SNP位点的免疫防御相关 unigenes,并被注释到“Platelet activation” 等多条重要的免疫防御信号通路中;同时,根据KEGG功能注释信息及SNP位点分布情况筛选到123个细菌感染前、后转录组中特异分布的免疫防御相关基因 SNP位点。以上免疫防御相关SNP-unigene及特异分布SNP位点的获得为以分子标记应用为基础的马氏珠母贝抗病家系选育提供了有力辅助。

4 结论

本研究首次应用高通量转录组测序数据实现了马氏珠母贝 SNP标记的高效率大规模开发,共获得962995个 SNP位点,位点分布频率约为 1个SNP/100bp;共有629个SNP-unigenes被注释到多种免疫防御相关信号通路中;根据 SNP位点分布情况,筛选到123个特异分布的免疫防御相关候选SNP位点。以上研究结果对于丰富马氏珠母贝分子标记类型、阐明免疫防御分子机制、探究种群遗传多样性和保护种质资源均具有重要意义。

参 考 文 献

王 婷,黄智慧,马爱军等,2014.基于转录组数据的大菱鲆(Scophthalmus maximus)SNP标记开发及多态性分析.海洋与湖沼,45(6):1300—1307

王家丰,2013.长牡蛎基因区SNP标记规模开发及其在遗传育种研究中的应用.青岛:中国科学院研究生院(海洋研究所)博士学位论文

刘庆明,2012.应用高分辨率熔解曲线开发大菱鲆SNP标记研究.上海:上海海洋大学硕士学位论文

刘敬文,2014.凡纳滨对虾免疫基因SNPs开发及其与WSSV抗性的关联分析.青岛:中国科学院研究生院(海洋研究所)硕士学位论文

庄 伟,2010.半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)基因组 SNP标记的开发与检测.青岛:中国海洋大学硕士学位论文

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张德宁,吕建建,刘 萍等,2015.三疣梭子蟹生长相关SNP位点的鉴定.中国水产科学,22(3):393—401

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逄锦菲,2013.“黄海2号”中国对虾高通量SNP筛选及其与抗WSSV性状的关联分析.上海:上海海洋大学硕士学位论文

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