抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是动物先天免疫系统的重要组分之一,在机体抵抗病原入侵时发挥重要作用。AMPs多是小分子量的短肽,抗菌谱广,主要通过形成离子通道直接破坏细胞膜以杀灭病原菌,病原菌很难对其产生抗性(Brogden,2005;Lai et al,2009)。研究表明,AMPs除对细菌、真菌、病毒、原生动物和癌细胞等有良好的直接抑制或杀伤作用外,还参与免疫激活、免疫调节、抗炎和免疫抑制等免疫过程(Lai et al,2009;Choi et al,2012;Hilchie et al,2013;Wan et al,2014;Hancock et al,2016)。近年来,国内外学者已从水产动物中分离鉴定了豹鳎毒素(pardaxin) (Lazarovici et al,1986)、毒鱼豆素(piscidin) (Silphaduang et al,2001)、cathelicidin (Lu et al,2011)、肝脏表达抗菌肽-1 (liver express antimicrobial peptide 1,LEAP-1/hepcidin) (陈梅珍等,2010;王克坚,2011)、肝脏表达抗菌肽-2 (liver express antimicrobial peptide 2,LEAP-2) (Li et al,2014)、防御素(defensin) (Zhu et al,2017)、epinecidin-1 (Pan et al,2007)和 scygonadin (王克坚,2011)等多种 AMPs。

Piscidin是一类广泛存在于鱼类中的 AMP之一,最早从杂交斑纹鲈鱼(Morone chrysops × Morone saxatilis)的肥大细胞中分离(Silphaduang et al,2001)。此后,在鳜鱼(Siniperca chuatsi) (Sun et al,2007)、大西洋鳕(Gadus morhua L.) (Fernandes et al,2010;Ruangsri et al,2012)、南极独角雪冰鱼(Chionodraco hamatus)(Buonocore et al,2012)、罗非鱼(Oreochromis niloticus)(Peng et al,2012)、大黄鱼(Larimichthys crocea) (Niu et al,2013;Zhou et al,2014;Yang et al,2016)、条石鲷(Oplegnathus fasciatus) (Umasuthan et al,2016)和斜带石斑鱼(Epinephelus coioides) (Zhuang et al,2017)等数种鱼类中均发现它的存在。已有的研究发现,piscidin通过破坏细菌、真菌和寄生虫的细胞膜发挥直接的抑制活性(Campagna et al,2007;Sung et al,2008;Hayden et al,2015;Li et al,2016;Umasuthan et al,2016;Pan et al,2017)。除具有直接的抗病原活性外,piscidin还能通过免疫调节功能参与机体内病原诱导的免疫应答(Huang et al,2015;Lin et al,2016;Pan et al,2017)。由于与piscidin具有相似的初级或二级多肽结构以及基因结构,从其他鱼类中鉴定的拟鲽毒素(pleurocidin) (Cole et al,1997)、moronecidin (Lauth et al,2002;Bae et al,2014)、chrysophsin(Iijima et al,2003)、dicentracin(Salerno et al,2007)、epinecidin (Yin et al,2006;Pan et al,2007)、myxinidin (Subramanian et al,2009)和 gaduscidin(Browne et al,2011)等抗菌肽被建议归为piscidin家族。

“阿斌”，竹韵推着龙斌一边走，一边兴奋地说，“我想去老家请个保姆来，有保姆侍候你我更加放心，也免得姐姐走上走下的。”

大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)是弹涂鱼的一种,主要分布在中国、韩国和日本等地,在我国主要盛产于东南沿海和台湾。它是一种能够适应不同盐度的两栖鱼类,喜栖息于港湾和河口潮间带淤泥滩涂上,摄食有机碎屑、底藻和小型底栖动物等,营掘洞穴居生活,具有较高的食用与药用价值。尽管大弹涂鱼生活的滩涂环境含有种类繁多、数量巨大的微生物群落,但它们很少感染严重的细菌性疾病,因此研究大弹涂鱼抗感染应答的免疫机制显得尤为重要。鉴于piscidin在动物抗感染免疫应答中的重要作用,本研究初步研究大弹涂鱼(B.pectinirostris)的 piscidin 1(Bppis1),测得Bppis1基因的cDNA序列,确定该基因结构特点、分析其氨基酸系统进化关系并确定mRNA在正常组织中表达情况,研究迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后其组织中Bppis1 mRNA的表达变化;人工合成 Bppis1成熟肽,分析其体外抑菌活性以及对大弹涂鱼单核/巨噬细胞(monocytes/macrophages,MO/MΦ)功能的影响,为进一步深入探讨piscidin对鱼类抵抗细菌感染的免疫作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与实验试剂

30—40g健康大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)购自浙江省宁波市路林市场,规格均一、无病症。大弹涂鱼充气运回实验室,在充分曝气、盐度为10‰、温度为24—26°C水环境中暂养以适应实验室环境。适应期间连续充气,早晚换水各一次。

迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)Et-CD由浙江省海水养殖研究所惠赠,其他细菌菌株由本实验保存。RNAiso试剂、AMV逆转录酶、SYBR Premix Ex Taq试剂盒等购自TaKaRa公司(中国)。Ficoll购自Invitrogen公司(中国)。RPMI 1640培养基和胎牛血清购自Gibco公司(美国)。Bppis1成熟肽由吉尔生化(上海)有限公司合成,纯度＞95%。引物合成和序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

第二，产业链。农资的生态产业链以农资仓储物流为核心，包括农药定制化生产、农资电子商务等在内的产业链业务，其目的是进一步补充金融服务、大数据服务。其优势在于可以延伸主导产业，根据产业需求对接企业，并建立长期合作伙伴，最终形成合作共赢的农资生态产业链，这种产业链运作模式会凭借着其多重优势而受到农资企业们的青睐。

1.2 大弹涂鱼肾源MO/MΦ的分离培养

[][]分阶段延伸护理作为医院护理的延伸,是对医院及社会资源的有利整合。该项护理手段强调社区—家庭护理,通过认知、心理及行为护理干预等方面来释放患者的潜力,进而延缓其病情发展,对康复

软件分析结果显示,Bppis1 cDNA全长 327bp(GenBank登录号为MF459711),包含一个完整的、长度为 207bp的开放阅读框,预测编码一个由 68个氨基酸组成的、相对分子量大小为 7.7kDa的多肽,等电点为5.51。该多肽N-末端含一个由22个氨基酸组成的信号肽,裂解位点为 G20E21G22-F23F24,C-末端含一个由 28个氨基酸组成的末端功能前区,其成熟肽由18个氨基酸组成(图1)。

1.3 Bppis1 cDNA序列获得及分析

氨基酸序列多重比对结果显示,鱼类 piscidin在信号肽区间序列最为保守,终止于1个GEG或GEC序列后,成熟肽和末端功能前区序列变异较大(图1)。其中,大弹涂鱼piscidin与其他已知物种piscidin序列之间同源性较低,为5.8%—40.8%,与黄条piscidin同源性最高。根据鱼类piscidin氨基酸全长序列构建的系统进化树揭示,大弹涂鱼piscidin属于piscidin 1类,与黄条piscidin进化相关性最高(图2)。

 

表1 Piscidin氨基酸序列多重比对及系统发育进化树构建采用序列Tab.1 Protein sequences of piscidin for phylogenetic tree construction and multiple alignment

  

AB703274 piscidin Oplegnathus fasciatus Rock bream 条石鲷EU741827 piscidin l Larimichthys crocea Large yellow croaker 大黄鱼JX412481 piscidin 1 Epinephelus malabaricus Malabar grouper 玛拉巴石斑鱼JQ823163 piscidin l Epinephelus coioides Orange-spotted grouper 斜带石斑鱼EU741828 piscidin l Epinephelus akaara Red spotted grouper 赤点石斑鱼GU592793 piscidin l Epinephelus fuscoguttatus Brown marbled grouper 褐点石斑鱼HQ437912 piscidin l Epinephelus bleekeri Duskytail grouper 布氏石斑鱼JN216987 piscidin l Epinephelus bruneus Longtooth grouper 褐石斑鱼FJ917596 piscidin 1 Gadus morhua L.Atlantic cod 大西洋鳕KY548530 piscidin Seriola lalandi Yellowtail amberjack 黄条物种NCBI登录号 基因名称 拉丁名 英文名 中文名MF459711 piscidin 1 Boleophthalmus pectinirostris Mudskipper 大弹涂鱼HQ437913 piscidin 2 Epinephelus coioides Orange-spotted grouper 斜带石斑鱼JX412480 piscidin 2 Epinephelus malabaricus Malabar grouper 玛拉巴石斑鱼HQ184323 piscidin 2β Gadus morhua L.Atlantic cod 大西洋鳕HQ184322 piscidin 2 Gadus morhua L.Atlantic cod 大西洋鳕KX231319 piscidin 3 Morone chrysops White bass 白鲈KX231323 piscidin 3 Morone saxatilis Striped bass 条纹鲈KX231324 piscidin 4 Morone chrysops White bass 白鲈KX231320 piscidin 4 Morone saxatilis Striped bass 条纹鲈HM596029 piscidin 4 Morone chrysops ×Morone saxatilis Hybrid striped bass 杂交斑纹鲈鱼HM596030 piscidin 5 Morone chrysops ×Morone saxatilis Hybrid striped bass 杂交斑纹鲈鱼KX870851 piscidin 5lt3 Larimichthys crocea Large yellow croaker 大黄鱼KJ879923 piscidin 5lt2 Larimichthys crocea Large yellow croaker 大黄鱼KJ879922 piscidin 5l Larimichthys crocea Large yellow croaker 大黄鱼KX231326 piscidin 6 Morone chrysops White bass 白鲈KX231321 piscidin 6 Morone saxatilis Striped bass 条纹鲈KX231322 piscidin 7 Morone chrysops White bass 白鲈

1.4 迟缓爱德华氏菌感染的大弹涂鱼组织样品制备

腹腔注射迟缓爱德华氏菌感染大弹涂鱼的实验方法及感染剂量参考Chen等(2016),具体步骤如下：收集对数生长期的迟缓爱德华氏菌,用灭菌生理盐水洗涤3次,将细菌浓度调整为1.0×105 CFU/mL。细菌感染组大弹涂鱼腹腔注射 1.0×104 CFU/尾的迟缓爱德华氏菌,对照组大弹涂鱼腹腔注入同等剂量的生理盐水,在注射感染后4、8、12和24h (hours post infection,hpi)时分别收集两个组实验鱼的肝、脾、鳃、肾和皮肤等组织,并立即放入液氮中冻存,随后置－70°C超低温冰箱保存。

1.5 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)

参考Chen等(2016)的方法抽提组织中总RNA、合成互补 cDNA链并进行 RT-qPCR检测目的基因mRNA的表达量。根据转录组测序结果获得的Bppis1序列设计检测引物,Bppis1-T(+):5′-TGGTGGTGATG ATGGCTGAG-3′和 Bppis1-T(-):5′-CACTTGGAGGTA TTCG GGGC-3′,预期扩增片段大小为 172bp。根据大弹涂鱼 18S rRNA基因设计检测引物,Bp18S rRNA-T(+):5′-GGCCGTTCTTAGTTGGTGGA-3′和Bp18S rRNA-T(-):5′-CCCGGACATCTAAGGGCAT C-3′,预期扩增片段大小为 112bp。确定的 RT-qPCR检测体系共 25μL,包含上下游引物(10μmol/L)各1μL、cDNA 模板 0.5μL、SYBR Premix Ex Taq(2×)缓冲液12.5μL、灭菌水10μL。在ABI荧光定量PCR仪(Invitrogen,Foster City,CA,USA)上运行检测程序,程序如下：预变性段共1个循环反应,95°C 5min;扩增段共 40 个循环,95°C 30s,60°C 30s,72°C 30s;熔解段共 1 个循环反应,94°C 30s,72°C 60s,95°C 30s。每个样品反复检测4次。根据2–ΔΔCt方法计算Bppis1 mRNA的相对表达量(Livak et al,2001)。

1.6 体外抑菌实验

参考Li等(2014)的方法,采用微量稀释法测定合成 Bppis1肽对不同细菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),略作改进。具体方法如下：采用二倍稀释法将合成Bppis1肽配制成1.563、3.125、6.25、12.5、25、50和100μg/mL共7个浓度;将副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、迟缓爱德华氏菌、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和海豚链球菌(Streptococcus iniae)等 11种细菌培养至对数生长期,用无菌生理盐水分别调整这些细菌的浓度为 1.0×105 CFU/mL;在 96孔微孔板中每孔加入 20μL 1.0×105 CFU/mL实验细菌的菌悬液,然后加入 80μL不同浓度的合成 Bppis1肽,混匀后在适当的温度条件下培养 24h。采用 Varioskan Flash全波长多功能酶标仪(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)测定OD600值。通过细菌沉降和 600nm处吸光度值计算MIC,同时设置卡那霉素为阳性对照。

又是一个下雾的日子。他剩下的那条毯子已经有一半做了包脚布。他没有找到比尔的踪迹。可是没有关系。饿逼得他太厉害了——不过——不过他又想，是不是比尔也迷了路。走到中午的时候，累赘的包袱压得他受不了。于是他重新把金子分开，但这一次只把其中的一半倒在地上。到了下午，他把剩下来的那一点也扔掉了，现在，他只有半条毯子、那个白铁罐子和那支枪。

1.7 吞噬实验

取健康大弹涂鱼的肝、脾、肾、鳃和皮肤运行RT-qPCR检验程序,结果显示Bppis1 mRNA在健康大弹涂鱼鳃组织中含量最高,其余依次为皮肤、肝、脾和肾(图3A)。与对照组对比,当迟缓爱德华氏菌感染4h时,脾、肾、肝和皮肤中Bppis1 mRNA的表达量显著提高,分别是对照组表达量的2.17、3.17、3.32和 20.76倍(P＜0.05);在 8h时,所有检测组织中Bppis1 mRNA的表达量均显著增加,在肝、肾、鳃和皮肤中达到峰值,分别为对照组的5.84、15.51、3.78和 60.86倍(P＜0.05);在 12h时,脾中 Bppis1 mRNA的表达量继续增加,达到峰值,为对照组的 20.60倍(P＜0.05);在24h时,肾、肝和鳃中Bppis1 mRNA的表达量与对照组无明显差异(图3B—图3F)。

2 结果

2.1 Bppis1 cDNA序列分析

第三，微课应用培养学生思维能力.高中数学教学当中在应用微课的基础上，培养学生思维能力.数学知识的学习中对学生思维能力有着很高要求，在多媒体技术的应用下剖析几何部分知识内容，学生抽象思维能力以及逻辑思维能力难以瞬间完成，在微课的运用下来对几何部分内容分门别类的讲解剖析就比较重要.如在教学当中讲述到点线面间位置关系的时候，就要通过微课的应用，将相应的知识点动态地以及空间化地呈现给学生，这就能方便学生直观的观察，对培养学生思维能力以及抽象能力就比较有利.

应用Illumina二代测序平台构建正常无病症大弹涂鱼的 MO/MΦ转录组数据库,筛选取得 Bppis1 cDNA序列。根据说明书,从大弹涂鱼MO/MΦ中提取总RNA,经AMV逆转录酶合成互补cDNA链,通过特异性引物对 PCR进行扩增并将扩增产物测序检验。使用 SignalP 4.0软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)对开放阅读框编码多肽的信号肽序列进行预测;采用 pI/Mw 程序(http://web.expasy.org/compute_pi/)对基因编码多肽的分子量和等电点进行预测;应用 ClustalW 程序(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/)多重比对piscidin氨基酸序列;使用MEGA 5.0软件构建piscidin氨基酸的系统进化树(Tamura et al,2011)。构建系统发育进化树及比对多重序列所用piscidin的氨基酸序列详见表1。

2.2 迟缓爱德华氏菌感染前后 Bppis1 mRNA表达的变化

参考Chen等(2016)的方法测定Bppis1对大弹涂鱼MO/MΦ吞噬能力的影响,方法如下：分别将对数生长期的大肠杆菌和创伤弧菌标记异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC),分别命名为FITC-E.coli和 FITC-V.vulnificus。将 1.0 或 10.0μg/mL Bppis1肽加入到MO/MΦ中,预处理8h,然后以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10︰1的比例加入 FITC-E.coli或 FITC-V.vulnificus,孵育 30min,灭菌PBS洗涤3次以除去未吞噬细菌,台盼蓝淬灭细胞外荧光,最后用FACS缓冲液(含0.2% BSA和0.1%叠氮化钠)重悬细胞。使用 Gallios Flow Cytometer(Beckman Coulterr,Fullerton,CA,USA)对被吞噬细菌的荧光信号进行流式检测。大弹涂鱼MO/MΦ吞噬细菌的相对平均荧光强度(relative fluorescence intensity,MFI)用FlowJo软件分析。

大弹涂鱼肾源 MO/MΦ的分离培养过程参考Chen等(2016)的方法,具体步骤如下：用0.1% (V/V)的间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222)麻醉大弹涂鱼,在无菌环境中抽血并迅速取出体肾,放入无菌过滤筛网中,再用1mL RPMI 1640培养基润湿体肾,注射器活塞按压体肾碎片,收集分离细胞。采用 Ficoll密度梯度离心方法继续分离细胞,获得含有 MO/MΦ的白色细胞混悬层,收集混悬细胞后用含 2%胎牛血清的RPMI 1640培养基洗涤 2次,离心,重复2次,再用同样浓度胎牛血清的 RPMI 1640培养基重新混悬细胞。使用血球计数板对分离细胞进行计数,将MO/MΦ的浓度调至2.0×107 cells/mL,每个35mm细胞培养皿加入2mL细胞,置于5% CO2、24°C细胞培养箱中培养24h,然后用RPMI 1640培养基除去未贴壁细胞,重复2次,用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基继续培养贴壁细胞。用Giemsa′s染液对贴壁细胞染色并镜检细胞的形态特征,最终确认细胞培养皿中超过95%贴壁细胞属于MO/MΦ。

2.3 Bppis1体外抑菌活性

利用酶标仪测定Bppis1肽对11种细菌的体外抑菌活性,结果表明,Bppis1具备较广泛的抗菌活性,对溶藻弧菌、副溶血弧菌和鳗弧菌的MIC为50μg/mL;对哈维氏弧菌和嗜水气单胞菌的 MIC为 25μg/mL;对创伤弧菌和大肠杆菌的 MIC分别为 12.5和6.25μg/mL,并且抑菌效果优于对照组卡那霉素,但对迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌和海豚链球菌无明显的抑菌活性(表2)。

  

图1 大弹涂鱼与其他种类鱼的piscidin氨基酸序列比对结果Fig.1 The multiple alignments of piscidin sequences of mudskipper and other fishes

 

注：黑色阴影代表相同氨基酸,灰色阴影代表相似氨基酸;图中序列缺口用短横线(-)表示;预测的信号肽及末端功能前区与成熟肽之间的裂解位点用箭头(↓)标记;信号肽的终止序列(GEC或GEG)用框包围。所用序列登录号见表1

  

图2 大弹涂鱼和其他动物piscidin全长氨基酸序列的系统进化树构建Fig.2 The phylogenetic tree of the full-length piscidin sequences of mudskipper and other animals

 

注：进化树中分叉处数字代表1000次重复抽样获得到的置信度百分比,分叉处只显示置信度大于60%的数字;标尺长度数字表示每个位点发生0.2次置换。所有piscidin序列的NCBI登录号见表1

 

表2 Bppis1的体外抑菌MICTab.2 MIC values of synthetic Bppis1 against bacteria in vitro

  

注：“—”表示Bppis1在100μg/mL时无抑菌活性

 

细菌名 分离株/菌株 培养基 培养温度(°C) Bppis1 MIC (μg/mL) 卡那霉素MIC (μg/mL)创伤弧菌 ATCC279562 TSB 28 12.5 25溶藻弧菌 ATCC17749 TSB 28 50 25副溶血弧菌 ATCC33847 TSB 28 50 50哈维氏弧菌 ATCC33866 TSB 28 25 1.563鳗弧菌 ATCC19264 TSB 28 50 25迟缓爱德华氏菌 Et-CD LB 37 — 25大肠杆菌 K12 LB 37 6.25 50金黄色葡萄球菌 ATCC6538 LB 37 — 12.5嗜水气单胞菌 ATCC7966 LB 37 25 6.25单核细胞增生李斯特菌 ATCC19115 BHI 37 — 1.563海豚链球菌 ATCC29178 BHI 28 — 6.25

  

图3 RT-qPCR分析Bppis1 mRNA的表达Fig.3 RT-qPCR analysis of Bppis1 mRNA

 

注：A.Bppis1 mRNA在健康大弹涂鱼中的表达;B—F:Bppis1 mRNA在迟缓爱德华氏菌感染大弹涂鱼组织中的表达。以Bppis1 mRNA与18S rRNA基因的比值作为Bppis1的相对表达量,*表示与对照组比较差异显著(P＜0.05) (n=4)

2.4 Bppis1对MO/MΦ吞噬活性的影响

Piscidin作为抗菌肽piscidin家族成员之一,是鱼类先天免疫的重要组成部分。本研究从大弹涂鱼MO/MΦ中鉴定了Bppis1基因cDNA序列。序列分析结果表明,Bppis1具有与其他物种piscidin相似的结构特征,由信号肽、成熟肽和末端功能前区组成,其中信号肽序列最为保守,以 GEG序列终止,成熟肽和末端功能前区序列变异较大。Bppis1与其他已知物种 piscidin序列之间同源性较低,与黄条piscidin同源性最高,为 40.8%。系统进化树揭示,Bppis1属于piscidin 1类,与黄条piscidin进化相关性最高。

  

图4 合成Bppis1肽对大弹涂鱼MO/MΦ吞噬活性的影响Fig.4 Effect of synthetic Bppis1 on phagocytosis activity of mudskipper MO/MΦ

 

注：A和C:吞噬流式图;B和D:相对平均荧光强度。PBS处理组的相对平均荧光强度数值设定为100,实验组的相对平均荧光强度用PBS处理组数值的倍数表示,*表示与对照组比较差异显著(P＜0.05) (n=3)

3 讨论

采用Gallios Flow Cytometer检测合成Bppis1肽对大弹涂鱼MO/MΦ吞噬能力的影响。结果显示,与对照组相比,经 1.0μg/mL的合成 Bppis1肽处理后,MO/MΦ对 FITC-E.coli吞噬活性无明显变化,但对FITC-V.vulnificus吞噬活性显著增加,为对照组的1.51倍;经 10.0μg/mL的合成 Bppis1肽处理后,MO/MΦ对FITC-E.coli和FITC-V.vulnificus的吞噬活性均无明显变化(图4)。

组织特征分析表明,Bppis1 mRNA在健康大弹涂鱼各组织中广泛表达,且在鳃中表达量最高,与已报道的南极独角雪冰鱼(Buonocore et al,2012)、条石鲷(Bae et al,2016;Umasuthan et al,2016)、罗非鱼(Peng et al,2012)、大黄鱼(Niu et al,2013)等鱼类研究结果较为一致。鳃是鱼类抵抗病原入侵的重要屏障之一,Bppis1在鳃中表达量丰富,揭示其在大弹涂鱼天然免疫应答中扮演重要角色。多篇文献表明鱼类piscidin的高表达与感染病原体紧密相联,研究结果显示病原感染后 piscidin的表达显著上调(Sun et al,2007;Niu et al,2013;Umasuthan et al,2016;Zhuang et al,2017)。例如,斜带石斑鱼感染副溶血弧菌后,脾中ecPis-1 mRNA表达在3h时显著上调(P＜0.05),体肾中ecPis-2和ecPis-3 mRNA表达均在12h显著上调,脾和头肾中ecPis-2和ecPis-4 mRNA在12h和24h时均显著上调(Zhuang et al,2017);条石鲷感染条石鲷虹彩病毒(rock bream iridovirus,RBIV)、迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌后,鳃和头肾中Of-Pis1 mRNA表达均在 3h时显著上调,而且 RBIV感染使得头肾中Of-Pis1 mRNA表达在12h达到峰值,约为对照组的12倍(Umasuthan et al,2016)。本研究中,大弹涂鱼感染迟缓爱德华氏菌后,肾、脾、肝、皮肤和鳃中Bppis1 mRNA表达结果与上述论文中的结论相似,只是峰值数据和到达峰值的时间点略有差别,肾、肝、皮肤和鳃中Bppis1 mRNA表达均在8h时达到峰值,分别为对照组的 15.51、5.84、60.86和 3.78倍(P＜0.05),脾中Bppis1 mRNA表达在12h达到峰值,为对照组的20.6倍(P＜0.05),揭示Bppis1可能在大弹涂鱼抗迟缓爱德华氏菌感染过程中发挥重要作用。

夏霖醒过来已经是第二天了。她记得，她跟着吴琮到了农贸市场，发现他被几名学生欺负，于是报了警。后来警察及时赶到，吴琮受了伤，被送去了医院。那伙人被拘留，她也被叫去了派出所，于是知道了所有事情的前因后果。吴琮每天回家都会路过那个农贸市场，几个同校的男生盯上了他，他们时不时就来欺负吴琮。几个学生为了掩人耳目，就编故事说那儿闹鬼，其实所谓的鬼叫声就是吴琮挨打的叫声。吴琮因为性格原因，被人欺负了也不愿跟任何人说。

研究发现,piscidin对病毒、细菌、真菌和寄生虫均有抑制作用,主要通过破坏细菌、真菌和寄生虫的细胞膜发挥直接的抑制活性(Chinchar et al,2004;Campagna et al,2007;Sung et al,2008;Hayden et al,2015;Li et al,2016;Umasuthan et al,2016;Pan et al,2017)。体外抑菌实验结果表明,人工合成或重组表达的 piscidin成熟肽具有广泛的抗细菌活性,对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制作用(Bae et al,2016;Umasuthan et al,2016)。例如,在条石鲷中,重组表达的piscidin (pOf-Pis)对Vibrio tapetis、大肠杆菌和海豚链球菌均有较强抑菌活性,MIC分别为22.5、45和45µg/mL,对迟缓爱德华氏菌抑菌活性较弱,MIC大于90µg/mL,并且不能完全抑制迟缓爱德华氏菌的生长(Umasuthan et al,2016);人工合成的 piscidin(RbPisc)对海豚链球菌、哈维氏弧菌和奥氏弧菌(V.ordalii)的抑菌活性非常强,MIC均低于0.9µg/mL,对大肠杆菌、溶藻弧菌、坎氏弧菌(V.campbellii)和创伤弧菌抗菌活性较强,MIC分别为1.9—3.9、0.9—1.9、1.9和3.9—7.8µg/mL,对迟缓爱德华氏菌几乎没有抑制活性,MIC 为 250—500µg/mL (Bae et al,2016)。在罗非鱼中,人工合成的 piscidin 3 (TP3)和 piscidin 4(TP4)对创伤弧菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、铜绿假单胞菌(Pseudomona aeruginosa)、无乳链球菌(Streptococcus galactiae)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)均有较强的抑菌活性,而 TP1、TP2和 TP5没有明显的抑菌活性(Peng et al,2012)。在大黄鱼中,人工合成的 piscidin (Lcpis5lt3)对单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和嗜水气单胞菌具有明显的抗菌效果,对迟缓爱德华氏菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和海豚链球菌无明显抑制作用(Yang et al,2016)。本研究中,人工合成的Bppis1成熟肽对大肠杆菌和弧菌科6种细菌有明显的抗菌活性,MIC为 6.25—50μg/mL,但对迟缓爱德华氏菌以及3株革兰氏阳性菌无抗菌活性,与上述研究结果有明显差异,说明不同鱼类的 piscidin对相同细菌的抗菌活性不同,Bppis1可能仅具有抗革兰氏阴性菌活性。

新近研究表明,罗非鱼TP3和TP4能通过影响免疫相关基因,如转移生长因子(transforming growth factor β,TGF-β)和细胞因子类白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-8等mRNA的表达来发挥免疫调节功能(Lin et al,2016;Pan et al,2017)。此外,Huang等(2015)研究发现,2.5—10µg/mL TP4不仅能刺激纤维原细胞系(Hs-68)和角化细胞系(HaCaT)的增殖,也能影响TGF、血管上皮生长因子和表皮生长因子调节的伤口闭合活性,从而增加耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)感染大鼠的存活率。本研究发现,大弹涂鱼 MO/MΦ经1.0μg/mL的Bppis1处理后,对创伤弧菌的吞噬作用显著增强,揭示Bppis1也具有免疫调节功能,可能通过促进免疫细胞的吞噬活性发挥作用,但具体作用机制尚待进一步研究。

4 结论

本研究测定了大弹涂鱼Bppis1基因cDNA序列,序列分析揭示其与黄条piscidin序列最为相似。健康大弹涂鱼中,Bppis1 mRNA在鳃中表达量最高;感染迟缓爱德华氏菌后,Bppis1 mRNA在大弹涂鱼肝、脾、肾、皮肤和鳃中表达量均显著上调。体外抑菌实验结果表明,人工合成的 Bppis1成熟肽对大肠杆菌和弧菌科 6种细菌有明显的抗菌活性。大弹涂鱼MO/MΦ经1.0μg/mL Bppis1成熟肽处理后,对创伤弧菌的吞噬作用显著增强。综上,Bppis1对革兰氏阴性菌具直接的抗菌活性,且与细菌诱导的免疫反应密切相关,可能通过促进 MO/MΦ的吞噬活性发挥作用。研究结果为进一步研究鱼类piscidin的生物学功能及其在鱼类病原体感染防御反应中的作用机制提供基础资料。

参 考 文 献

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