原发性肝癌(primary carcinoma of the liver, PLC,以下简称肝癌) 是临床上最常见的恶性肿瘤之一。PLC在我国高发，目前我国发病人数约占全球的55%[1]。以美洲大蠊提取物为原料的消癥益肝片，临床上用于治疗原发性肝癌疗效显著，使用后可使病人肝大回缩显著，肝区痛感减轻、食欲增加、乏力好转、腹胀减轻，甲胎蛋白下降，带瘤患者生存期延长[2]，但该药的抗肿瘤药效物质基础尚未阐明。研究发现，美洲大蠊中的化学成分主要有氨基酸、蛋白质、多肽、脂肪酸、信息素、壳聚糖等[3]。

国内外对美洲大蠊抗肿瘤活性成分的研究多为粗分离产物或肽类物质的作用[4-6]，对小分子活性物质研究较少。本课题采用 MTT法追踪抗肿瘤活性，并利用Sephadex LH20和反相高效液相色谱对消癥益肝片中的小分子活性物质进行研究，旨在为该药的进一步应用及质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用消癥益肝片浸膏干燥粉末由福州海王金象中药制药有限公司提供。

1.2 试剂与仪器

DMEM 培养基（Invitrogen公司）；胎牛血清（PAN-Biotech公司）；Penicillin-Streptomycin双抗；胰酶（GIBCO公司）； MTT（Sigma公司）；DMSO（AR,国药集团）。

Sephadex LH20葡聚糖凝胶（GE公司）；反相液相色谱柱Chromatorex C18柱（250 mm × 20 mm，10 μm），TPQ05-2546WT（250 mm ×4.6 mm）（北京慧德易科技有限责任公司）；Bruker AVANCE III 500氢核磁共振（Bruker公司）。

化合物Ⅰ 无色针状结晶（甲醇）; UV (MeOH) nm：228;ESI-MS m/z: 1 (500 MHz, δ: 7.95 (2H, d, J = 10.0 Hz, H-2,6),7.50 (2H, t, J = 10.0 Hz, H-3,5), 7.62 (1H, t, J = 10.0 Hz, H-4)。以上理化性质与光谱数据与文献[8]苯甲酸数据对照相符，故鉴定化合物Ⅰ为苯甲酸。

1.3 方法

HepG2细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基，细胞培养环境为，消化、收集处于对数生长期的HepG2细胞，按每孔4×103个细胞/100 μL接种到96孔板中。各实验组分别加入不同浓度的化合物（以DMEM稀释），每种浓度设5个平行孔。置于培养箱中常规培养24、48、72 h 后，每孔加入 5 mg/mL MTT 20 μL，继续培养 4 h，小心吸去上清，每孔加入 100 μL DMSO充分溶解，于酶标仪570 nm处测定吸光值。

化合物Ⅱ 无色针状结晶（甲醇）; UV (MeOH) nm：257; ESI-MS m/z: 165 (500 MHz, DMSO) δ: 7.81 (2H, d, J = 10.0 Hz,H-2,6), 6.84 (2H, d, J = 10.0 Hz, H-3,5), 4.25 (2H, q,J = 10.0 Hz, ), 1.29 (3H, t, J = 10.0 Hz, )。以上理化性质与光谱数据与文献[9]对羟基苯甲酸乙酯数据对照相符，故鉴定化合物Ⅱ为对羟基苯甲酸乙酯。

⑤预备费，在编制竣工财务决算时，不应只在其他费用一栏反映。从《教程》举例看，基本预备费具体使用的项目均是建筑工程，而应按《规程》要求反映预备费的具体使用项目，在建筑工程栏反映。

经MTT法检测，组分1-3和1-4体外抑制肿瘤细胞增殖的活性较强，对这两个组分进行进一步的分离纯化。将粗提物组分溶于70 %甲醇，经0.22 μm滤膜过滤后上样于Chromatorex C18反相液相色谱柱。组分1-3以甲醇-0.2%甲酸水（55：45）恒比例洗脱，柱温30 ℃，检测波长228 nm，流速为10 mL/min，收集保留时间为12.5 min的馏分。组分1-4以甲醇-0.2%甲酸水（55：45）洗脱，检测波长254 nm，流速为10 mL/min，分别收集保留时间为18.8 min和42min的馏分。馏分浓缩后以250 mm×4.6 mm的反相液相色谱柱检测纯度为 97.94%、98.45%和96.64%，分别为化合物I（5 mg）、II（1 mg）和 III（3 mg）。

1.3.2 细胞培养与体外增殖抑制实验[7]

1.3.1 提取和纯化

采用 MTT法测定化合物 I～III对肝癌细胞HepG2生长的抑制作用，作出剂量-反应曲线（图1～3），用SPSS16.0计算化合物对HepG2细胞的半数抑制浓度（IC50）。三个化合物均有体外抑制HepG2细胞增殖的活性，其中化合物II和III作用较强，并呈时间-剂量依赖关系；而化合物I的作用较弱，实验中不表现剂量依赖。化合物 II作用于HepG2细胞48、72 h的IC50分别为87.7、61.5 μg/mL，化合物III作用于HepG2细胞48、72 h的IC50分别为 48.6、17.3 μg/mL。

用SPSS 16.0软件计算相应物质的半数抑制浓度（）。

2 结果

2.1 体外抗肝癌活性检测

细胞增殖抑制率（%）=（对照组吸光值-实验组吸光值）/对照组吸光值×100%。

城镇化动力机制是新型城镇化研究的关键，构建有效的“就地城镇化”动力机制对于推动我国城镇化的进程具有极其重要的理论价值和实践意义。当下，我国人口就地就近城镇化动力来自两大驱动源:国家宏观战略政策与农村产业结构优化。

  

图1 化合物I对HepG2细胞增殖的抑制活性Fig.1 The anti-proliferation effects of compound I on HepG2

  

图2 化合物II对HepG2细胞增殖的抑制活性Fig.2 The anti-proliferation effects of compound II on HepG2

  

图3 化合物III对HepG2细胞增殖的抑制活性Fig.3 The anti-proliferation effects of compound III on HepG2

2.2 结构鉴定

我国木质坐具的出口金额和出口数量在今年上半年还是保持着持续的增幅，其他家具的出口数量尽管有增长，但出口金额却出现不同程度的下降，这对我国家具出口金额的下降有一定的影响。

30 g消癥益肝片浸膏经70 %乙醇超声浸提2次，离心过滤的上清经浓缩后，以0.22 μm滤膜过滤，上样于Sephadex LH20葡聚糖凝胶柱。用70 %甲醇以1 mL/min的流速进行洗脱，并记录280 nm下的色谱曲线。根据记录的色谱曲线合并洗脱液，旋转蒸发仪浓缩蒸干溶剂，得到1-1、1-2、1-3、1-4四个粗提物组分。

化合物Ⅲ 无色针状结晶（甲醇）; UV (MeOH)nm：257; ESI-MS m/z: 179(500 MHz, DMSOδ: 7.81 (2H, d, J = 10.0 Hz,H-2,6), 6.85 (2H, d, J = 10.0 Hz, H-3,5), 4.16 (2H, t, J= 5.0 Hz,), 1.70 (2H, q, J = 5.0 Hz,), 0.95(3H, t, J = 5.0 Hz, 。以上理化性质与光谱数据与文献[10]对羟基苯甲酸丙酯数据对照相符，故鉴定化合物Ⅲ为对羟基苯甲酸丙酯。

  

图4 化合物I～III的结构图Fig.4 Chemical structure of compound I～III

3 小结

近年来，中医药制剂在控制肝癌病情发展、防止复发转移、延长生存期和减轻痛苦等方面的应用中越来越受到重视。消癥益肝片是以美洲大蠊提取物为主要成分的中药制剂，有破瘀化积、消肿止痛的功效，临床治疗原发性肝癌有一定疗效。研究显示，美洲大蠊的提取物在体外可有效抑制肝癌细胞生长[11]，还可降低人肝癌细胞 Bel-7402 线粒体膜电位，诱导肝癌细胞中Bax的表达，同时抑制Bcl-2的表达，通过线粒体途径诱导 Bel-7402和SMMC-7721细胞凋亡[12-13]。此外，有研究显示，美洲大蠊提取物有抑制人肝癌细胞 Bel-7402裸鼠移植瘤生长、下调血管内皮生长因子 ( VEGF) 的作用[14]，并提高H22肝癌小鼠的胸腺指数、肝脏指数及脾脏指数[15]。这些研究多针对美洲大蠊的粗分离产物或活性肽类物质，对其中的小分子活性物质研究较少。

本课题利用MTT法，以抑制HepG2肝癌细胞增殖活性为指标，通过Sephadex LH20、RP-HPLC等色谱方法，分离得到了3个活性小分子化合物；采用 MS、等光谱学方法分析，其结构分别为苯甲酸（I）、对羟基苯甲酸乙酯（II）、对羟基苯甲酸丙酯（III），均为首次从消癥益肝片中分离得到。本研究结果表明，三个化合物均有体外抑制HepG2细胞增殖的活性，其中对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯对HepG2肿瘤细胞作用较强，呈时间-剂量依赖关系，作用于 HepG2细胞 48 h的IC50分别为87.7、48.6 μg/mL；作用72 h的IC50分别为61.5、17.3 μg/mL。有研究表明，对羟基苯甲酸乙酯可通过生成邻醌，耗竭胞内GSH，生成活性氧(ROS)和产生线粒体毒性，在黑色素瘤细胞SK-MEL-28中发挥细胞毒作用[16]。但化合物 I～III在HepG2细胞中的作用尚未见报道。本课题后续将对几个化合物在肝癌细胞中的作用机制作进一步的研究。

现阶段，一些能源企业在环保工程施工过程中，其工艺流程的规范性严重缺失，很难取得良好的环保效果。对于科学、合理的工艺流程来说，可以节省诸多成本，并确保回收利用效率的稳步提升[3]。比如，在环保工程建设中，出现了大量的重金属污染土壤，进而急需处理，然而在固废处理中心中，处理费用约为2500元/t，但是如果企业将产生的重金属污染土壤掺入进固化剂，形成路基填充材料，其处理成本仅需要原方案的1/5。所以在这种工艺流程安排的影响下，可以将处理废料成本保持在合理范围内，并提高废弃材料的回收利用效率，进而对环保工程理念进行有效落实。

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参考文献：

[1]Wang F S, Fan J G, Zhang Z, et al. The global burden of liver disease: the major impact of China[J]. Hepatology,2014,60(6):2099-108.

[2]陈利铭,李平途,林民. 消(疒征)益肝片治疗原发性肝癌的继续观察[J]. 福建中医药, 1990,21(1):4-5,12.

[3]何正春,彭芳,宋丽艳,等. 美洲大蠊化学成分及药理作用研究进展[J].中国中药杂志, 2007, 32(21):2326- 2331.

[4]何正春,刘光明,王晓雨,等. 美洲大蠊神经肽的研究进展[J].中国现代药物应用,2008,20(01): 180-186.

[5]Jiang Y, Wang X, Jin C, et al. Inhibitory effect of Periplaneta Americana extract on 3LL lung cancer in mice[J]. Chinese Journal of Lung Cancer, 2006, 9(6):488.

[6]Wang X Y, He Z C, Song L Y, et al. Chemotherapeutic Effects of Bioassay-Guided Extracts of the American Cockroach, Periplaneta americana[J]. Integrative Cancer Therapies, 2011, 10(3):NP12-23.

[7]曾常爱,孙小春. dentonin对牙髓干细胞增殖的实验研究[J]. 井冈山大学学报:自然科学版,2017, 38(3):93-95.

[8]冯卫生,曹彦刚,李方,等. 桑白皮各化学拆分组分化学成分研究[J].世界科学技术-中医药现代化,2015,17(3):492-498.

[9]郑兆广,王汝上,汤丹,等. 桑白皮化学成分的研究[J].天然产物研究与开发, 2011,23(3):399-400,403.

[10]何常明. 苦参和山豆根黄酮类成分及其生物活性的比较研究[D].上海:复旦大学,2010.

[11]闫爽,高孟婷,郑园园,等. 美洲大蠊、斑蝥提取物对3株人肿瘤细胞增殖抑制作用的研究[J]. 中国民族民间医药, 2017(10):33-37.

[12]王晶,李鑫. 美洲大蠊提取物对人肝癌细胞Bel-7402作用机制的研究[J].中国现代应用药学, 2012(10):876-880.

[13]董京千. 美洲大蠊提取物诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡及作用机制的初步研究[D].锦州:辽宁医学院,2013.

[14]梁刚,张丹,张红,等. 美洲大蠊多肽对人肝癌细胞Bel-7402裸鼠移植瘤生长的抑制作用[J]. 中国新药杂志, 2016(6):687-691.

[15]陈俊雅,耿玲,张旭强,等. 美洲大蠊提取物 CⅡ-3对H_(22)肝癌小鼠血管生成作用的研究[J]. 肿瘤学杂志,2012, 18(4):274-276.

[16]Vad N M,Shaik I H,Mehvar R,et al. Metabolic bioactivation and toxicity of ethyl 4-hydroxybenzoate in human SK-MEL-28 melanoma cells.[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, 97(5):1934-45.