0 引言

人类肺癌大多数起源于上皮细胞，镍化合物和苯并(a)芘(benzoapyrene，Bap)代谢物主要作用于呼吸道上皮细胞对人形成致癌作用[1]。16HBE细胞是人的支气管上皮细胞，通过不同的化学致癌物作用，其可发生恶性转化，常用作肺癌疾病等相关性研究的实验模型。人群流行病学调查和动物实验已经证明，结晶型硫化镍(NiS)和反式二氢二醇环氧苯并芘(anti-7, 8, -dihydrodiol-9, 10-epoxide benzo (a) pyrene，BpDE)具有恶性转化人支气管上皮细胞的能力，以致肺癌为主[2]。

自噬是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，被称为Ⅱ型程序性死亡，是真核细胞特有的生命现象[3-5]。我们课题组前期利用经NiS和反式-BpDE诱导的恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2已经证明自噬途径参与了肺上皮细胞16HBE癌变的过程，但具体的作用机制还需要进一步研究[5]。为了研究自噬途径在肺上皮细胞癌变中的作用机制，我们利用前期建立的细胞恶性转化模型，采用荧光显微镜动态细胞成像系统，通过绿色荧光质粒的转染实验，在无损伤状态下实时观测活细胞发生自噬的动态变化[6]。

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFp)在哺乳动物细胞表达稳定，荧光显微镜又容易检测，因此GFp是常用的标记分子[7-11]。LC3是自噬体相关蛋白，LC3-Ⅱ对于自噬体的形成十分必要，有研究表明LC3-Ⅱ的数量和自噬体的数量存在一一对应的关系，因而LC3-Ⅱ被普遍认为是哺乳动物自噬体的标记物[12-14]。 GFp-LC3质粒可表达绿色荧光蛋白，将其转染到目的细胞，表达稳定后就可用荧光显微镜进行活体细胞动态观察。正常条件下，LC3在胞质内弥散分布，因此可根据GFp荧光细胞的数量和分布衡量细胞或组织的自噬行为[15-17]。在观察GFp-LC3分布的实验中，我们发现16HBE的转染效率总比16HBE-T1和16HBE-T2低，这个现象引起了我们的兴趣。

为了探究这个现象是否和细胞恶性转化有关，我们在三种细胞中又转染了可表达无特异性功能的增强型绿色荧光细胞示踪标记蛋白的荧光质粒eGFp，并同时采用多种细胞密度进行转染。通过两种荧光标记，我们可以判断是否由于质粒特异性导致转染效率的差别；多种细胞密度转染后的结果可以进一步证实细胞恶性转化过程中细胞发生的变化。我们通过一系列的转染实验，分析其差异性原因，为探讨恶性转化细胞的癌变过程提供更直观的细胞学证据。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人支气管上皮细胞系16HBE、结晶型NiS诱导的16HBE恶性转化细胞16HBE-T1和反式-BpDE诱导的16HBE恶性转化细胞16HBE-T2来自广州医科大学医学分子流行病学实验室。

昌马灌区为一完整的盆地，四周群山环绕，南为祁连山，西有北截山，北有桥湾北山、饮马北山，东为干峡。盆地内地形平坦开阔，地势南高北低，南部为昌马洪积扇，中北部为细土平原。疏勒河是区内规模最大的河流，沿昌马洪积扇东部边缘呈南北向，进入细土平原后又呈东西向，向西流入双塔水库。昌马灌区控制面积3 330km2，可耕地 110万亩（1 hm2=15亩，下同），灌溉面积 68.9万亩,主要以地表水灌溉为主、地下水灌溉为辅，灌区内布设32眼地下水监测井，自2001年开始监测。

1.2 试剂及仪器

位于里耶卡的格罗布尼克赛道才是我们的目的地，但沿途的酒店和一个个美好的夜晚同样会在我们的脑海中留下深刻的记忆。每当参加这种规模庞大的选题时，我总喜欢用测试期间享用的晚餐和酒店作为标签帮助巩固自己的记忆。在这次的经历中，我记录下了这三个地名：帕尔马诺瓦、波尔托罗以及皮兰。

1.3 细胞培养

16HBE、16HBE-T1和16HBE-T2三种细胞分别置于用10%FBS、100 U/mL霉素、100 mg/mL链霉素和RpMI1640培养基配制的完全培养液中，放入细胞培养箱。每天换液，2-3天传代一次，取对数生长期细胞进行实验。

胎牛血清(FBS)，RpMI1640培养基(GIBCO)，opti-MEM培养基(GIBCO)，Lipofectamine3000 Reagent(GIBCO)，GFp-LC3和eGFp质粒(来自于广州医科大学医学遗传学与细胞生物学实验室)，荧光显微镜IncuCyte Zoom长时间动态细胞成像分析系统(Essen Bioscience)。

1.4 细胞转染

GFp-LC3和eGFp质粒在转染后12 h即开始在细胞内表达[19]。采用荧光显微镜观察活体细胞，由于GFp为绿色荧光，显微参数为480 nm激发波长，320 nm发射波长[20]。每一孔细胞拍摄4个视野，最后观察比较其荧光细胞数量差异。

为了探讨三种细胞转染效率的差别是否因为GFp-LC3质粒的特异性而造成的，我们还转染了另一种质粒eGFp做比较。结果发现，如图2所示，16HBE的荧光细胞数量仍然明显低于16HBE-T1和16HBE-T2。此实验结果说明，正常细胞16HBE转染eGFp质粒的效率低于恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2；转染质粒种类的差异不是造成这三种细胞转染效率差异的原因。

1.4.2 eGFp质粒

其次，空空如也的木桶是多么沉重！因为他装载的不只是煤炭，更是鲜活的肉身，这活着的该死的肉身实在太沉重，他既有尊严感却又偏偏需要物资的侍候，想象一下骑桶者每次提着空桶前去借煤时的惶恐不安且借而不得的绝望与屈辱，他该有多么痛恨这肉身的沉重！为什么肉身就不能轻盈起来呢？——必须骑着木桶前去，如此就好像把沉重的生活骑在了胯下；必须骑着木桶前去，如此肉身就轻盈起来；轻盈的肉身，把沉重的生活骑在胯下的肉身，是活着的根本目的。——木桶必须飞起来。显然，这是木桶飞起来的生存论依据，他超越于地球引力之上，是合乎情理的心理现实。

（1）土料的塑性指数、渗透指数、有机质含量、易熔盐含量、最大干密度和pH值等试验指标均满足规程要求，可作为堤身填筑土料。

在GpF-LC3的转染实验中，细胞之间的转染效果呈现差异。如图1所示，通过比较三种转染后的细胞，我们发现恶性转化的细胞绿色荧光分布均匀、密度大，而16HBE的荧光细胞数量明显低于16HBE-T1和16HBE-T2。实验结果说明正常细胞16HBE转染GFp-LC3的效率明显比恶性转化细胞16HBE-T1和16HBE-T2低。

1.5 荧光显微镜观察

1.4.1 GFp-LC3质粒

2 结果

2.1 用GFp-LC3质粒转染，16HBE细胞的转染效率比16HBE-T1和16HBE-T2低

和上述操作一致，将eGFp质粒转染至三种细胞中。共得到两个分别转染了不同质粒的96孔板。

  

图1 细胞密度达100% 时GFp-LC3的转染荧光图和透视图Fig.1 Transfection fluoroscopy and scenograph of cell which is transferred with GFp-LC3 when the cell abundance is 100%

  

图2 细胞密度达100% 时eGFp的转染荧光图和透视图Fig.2 Transfection fluoroscopy and scenograph of cell which is transferred with eGFp when the cell abundance is 100%

2.2 用eGFp质粒转染，16HBE细胞的转染效率比16HBE-T1和16HBE-T2低

将三种细胞接种于96孔板中，设置50%、75%和100%的细胞密度，每一种细胞按每一个密度接种两个副孔，每一孔加入完全培养液100 μL放入37 ℃，5%CO2培养箱中培养至相应密度。转染时，以一种细胞为例，去除每孔细胞培养液，加入100 μL opti-MEM培养基后放回培养箱待用。取一Epp管加入opti-MEM培养基40 μL和Lipofectamine3000试剂8 μL，混匀，配成A液。另取一Epp管加入opti-MEM培养基40 μL，质粒DNA 1.2 μg和p3000试剂4 μL，混匀，配成B液。将AB液充分混匀，室温静置10-15 min。将制备的DNA-脂质体混合液平均加入每一孔待转染的细胞中，放回培养箱孵育6-8 h后替换为完全培养液，继续培养12-36 h收获细胞[18]。

2.3 不同细胞密度的转染实验

由于有些细胞在不同密度下的转染效率差别较大，因此为了探究造成三种细胞转染效率的差异是否由于转染时细胞密度的原因，我们又设置了另外两个细胞密度的转染实验。从实验结果来看，如图1、图3和图 4，图2、图5和图6所示，不仅细胞与细胞之间，每一种细胞在不同细胞密度时的转染效率也是有差异的。横向比较在50%、75%和100%的细胞密度的转染效率，我们发现每一种细胞均在细胞密度大概为75%时的转染效率是最高的。但与此同时，16HBE的荧光细胞数量都是少于16HBE-T1和16HBE-T1。因此，该实验结果说明细胞密度并不是造成三种细胞转染效率差异的原因。

  

图3 细胞密度达50% 时GFp-LC3的转染荧光图和透视图Fig.3 Transfection fluoroscopy and scenograph of cell which is transferred with eGFp when the cell abundance is 50%

  

图4 细胞密度达75% 时GFp-LC3的转染荧光图和透视图Fig.4 Transfection fluoroscopy and scenograph of cell which is transferred with GFp-LC3 when the cell abundance is 75%

  

图5 细胞密度达50%时eGFp的转染荧光图和透视图Fig.5 Transfection fluoroscopy and scenograph of cell which is transferred with eGFp when the cell abundance is 50%

  

图6 细胞密度达75%时eGFp的转染荧光图和透视图Fig.6 Transfection fluoroscopy and scenograph of cell which is transferred with eGFp when the cell abundance is 75%

3 讨论

细胞转染实验目前在研究基因功能、调控基因表达和蛋白质生产等生物学实验中应用非常广泛，是实验室中很常用和有效的实验研究方法。阳离子脂质体是目前转染效率最高，且细胞毒性最小的非病毒基因载体之一。其转染效率与脂质体成成份、脂质体与质粒DNA的比例、细胞状态、转染时间以及靶细胞的选择性作用有关[21]。

目前，研究自噬的定量分析方法多使用GFp-LC3法，即通过转染可表达GFp-LC3融合蛋白的质粒，使LC3携带有绿色荧光，从而可通过荧光显微镜观察细胞内LC3的定位和分布[22]。因此，我们想通过荧光蛋白质粒的瞬时转染来观察细胞自噬的情况。在此过程中，我们意外发现了正常细胞和恶性转化细胞在平行条件下的转染效率差异，由此进行了两组转染实验。eGFp增强型绿色荧光蛋白是一种优化的突变型绿色荧光蛋白，其荧光比野生型强35倍，具有结构稳定、高效表达、无种系依赖性等特点，更适用于细胞基因表达和蛋白定位检测及细胞示踪标记[23]。在利用GFp-LC3和eGFp质粒分别对三种细胞进行转染的实验中，结果发现无论是GFp-LC3还是eGFp，正常细胞的转染效率都低于恶性转化细胞，这就排除了质粒本身造成此差异的原因。为此，我们还尝试比较了在多种细胞密度下，各种细胞的转染效率是否还存在差异性。实验结果证实在不同的细胞密度下，正常细胞的转染效率仍然低于恶性转化细胞。

综上所述，本研究发现在利用脂质体法转染正常细胞和恶性转化细胞的实验中，质粒的种类差异和转染时的细胞密度都不是造成它们转染效率差异性的原因。为此，我们猜测是由于恶性转化细胞在癌变过程中发生了细胞膜通透性的改变，从而导致了在转染过程中，细胞吸收外源质粒的程度不一样。但是要明确细胞膜通透性影响转染效率的具体作用机制，需要我们进一步的研究。

1）在调压井口修筑混凝土锁口，并在周围修建排水沟、截水沟，防止雨季地表水流入井内。在井口边设置1.4 m高的防护栏，0.35 m高的挡脚板。

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