甲状腺癌是最常见的内分泌异常的恶性肿瘤，占女性所有类型恶性肿瘤的5%左右，在中国，每年约有20 000的恶性甲状腺癌患者死亡[1-2]。甲状腺乳头状癌(PTC)是甲状腺恶性肿瘤中最常见的肿瘤类型，约占80%[3]。针对甲状腺乳头状癌的治疗目前主要采取手术联合放疗，但是治愈率不高[4]。探讨新型肿瘤分子标记物是目前急需解决的问题。

目前研究指出参与甲状腺乳头状癌发展的最常见的遗传改变包括RET-RAS-BRAF基因激、RET基因重排、BRAFV600E点突变及RAS突变等[5]。虽然这些遗传改变会导致相同的信号通路的激活，但针对其具体机制作用的发挥目前不甚清楚。在人类基因组中，每个miRNA可以控制多个基因靶标，并且可以通过翻译抑制调控相应蛋白的表达。关于基因表达模式的调节，miRNA类似于直接调节靶基因表达的DNA结合转录因子及其直接靶向于分子通路，负责特定的生物学现象。关于如何在甲状腺癌中转录和转录后水平调节miRNA的信息有限[6]，有研究通过结合核小体染色质标记以及DNA序列鉴定了175个miRNA的启动子区域，用于预测调控miRNA的转录因子，探讨miRNA在不同恶性肿瘤类型中的候选转录起始位点及生物学表达模式[7-8]。圆柱菌酶(cylindromatosis，CYLD)是卵巢肿瘤家族中的一种泛素-羧基末端水解酶，其由分解各种细胞蛋白质中的赖氨酸酶连接多聚蛋白链组成[9]。CYLD在多种组织中均有表达，但其精确的生物学功能仍然不确定[10]。体外转染研究结果表明，CYLD通过蛋白水解酶来降低NF-κB活性干扰肿瘤细胞的生长[11]。但CYLD和miRNA之间的直接作用缺乏研究证据。

老秦用摩托车搭着我，离家好远了，回头一看，妈还抱着孩子站在门口。我的眼泪一下子出来了。我哭着喊：“妈啊，妈，我对不起你，对不起你！”老秦说：“你别哭了。”说完，他也哭了。

1、提高农民文化素质，就要从整体上提高农村教育水平，在普及九年义务教育的同时，将职业技术培训纳入农村中、小学教育体系，从小培养各种技能，提高农民的综合素质，尤其加强培养养殖技术、种植技术以及农用机械的兴趣。

本实验通过研究miR-181b和CYLD在甲状腺乳头状癌中的表达情况及相互作用，抑制miR-181b表达后甲状腺癌细胞株的增殖和凋亡行为的变化情况来推测miR-181b在甲状腺癌中的表达模式，明确其对甲状腺乳头状癌细胞的调控作用，为甲状腺癌乳头状癌的发病机制和发展过程的进一步研究提供参考。

收集2016年7月至2017年1月在我院手术切除并且经病理检查确诊为甲状腺癌患者30例的病变组织，同时取30例癌旁正常人的组织。离体后放入4%多聚甲醛中固定。人甲状腺乳头状癌细胞株FTC-133、IHH-4、TPC-1和K1细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养。miR-181b-inhibitor和阴性对照(NC)购自中国上海GenePharma生物有限公司。脂质体Lipofectamine 2000、miR-181b-inhibitor和NC组模拟物购自上海吉凯基因，TRIrizol购自美国Ambion公司，逆转录试剂盒(FSQ-101)购自日本TOYOBO公司，PCR试剂盒购自美国Kapa公司。

1 材料与方法

1.1 细胞株及实验材料

完善的灌溉管理制度可以加速农业节水灌溉技术的推广，促进农业经济的发展。在灌溉管理制度中，要重视对农业节水灌溉技术的宣传，使更多的农民可以更加了解农业节水灌溉技术，调动农民采用农业节水灌溉技术的积极性。

流式细胞术检测甲状腺乳头状癌细胞凋亡情况。将FTC-133细胞以2×105/孔的浓度接种在6孔板中，分别用NC和miR-181b-inhibitor转染，转染72 h后，通过FITC标记的AnnexinV/碘化丙啶细胞凋亡检测试剂盒检测凋亡细胞，实验重复3次。

1.2 定量实时PCR分析

采用SPSS 22.0软件，计量数据以均数±标准差表示，2组间均数比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

1.3 蛋白质印迹测定

使用RIPA缓冲液提取总细胞裂解物，通过配置12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，并转移到PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭，并在4 ℃下与一抗(浓度1∶1 000)一起孵育过夜。随后，将膜与二抗孵育，最后用ECL底物试剂盒检测，实验重复3次。

1.4 细胞克隆形成实验

细胞克隆形成实验结果显示(图3)，miR-181b-inhibitor实验组的细胞克隆形成数目明显低于NC对照组[(351.2±25.6)vs.(112.6±18.6)]，差异具有统计学意义(P<0.05)。表明抑制miR-181b的表达后，甲状腺乳头状细胞FTC-133的增殖能力受到一定的抑制。

1.5 流式细胞仪分析

第二次开庭原定于半月后，但被一拖再拖。法官告知杨律师，被告还在搜集证据。杨律师说被告能搜集什么证据呢，明摆着是拖延时间嘛。法官开着玩笑，说天这么热，等凉快点的。杨律师明白了，对方的关系已伸到法官这儿了。法官有时也不好做，两边为难，只要有官司，总有说情的，原告被告都能找到路子，防不胜防。

1.6 统计分析

将细胞接种在12孔板中，生长至50%融合以进行siRNA转染，90%用于质粒转染。根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2 000转染质粒和siRNA。在转染后第3天，收获细胞，并使用TRIZOL试剂提取总RNA。使用ImProm-II TM逆转录系统对总RNA水平进行qPCR分析。所有反应用Step-One Plus实时PCR系统进行，实验重复3次。

2 结果

2.1 miR-181b在甲状腺乳头状癌组织和细胞中的表达情况

通过Western blotting检测miR-181b调控CYLD的表达水平。结果显示，在miR-181b-ibhibitor组中CYLD的表达水平比NC组的明显降低[(0.55±0.11)vs.(2.39±0.32)，P<0.05]，见图2，表明抑制miR-181b的表达后，CYLD蛋白的激活水平相应下调。

 

a:miR-181b在甲状腺乳头状癌组织和正常组织中的表达；b:miR-181b在不同甲状腺乳头状癌细胞株中的表达

图1 miR-181b的表达情况

2.2 miR-181b与CYLD之间的调控关系

qPCR结果表明：与癌旁正常组织相比(图1)，甲状腺乳头状癌组织中miR-181b表达水平明显较高[(2.21±0.31)vs.(0.62±0.17)]，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-181b在FTC-133胞株中表达水平比IHH-4、K1、TPC-1细胞株明显增高[(1.86±0.18)vs.(0.89±0.11)vs.(0.86±0.14)vs.(1.07±0.11),P<0.05](图1)。综合上述试验结果，挑选FTC-133为进一步生物学功能实验的细胞株。

2.3 miR-181b调控甲状腺乳头状癌细胞的增殖行为

将NC组细胞和miR-181b-inhibitor组细胞分别以2×103浓度接种在6孔板中，在37 ℃孵箱孵育2周，每3 d更换新鲜培养基，2周后在显微镜下观察细胞形态，计数细胞克隆形成数目，对比2组之间的差异，实验重复3次。

  

a:Western blotting检查CYLD;b:Western blotting结果定量分析

图2 Western blotting检测miR-181b对CYLD蛋白表达的调控

  

a:对照组;b:miR-181b组;c:2组细胞数量定量分析

图3 克隆形成实验检测miR-181b对甲状腺乳头状癌细胞增殖能力的影响

2.4 miR-181b调控甲状腺乳头状癌的凋亡行为

细胞凋亡实验显示，miR-181b-inhibitor实验组的细胞凋亡比率明显高于NC对照组[(2.28±0.27)vs.(0.75±0.18)，P<0.05]，差异具有统计学意义，表明抑制miR-181b的表达后，甲状腺乳头状癌细胞的凋亡行为得到一定程度的促进。

目前，一些经济较发达的省份(如江苏和浙江)甚至已经开始禁止使用或新增化学镀镍工艺，给当地制造业中的表面处理带来了很大困难。

  

a:对照组；b:miR-181b组

图4 流式细胞术检测miR-181b对甲状腺乳头状癌细胞凋亡行为的影响

3 讨论

在不同甲状腺肿瘤的组织病理学类型具有不同的miRNA差异谱，反映了在miRNA在肿瘤中的特异性致癌突变[12]。从其发现的早期阶段，已经知道许多miRNA以组织特异性方式表达[13]。因此，研究miRNA在甲状腺肿瘤之间的表达模式有重要的临床意义。在甲状腺乳头状癌中经常观察到miR-181b的表达异常现象[14]。然而迄今为止，miR-181b和甲状腺乳头状癌之间的关系尚未完全了解。本研究结果表明miR-181b在肿瘤性甲状腺乳头状细胞中具有一定的致癌作用，作为CYLD蛋白的调节因子参与甲状腺癌细胞的增殖和凋亡过程。事实上，据其他学者的相关报道指出，miR-181b在其他肿瘤中也可观察到明显的上调状态，包括胶质瘤细胞系，前列腺癌细胞系和转移性乳腺癌细胞系[15-17]。miR-181b可能有一定的肿瘤组织特异性和依赖性，其与基因表达调控的复杂网络相关联，在不同类型的恶性肿瘤中可以靶向不同的下游蛋白种类[18]。类似地，CYLD蛋白在恶性肿瘤中具有相似的作用，在上皮衍生的肿瘤中作为调控因子发挥作用，并且可作为间质源性肿瘤的上皮-间质转化的肿瘤启动子因子[19]。因此，miR-181b对CYLD蛋白的调控可能是甲状腺乳头状癌中独特的表达模式。

恶性肿瘤细胞的增殖潜力取决于调控因子对细胞周期阻滞的能力。miR-181b与甲状腺乳头状癌细胞的增殖能力密切相关，而且可以通过调控CYLD的表达介导FTC-133细胞的细胞周期停滞，表明miR-181b具备一定的促细胞增殖的能力。miRNA分析的结果提供了更多的证据来支持肿瘤细胞具有独特的上调miRNA并且与常规肿瘤类型不同，尤其是腺瘤和癌之间的表达差异。根据之前的相关研究，指出miRNA表达谱在特定肿瘤类型中具有显着的变异性[20]。本实验的研究数据表明，在这三种miRNA中，miR-181b在所有类型的滤泡细胞衍生的甲状腺肿瘤中以及甲状腺增生性结节中都存在过表达状态，且和甲状腺乳头状癌细胞的增殖和凋亡行为直接相关。

总体而言，本实验观察到甲状腺乳头状癌的肿瘤类型和miR-181b表达之间的具有显著相关性，与甲状腺乳头状癌的表型特征及生物学特性相关。且miR-181b的表达和CYLD的表达之间的具体调控机制尚不清楚，但miR-181b的确可以影响甲状腺乳头状癌的生长和增殖，可能被用作临床甲状腺乳头状癌的治疗和预后标志物。

[参考文献]

[1] Vaccarella S,Franceschi S,Bray F,et al.Worldwide thyroid-cancer epidemic the increasing impact of overdiagnosis[J].New Engl J Med,2016,375(7):614-617.doi:10.1056/NEJMp1604412.

[2] Londero SC,Krogdahl A,Bastholt L,et al.Papillary thyroid microcarcinoma in Denmark 1996-2008:a national study of epidemiology and clinical significance[J].Thyroid,2013,23(9):1159-1164.doi:10.1089/thy.2012.0595.

[3] Rahib L,Smith BD,Aizenberg R,et al.Projecting cancer incidence and deaths to 2030:the unexpected burden of thyroid,liver,and pancreas cancers in the United States[J].Cancer Res,2014,74(11):2913-2921.doi:10.1158/0008-5472.

[4] Davies L,Morris LG,Haymart M,et al.American Association of Clinical Endocrinologists and American College of Endocrinology disease state clinical review:the increasing incidence of thyroid cancer[J].Endocrine Practice,2015,21(6):686-696.doi:10.4158/EP14466.DSCR.

[5] Seo JY,Kim EK,Baek JH,et al.Can ultrasound be as a surrogate marker for diagnosing a papillary thyroid cancer?Comparison with BRAF mutation analysis[J].Yonsei Med J,2014,55(4):871-878.doi:10.3349/ymj.

[6] Erler P,Keutgen XM,Crowley MJ,et al.Dicer expression and microRNA dysregulation associate with aggressive features in thyroid cancer[J].Surgery,2014,156(6):1342-1350.

[7] Haugen BR,Alexander EK,Bible KC,et al.2015 American Thyroid Association management guidelines for adult patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer:the American Thyroid Association guidelines task force on thyroid nodules and differentiated thyroid cancer[J].Thyroid,2016,26(1):1-133.doi:10.1089/thy.2009.0110.

[8] Graham MER,Hart RD,Douglas S,et al.Serum microRNA profiling to distinguish papillary thyroid cancer from benign thyroid masses[J].J Otolaryngol Head Neck Surg,2015,44(1):33.doi:10.1186/s40463-015-0083-5.

[9] Draber P,Kupka S,Reichert M,et al.LUBAC-recruited CYLD and A20 regulate gene activation and cell death by exerting opposing effects on linear ubiquitin in signaling complexes[J].Cell reports,2015,13(10):2258-2272.doi:10.1016/j.celrep.2015.11.009.

[10] Hrdinka M,Fiil BK,Zucca M,et al.CYLD limits Lys63-and Met1-linked ubiquitin at receptor complexes to regulate innate immune signaling[J].Cell reports,2016,14(12):2846-2858.doi:10.1016/j.celrep.2016.02.062.

[11] Zhao X,Jin B,Yang B,et al.Gadolinium chloride ameliorates acute lung injury associated with severe acute pancreatitis in rats by regulating CYLD/NF-κB signaling[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2017,492(2):255-261.doi:10.1016/j.bbrc.2017.08.061.

[12] Debette S,Verbaas CAI,Bressler J,et al.Genome-wide studies of verbal declarative memory in nondemented older people:the Cohorts for Heart and Aging Research in Genomic Epidemiology consortium[J].Biological psychiatry,2015,77(8):749-763.doi:10.1016/j.biopsych.2014.08.027.

[13] Zhu C,Ren C,Han J,et al.A five-microRNA panel in plasma was identified as potential biomarker for early detection of gastric cancer[J].Bri J Cancer,2014,110(9):2291-2299.doi:10.1038/bjc.2014.119.

[14] Liu J,Shi W,Wu C,et al.miR-181b as a key regulator of the oncogenic process and its clinical implications in cancer[J].Biomedical reports,2014,2(1):7-11.doi:10.3892/br.2013.199.

[15] Sun Y,Wang J,Guo C,et al.MiR-181b sensitizes glioma cells to teniposide by targeting MDM2[J].BMC cancer,2014,14(1):611.doi:10.1186/1471-2407-14-611.

[16] Tao T,Liu C,Huang Y,et al.Mp55-15 involvement of Mir-181b-mediated ezh2/igf-1r signalling pathway in the growth and energy metabolism of prostate cancer[J].J Urol,2015,193(4):e678.doi:10.1016/j.juro.2015.02.2058.

[17] Strotbek M,Schmid S,Sánchez-González I,et al.miR-181 elevates Akt signaling by co-targeting PHLPP2 and INPP4B phosphatases in luminal breast cancer[J].Int J Cancer,2017,140(10):2310-2320.doi:10.1002/ijc.30661/full.

[18] Zheng Y,Lv X,Wang X,et al.miR-181b promotes chemoresistance in breast cancer by regulating bim expression[J].Oncology reports,2016,35(2):683-690.doi:10.3892/or.2015.4417.

[19] Xu D,Zhou P,Wang Y,et al.Reciprocal activation between STAT3 and miR-181b regulates the proliferation of esophageal cancer stem-like cells via the CYLD pathway[J].Molecular cancer,2016,15(1):40.doi:10.1186/s12943-016-0521-7.

[20] 涂超峰,肖 岚,武明花,等.MiRNA基因及miRNA相关基因单核苷酸多态性与肿瘤易感性[J].国际病理科学与临床杂志,2014,33(6):520-524.doi:10.3969/j.issn.1673-2588.2013.06.014.