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血吸虫病现代诊断技术的研究现状

更新时间:2009-03-28

血吸虫病(schistosomiasis)是一种严重危害人民身体健康和生命安全、影响流行区社会经济发展的人兽共患寄生虫病。据报道,2014年,全国推算血吸虫病人115 614人,现存晚期血吸虫病30 880例(Lei et al.,2015)。湖南、湖北、安徽、江西、江苏等省血吸虫病的流行情况调查表明在局部地区血吸虫病传播风险仍然较大(韩阳清等,2014;肖瑛等,2014;张世清等,2015)。

血吸虫病是一种与社会、自然环境密切相关的疾病。目前,其流行特点是以低度感染为主,传统的诊断技术对早期感染血吸虫的患者敏感性不高,导致血吸虫病的漏诊误诊率极高,成为了临床疑难杂症,直接影响到治愈率(Yu et al., 1998)。其次,血吸虫病是组织脏器寄生虫病,传统检测方法取材定点不易,难度较大,有创伤性,也给血吸虫病的诊断带了很大的困难。

生物医学技术的快速发展,推动了血吸虫病诊断技术的发展,并在灵敏、特异、快速,以及稳定性方面体现出了明显的优势,给血吸虫的诊断带来了新方法、新技术。本文综述了针对血吸虫病诊断的免疫学检测新技术、核酸检测新技术、传感检测新技术等方面的最新研究进展。

1 免疫学检测新技术

免疫诊断(immunodiagnosis)是应用免疫学的理论、技术和方法诊断各种疾病和测定机体免疫状态,是诊断检测血吸虫病的重要手段。近年来,由于我国对血吸虫病的预防和控制的力度不断加强,我国血吸虫病感染人群和感染度也得到了大幅度的下降,急性感染和重度感染已较少见,但是湖沼型和山丘型的高山峡谷亚型流行区仍是血吸虫病的主要流行地区,并且以隐性感染或者低度感染为主(周晓农,2006)。传统的病原学检查已很难在粪便中查出病原体,免疫诊断由于有较好的灵敏度、快速、稳定、方法灵活多样等的优点,已成为疫区血吸虫诊断的主要途径。生物医学技术的快速发展,为寻找灵敏度更高,更快捷方便的免疫学检测方法提供了技术支持。

1.1 磁珠酶联免疫分析法

免疫磁珠(ImpetiCbead,IMB)是一种包被有免疫培基或特定化学集团的球形磁性微粒,可特异性地与靶物质结合使之成为具有磁响应性的复合物。磁微粒分离酶联免疫分析法(Magnetic affinity enzyme-linked immunoassay,MEIA)最早出现于1988年,利用磁性微球液相分离代替普通酶联免疫微孔板包被法的固相分离,将磁分离与酶联免疫技术相结合(Moscoso et al., 1988)。此法成为近年来发展起来的一项新的免疫学技术。

随着医学检测技术与化学技术、新型材料的快速发展和各种技术的互相渗透,也出现了新的血吸虫病的检测方法。利用传感器这一高灵敏的信息获取装置与高特异性的免疫反应相结合,构建了一种新型的传感检测技术,此技术也广泛的用于了寄生虫的检测。

无念:张恨水先生是我们安徽著名的高产作家,比之《八十一梦》的诙谐、《啼笑因缘》的颠倒、《北燕南飞》的悲情,《金粉世家》更多地表达了时代变革中的无奈与警醒,而这一点也是我国当代社会可以借鉴的。

随着聚合酶链反应(PCR)及相关技术的快速发展,核酸检测也越来越深入可在血清学变化之前检测出感染程度,并且更加微量、灵敏。近年来,由于核酸检测所具有良好特性,使其在血吸虫病早期感染的检测中得到越来越多的关注,除常规的PCR方法之外,更多改进方法被应用临床检测,大大降低了检出限,提高了检出率。

1.2 试纸条法

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)最早由日本的Notomi提出(Notomi et al.,2000),近年来由于其操作简便、反应时间短、特异性高并具有可视性等优点得到越来越多关注。Feng等(2016)利用环介导等温扩增技术建立了针对日本血吸虫钉螺的检测方法,并达到了可视化。此方法可检测出含1%的阳性钉螺样本,并根据反应的颜色改变来判断检测结果。Xu等(2012) 分别采用PCR、LAMP对20名正常人血清样品30个血清学血吸虫样品DNA进行检测,发现LAMP的敏感性达96.7%,而PCR只有60%,表明LAMP优于常规的PCR技术,对于血吸虫病的早期诊断具有一定的价值。

鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate, S1P)是广泛存在于真核细胞的鞘磷脂代谢产物之一。S1P既可作为第二信使直接作用于细胞内靶点,又可通过S1P转运蛋白或ATP结合盒转运子(ATP-binding cassette transporter, ABCA)转运至细胞外,结合细胞膜表面的5种不同G蛋白偶联受体即S1P受体(sphingosine-1-phosphate receptors, S1PRs),参与调节炎症过程中组织细胞的生长和凋亡,免疫细胞的增殖、迁移,及血管内皮细胞的通透性[1]。

《海鸥食堂》里幸惠在芬兰的食堂菜单主打饭团,因为饭团是日本的传统食物,但是更重要的是幸惠的个人原因。幸惠的母亲过世地早,家务都是她来做,父亲每年只在运动会和远足的时候做两次饭团。父亲只做有鲑鱼、梅干、鲣鱼的饭团,难看却好吃。饭团对幸惠来说,是从小持家的辛苦中的最幸福的期待,也是从小母爱缺失,父爱的以另一种形式的弥补,正是因为如此,对于海鸥食堂的菜品选择上如此坚持,不仅是因为饭团是传统的日本食物,更重要的是它给她带来母爱和父爱的满足感。

2 核酸检测新技术

Yu等(2012 a)利用MEIA研究建立了针对血吸虫病检测的SEA-MEIA方法。其将日本血吸虫SEA与羧基磁性微球表面偶联,将磁球表面的SEA作为捕获抗原,用来检测感染小鼠血清的抗体,同时也应用于人血清抗体的检测。结果表明:与传统的SEA-ELISA相比,SEA-MEIA具有更高的平均P/N值(5.74 versus 4.13),灵敏度较高,有望在血吸虫病的现场检测中推广。

2.1 实时定量荧光PCR

实时定量荧光PCR(Real-Time PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用不同荧光信号尽量检测核酸的技术(Li et al., 2009)。Real-Time PCR技术成为生物定量分析的重要技术。在2008年,我国就有利用Real-time PCR检测日本血吸虫的报道,可在3 h内完成对基因组检测浓度为6.15 pg的检测(Zhou et al., 2008)。近年,Huang等(2008)报道了关于采用Real-time PCR技术检测不同水源中的日本血吸虫尾蚴,设计了一对相应引物,采用TaqMan探针技术,检测极限低于尾蚴DNA当量的50%,用Real-Time PCR检测日本血吸虫尾蚴不同浓度的重复样本的结果与光镜计数呈线性相关,此方法可用于疫水中日本血吸虫尾蚴的检测。

2.2 重组酶聚合酶扩增技术

高脂血症病是是动脉硬化发生,发展的危险因素之一,既往认为高脂血症等对健康的危害很少发生于儿童时期,而目前认为在成人期危害健康的因素,在儿童期同样危害儿童健康[1.2],虽然冠心病在中年以后起病,但其病灶却在儿童时期已存在。为此,我们对超重及肥胖儿童血脂紊乱的检出率和危险因素分析。

卢福庄等(2013)研制了敏感、高效,实用性强的针对牛血吸虫感染的检测纸条。实验以乳胶微球标记的兔抗牛 IgG 为探针,以可溶性抗原为检测线,以羊抗兔 IgG 为质控线,建立一种检测牛日本血吸虫病的试纸条检测法。许瑞等(2015)利用胶体金标记重组蛋白G,制备了用于家畜血吸虫病检测的胶体金免疫层析试纸条。

2.3 环介导等温扩增技术

试纸条法由于其操作简单,成本较低,可长期保存,不受实验条件限制的优点,被逐步用于现场对血吸虫病的快速筛查和诊断,如胶体染料试纸条法(DDIA)、乳胶微球标记的试纸条法、胶体金免疫层析试纸条等。用于SEA制作的DDIA对血吸虫病的检测有较高的特异性、敏感性及较低的交叉反应(Xu et al., 2011),可用于推广进行低度血吸虫病流行区的筛查。

3 传感检测新技术

目前,磁珠酶联免疫分析法也被应用在血吸虫检测中,利用此法对人体血吸虫抗体进行检测,其检测敏感性较高,取得了良好的疗效考察价值。与ELISA相比此法更加方便、快捷。重组日本血吸虫SEA(Yu et al., 2012 a)、提取的谷胱甘肽S-转移酶(rSj26GST)(Yu et al., 2012b)和制备的Sj14-3-3蛋白(Yu et al., 2014)现已用于MEIA,比ELISA法特异性强、敏感度高的效果已被证实。该方法可替换ELISA法用于血吸虫病低流行区的检测。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification, RPA)就是在常温下依赖于单链结合蛋白(Single strand DNA-binding protein, SSB)、链置换DNA聚合酶及能结合单链核酸的重组酶进行核酸扩增,并在恒温条件下对模板上特定的靶序列DNA片段进行扩增(Rosser et al.,2015)。该技术也逐渐运用到血吸虫病的检测研究中(樊晓旭等,2016)。Sun等(2016)利用RPA技术对感染日本血吸虫患者粪便样本中的SjR2序列进行扩增,其敏感度达5 fg,并与ELISA和IHA做对照分析,结果表明其特异性、敏感度均高于常规的ELISA和间接红细胞凝集试验(Indirect haemagglutination test, IHA)技术。Xing等(2017)采集了流行区日本血吸虫感染者的粪便样本,对其SjR2序列进行扩增,结果显示,该方法可在15 min内检测出日本血吸虫的DNA,敏感度达0.9 fg。RPA技术适用于现场的检测,对样品的纯度要求低、操作简单、花费时间少,而且实验结果肉眼可观。

将半波长解释结果与附近钻孔资料进行对比,结果表明:相速度频散曲线的半波长解释结果与钻孔资料接近,见表1。

3.1 电化学免疫传感器

电化学传感器因其较高的识别能力、制备简单、高效等优点是免疫传感器中研究较早,传感器种类多样,是一种比较成熟的技术。利用这一方法,通过夹心式免疫反应利用HBR催化H2O2成熟在晶振表面形成不溶性沉积物,放大检测信号,制备了一种血吸虫电化学免疫传感器(Che et al.,2008)。在此基础上,Zeng等(2012)开发了基于印刷电极的日本血吸虫免疫传感器,采用循环伏安法和示差脉冲伏安法检测两种戊二醛交联(GA)和壳聚糖戊二醛(Chit-GA)传感器对血吸虫抗原的不同滴度的敏感性。GA传感器和Chit-GA传感器检测范围分别为1/1000~1/400,1/1000~1/500,电流电压与与血清效价成正比。此传感器反应灵敏,检测抗体滴度线性范围宽,并呈良好的线性关系。此外,新兴的电化学免疫阵列(Electrochemical immunosensor arrays, ECISA)使用SEA和重组日本血吸虫钙结合蛋白(SjE16)做抗原来检测血吸虫抗体,结果表明敏感性100%,交叉反应极低,可用于低感染区血清的大规模筛查(Deng et al.,2013)

3.2 光学免疫传感器

贵金属(如金)纳米结构的使用被作为光学生物传感器结合检测的方法已经成为引人注目的途径,随着生物医学技术的发展,纳米金标记技术也成为现代4大免疫标记技术之一。纳米金在免疫检测领域中不仅可以作为电学标记,同时还可以作为很好的光学标记也发挥着越来越广泛的作用。

利用纳米金优良的物理化学特性探索制备用于针对日本血吸虫的光学免疫传感器,对与日本血吸虫病的早期诊断有重要意义。何鑫等(2015)构建了固相金纳米棒光学免疫传感器,检测早期不同时间段的感染日本血吸虫的兔血清抗原。结果显示,在检测感染7 d后的兔血清抗原,纳米金棒的传感器呈阳性,而IHA检测结果是阴性。此传感器对感染日本血吸虫病的兔血清抗原具有早期的识别能力。此方法不仅为血吸虫病的早期诊断提供了新的有效的方法,同样也可以用于其他早期诊断困难的寄生虫病,值得进一步研究和推广。

4 展望

近年来,生物医学各个学科的快速发展和互相渗透,也为日本血吸虫病甚至寄生虫病的检测带来了新的检测方法。通过我们多年共同的努力,以及国家对寄生虫预防和治疗的大量投入,我国血吸虫病防治取得了显著成效,总体上呈下降趋势(雷正龙等,2014)。但面对目前日本血吸虫感染率和感染度的下降,如何做好低度感染的流行状态下病人的快速诊断和早期诊断,仍是我们工作的重点。现在检测技术由于其灵敏度高,特异性强,制备简单,对环境污染小等优点,为我们提供了很多的新型检测方法,但也容易出现交叉反应,不同产品的质量控制等问题亟待我们进一步的研究。但新技术的出现,势必为我国血吸虫的预防、诊断、治疗,提供了新的技术保障。

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陈海霞,李家萌,孔玉方
《寄生虫与医学昆虫学报》2018年第01期文献

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