0　引言

克伦特罗(Clenbuterol,CLE)是一种β-肾上腺素受体激动剂，最初作为一种饲料添加剂用于畜牧业养殖，能够显著地提高动物瘦肉率，俗称“瘦肉精”[1]。人食用残留有CLE的肉制品后会引起如心悸、头晕、心跳加快等中毒症状[2]，对人的身体健康造成危害。因此，我国明文禁止CLE用于饲料添加剂，规定在动物性食品中不得检出CLE[3]。

目前，分析CLE残留常用的方法有气相色谱串联质谱法[4]、液相色谱串联质谱法[5-6]、高效液相色谱法[7]、酶联免疫吸附法[8-9]和胶体金免疫层析法(Colloidal gold lateral flow assay,CGLFA)[10-11]等。前4种方法具有灵敏度高、准确性好、特异性强的优点，不过检测时间长、操作复杂、费用高，不适合大量样本的现场筛查。CGLFA具有快速、简便和费用低等优点[12]，但该检测方法灵敏度较差，一般只用于定性分析。随着国家对快速检测产品性能要求的提高，建立一种灵敏度高、操作简便、可现场使用的快速定量免疫层析方法具有重要的意义[13-14]。

沟槽回填分区域采用不同的密实度（见图1），垫层Ⅰ区中粗纱和管基Ⅱ区砂砾料压实度≥95%，压实相对密度≥0.75；管身Ⅲ区回填土压实度≥90%，压实相对密度≥0.7；缓冲覆盖层Ⅳ区，回填土与Ⅲ区同时进行，但管顶1/3外径范围内的回填土不准碾压；复耕区Ⅵ区，回填清表土，留有适当的沉降量。这种回填方式，使管道顶部的填土处于中松侧实的状态，形成一定的拱效应。

时间分辨荧光微球(Time-resolved fluorescent nanobeads,TRFN)是基于镧系元素的新型标记材料[15]，其在延迟时间的帮助下可区分特异性荧光信号和非特异性背景荧光信号，检测灵敏度较高[16-17]。本文以TRFN为标记材料，制备CLE单克隆抗体-TRFN复合物为探针，优化抗体标记使用量、偶联抗原使用量和微孔复合物体积等主要参数，建立快速定量检测CLE的时间分辨荧光微球免疫层析法(TRFN-LFA)。

（5）专家组。一是专家的选取制度不全面。专家选聘：评审专家是水行政主管部门选聘的。目前虽然有专家选聘的原则，但在实际工作中，规定还需细化。如对于不同等级的论证会议，专家的资质无明确的要求，不同部门和行业的专家选聘原则比例不确定；管理部门在选聘专家是否选本部门的人员做专家有顾虑，既担心企业会在评审前后干扰管理人员，影响评审的结果，又担心其他部门人员对论证的管理工作方面缺乏了解等等。评审费用标准：目前关于水资源论证专家评审费用标准没有统一的指导。评审标准的不确定性既不利于邀请评审专家，又不利于与企业评审费用支出，容易产生误解，进而影响到论证管理工作。评审方式、标准需完善。

1　材料与方法

1.1　仪器与试剂

人们常说的云计算，就是借助虚拟化的技术对多种多样的信息、资源进行有效的综合，为用户提供更具有拓展性的虚拟化的平台。借助云计算就可以将那些位于不同地区的资源进行合理的集中式处理，就像服务器、移动端、存储等。全部位于不同的节点以及不同介质的数据信息和资源进行合理的汇集，这就构成了所谓的“云”[1]。云计算的出现打破了传统的信息和资源储备的最大限值，可以让资源以及信息的储存更加贴合无限大，可以在很大程度上降低用户端处置海量信息的压力。

图4设定中心埋深不同质量也不同相同，z1=20m，z2=40m，m1=400，m2=1000。对该模型利用式(8)进行成像。

1.1.2　主要试剂材料　时间分辨荧光微球(TRFN，1%，固体含量，w/v；羧酸酯修饰的Eu(Ⅲ)-螯合物掺杂的聚苯乙烯微球；激发波长为365 nm，发射波长为615 nm，南京微测生物科技有限公司)；CLE单克隆抗体和CLE-BSA偶联抗原(江西中德生物工程有限公司)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，Sigma公司)；羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；硝酸纤维素膜(NC膜)(Sartorius公司)；吸水纸、样本垫和结合垫(上海金标生物技术有限公司)；微孔板(深圳金灿华生物制品有限公司)；克伦特罗(Clenbuterol,CLE)、莱克多巴胺(Ractopamine,RAC)、沙丁胺醇(Salbutamol,SAL)、马布特罗(Mabuterol,MAB)、特布他林(Terbutaline,TER)等标准品均采购自Sigma公司，其他试剂均为分析纯(天津永大化学试剂有限公司)。

为了说明本文所提出模型的优点,现将模型(11)—(14)应用于例1。取m=110, n=20, p=50和m=110, n=120, p=50这两个特例进行计算,其终止条件为状态方程右端不大于10-5,计算结果见表2。由表2可知,相比于模型(11)—(14),本文提出的模型运行时间短,迭代次数少且精确度较高。

1.2　试验方法

1.2.1　TFRN-CLE单克隆抗体探针的制备　采用EDC方法将TFRN表面的羧基与CLE单克隆抗体上的氨基偶联，取5.0 μL TRFN(10 mg/mL，w/v)加入到0.5 mL pH6.0的0.05 mol/L硼酸缓冲液中，混匀后超声1 min，加入5.0 μL、0.5 mg/mL新鲜配制的EDC溶液，充分混匀后将其置于250 r/min 20 ℃摇床反应15 min。将50 μL CLE单克隆抗体(浓度分别为2 μg/mg、3 μg/mg和5 μg/mg)滴加到该溶液中。置于250 r/min 20 ℃摇床反应2 h，加入50 μL封闭缓冲液(将1.0 g 牛血清白蛋白(BSA)和0.1 mL Tween-20加入到10.0 mL0.05 mol/L、pH 7.0的硼酸缓冲液中)封闭2 h。取出后在4 ℃下以14 000 r/min离心20 min，弃去上清液，将沉淀物用500 μL复溶液(将0.02 g BSA和0.05 mL Tween-20加入到10.0 mL 0.05 mol/L pH 7.0的硼酸缓冲液中)溶解。

1.2.2　NC膜上检测线和质控线的喷涂　检测线(Test line，T线)：将CLE-BSA偶联抗原用0.01 mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释成0.2 mg/mL、0.4 mg/mL和0.8 mg/mL，用XYZ3000点膜仪将稀释好的抗原溶液喷到NC膜上作为T线，喷量为0.74 μL/cm。

质控线(Control line，C线)：将羊抗鼠IgG用0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释成0.6mg/mL，用XYZ3000点膜仪将稀释好的溶液喷到NC膜上作为C线，喷量为0.74 μL/cm，C线与T线之间间隔5 mm。

喷好T、C线的NC膜，放置于37 °C恒温干燥箱中干燥8 h。

融资平台出现债务急速膨胀、盈利能力微乎其微、资金运营缺乏效率，而部分平台尚未建立内审机构，未配备专职的内审人员，未建立起对潜在风险因素的识别、防范和控制。具体表现在：第一，未设内审机构，有的形式上设内审机构，未配备专职内审人员；第二，对于企业的偿债能力过于乐观，缺乏对偿债风险的考虑。融资平台资产负债率偏高、收益率偏低，仍不断借新债还旧债。第三，融资平台不重视企业的财务及经营分析，对于只需要通过简单分析就能发现、识别的风险，融资平台不理会，任其恶化发展。

[3]　　　中华人民共和国农业部,中华人民共和国卫生部,国家药品监督管理局.中华人民共和国农业部公告第176号-禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录[A].2002.

1.2.4　TFRN-LFA检测方法与结果判定　将一定体积的CLE单克隆抗体-TFRN复合物置于微孔中，加入110 μL样本，充分混匀，5 min后用微量移液器取出微孔中全部液体加入到组装好的试纸条样本垫上，10 min后，用时间分辨荧光微球试纸条检测仪读取检测线和质控线信号强度的比值(T/C)结果，检测原理参见图1。

  

图1　时间分辨荧光微球免疫层析法检测原理

结果判定：经过时间分辨荧光微球试纸条检测仪读取T/C数据，代入到本检测方法的标准曲线公式中，计算样本中CLE含量。20个阴性样本实际测得值的平均值加上3倍标准差，为本方法的检测限(Limit of detection,LOD)。标准曲线上50%抑制率(IC50)对应的标准品浓度为本方法的IC50值。

1.2.5　TFRN-LFA最佳条件的评价与选取　以TFRN上CLE抗体标记量、CLE-BSA喷膜浓度、微孔中CLE-TFRN探针体积为因素，设计三因素三水平正交试验，优化本试纸条工艺参数，具体见表1。选取IC50最小的条件为最终工艺条件。

 

表1　三因素三水平正交试验表

  

因素水平TFRN上CLE抗体标记量/μg·mg-1235CLE-BSA喷膜浓度/mg·mL-10．20．40．8微孔中CLE-TFRN探针体积/μL125

1.2.6　标准曲线的制定　CLE标准品用蒸馏水溶解，并用0.01 mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液配制成0.01 μg/L、0.03 μg/L、0.09 μg/L、0.27 μg/L、0.81 μg/L系列标准溶液，用最佳条件试纸条检测，每个浓度检测3次，绘制标准曲线。

慕容慎行教授是福建省神经医学专业的创始人之一，以其精湛的医术和崇高的医德，诠释了“医者仁心，行医为民”的大爱精神，为福建省神经病学事业的发展贡献了毕生的精力。他致力于肌肉疾病、神经遗传病及脑血管病领域的科研工作；培养硕士研究生16名、联合培养博士研究生3名。发表论文共180余篇，出版学术专著8本。曾获得福建省科技进步一等奖、福建省医药卫生科技进步一等奖等科技奖27项。荣获“中国医师奖”、“中国杰出神经内科医师终身成就奖”、“全国援外战线先进工作者”、“福建省优秀共产党员”、“福建省先进工作者”、“福建省杰出人民教师”、“福建省卫生系统先进工作者”等荣誉称号。

[6]　　　郭平,万建春,祝建新,等.超高效液相色谱串联质谱法测定猪尿中22种β_2-受体激动剂残留量[J].分析试验室,2017,36(6):717-721.

2　结果与分析

2.1　TFRN-LFA最佳条件

正交优化条件的结果如表2所示。当TFRN上CLE单抗标记浓度为3 μg/mg，CLE-BSA偶联抗原用量为0.4 mg/mL，微孔内CLE单克隆抗体-TFRN体积为5 μL时(第5组)，IC50最小，为0.06 μg/L，因此选择该条件为最佳优化条件。

 

表2　正交试验优化结果

  

组别抗体标记量/μg·mg-1T线抗原浓度/g·L-1每孔中CLE抗体-TFRN探针的体积/μL/孔试纸条IC50值/g·L-1120．210．07220．420．07320．850．07430．220．07530．450．06630．810．12750．250．07850．410．09950．820．14

2.2　标准曲线的绘制

以CLE浓度的对数为横坐标并以T/C值数据为纵坐标作图，建立标准竞争抑制曲线，如图2所示。该标准曲线线性回归方程为y=-1.762 7log(x)+0.418 7，回归系数R2=0.994 5，定量检测范围为0.01～0.81 μg/L，LOD为0.004 μg/L，IC50为0.06 μg/L。

  

图2　时间分辨荧光微球免疫层析法标准曲线

2.3　特异性

试验结果表明(表3)，本方法对克伦特罗的结构类似物RAC、 SAL、MAB、TER交叉反应低，特异性良好。

 

表3　TFRN-LFA与其他结构类似物的交叉反应率

  

名称交叉反应率/%莱克多巴胺RAC<0．01沙丁胺醇SAL<0．25马布特罗MAB<0．01特布他林TER<0．01

3　结论

[1]　　　　He P,Wang Z,Zhang L,et al.Development of a label-free electrochemical immunosensor based on carbon nanotube for rapid determination of clenbuterol[J].Food Chemistry,2009,112(3):707-714.

参考文献：

在狂欢节上，人们不是袖手旁观，而是就在其中生活，而且是大家一起生活，因为从观念上说，它是全民的。[3]

通过对时间分辨荧光微球偶联克伦特罗抗体量、CLE-BSA抗原用量、微孔内CLE抗体-TFRN探针体积的优化，建立了定量检测克伦特罗的时间分辨荧光微球免疫层析法。该方法LOD为0.004 μg/L，IC50为0.06 μg/L，定量检测范围为：0.01～0.81 μg/L，线性较好(R2=0.994 5)，是目前免疫层析检测领域中灵敏度较高的方法，有望在食品安全现场快速检测中发挥积极作用。

1.1.1　主要仪器　XYZ3000点膜仪(Bio-Dot公司)、Milli-Q水处理仪(Millipore公司)、恒温振荡培养箱(智城分析仪器制造有限公司)、恒温干燥箱(上海福玛实验设备有限公司)、时间分辨荧光微球试纸条检测仪(苏州赫尔曼精密仪器有限公司，LED光源，激发波长：365±20 nm，检测波长：615±20 nm)。

[2]　　　Li Z,Wang Y,Kong W,et al.Highly sensitive near-simultaneous assay of multiple “lean meat agent” residues in swine urine using a disposable electrochemiluminescent immunosensors array[J].Biosensors and Bioelectronics,2013,39(1):311-314.

1.2.3　试纸条的组装　将样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸依次粘贴，组装好后用切条机切成试纸条，装入塑料卡壳中。

[4]　　　黄仕稳,曾婷,马丽.气相色谱-质谱法测定动物类食品中盐酸克伦特罗[J].理化检验(化学分册),2014,50(6):763-765.

[5]　　　王凤美,何京橙,张鸿伟,等.超高效液相色谱-串联质谱法检测动物血浆中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇[J].食品安全质量检测学报,2015,6(12):5023-5028.

薄壳蛋不同分量图像如图5所示。得到蛋黄轮廓外形后，提取蛋黄的主要特征参数，包括蛋黄面积与周长和蛋黄拐点数等特征。提取蛋黄拐点数目时，鸡蛋轮廓较平滑，少棱角，所以拐点曲率与非拐点的曲率差别较小，因此使用基于角度的曲率值判断会造成较大的误差；而距离检测法[5-7]是利用离散点的欧式距离的比值来反映图像拐点的特征，较梯度检测法[8-9]更具有抗噪能力，因此选用距离检测法检测蛋黄观点数目。

1.2.7　特异性　在空白样本中添加克伦特罗的结构类似物：RAC、 SAL、MAB、TER，使得其终浓度分别为10 μg/L，用TFRN-LFA试纸条检测，计算相对应的IC50值后，通过公式计算交叉反应率，评价该方法的特异性，每次检测均重复3次。

[7]　　　李娜,刘佩佩,李桂芝,等.高效液相色谱法测定猪肉及血清中盐酸克伦特罗残留量[J].理化检验(化学分册),2015,51(12):1684-1688.

[9]　　　杜海菁.两种新型β-受体激动剂溴布特罗和西布特罗酶免疫分析法的建立[D].苏州:苏州大学,2016.

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为了进一步迈向社会主义文化强国，实现“文化强国”构想，近几年来我国出台了《关于加强文化领域行业组织建设的指导意见》、《关于实施中华文化传承发展工作的意见》等政策，目的是打造一个有利于增长文化软实力的政治环境，同时也方便促进中国影视贸易的发展。