芥蓝(Brassica oleracea var. alboglabra)又名芥兰、盖菜等，染色体数2n=18，是十字花科芸薹属蔬菜[1]，起源于中国南部，在广东、广西、福建和台湾等地区广泛栽培，以肥嫩的花薹、嫩叶为主要食用器官[2]。芥蓝有丰富的种质资源和悠久的栽培历史，由于其含有丰富的维生素C、类胡萝卜素、芥子油苷和多酚等营养物质，而深受消费者的喜爱和欢迎[3]。

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(GGPPS)作为类胡萝卜素生物合成代谢途径中的关键酶，可将一分子的二甲基丙烯基二磷酸(DMAPP)与三分子的异戊烯基二磷酸(IPP)缩合生成类胡萝卜素生物合成代谢途径中最直接的前体物质——牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP) [4]。Ukibe等[5]研究发现，在啤酒酵母中过量表达GGPPS基因，不仅GGPP表达量增加，类胡萝卜素含量也随之增加。此外，GGPP也是叶绿素、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)、维生素K等的前体物质[6-7]。魏攀等[8]利用RNAi技术对烟草中NtGGPPS1进行特异性沉默，植株呈现变矮、花期延迟、质体色素含量降低等现象，结果表明NtGGPPS1可能影响叶绿素和植株生长调节相关的萜类物质的合成。目前，已从拟南芥[9]、番茄[10]、烟草[11]和银杏[12]等多种植物中成功分离出GGPPS基因，然而，芥蓝中尚未有该基因的报道。

鉴于GGPPS基因对类胡萝卜素生物合成的影响及在植物生长发育过程中的作用，本试验拟以芥蓝叶片为材料，采用RT-PCR方法，克隆BoaGGPPS1基因的CDS序列，对该序列进行生物信息学分析；利用半定量PCR对BoaGGPPS1基因在芥蓝不同器官中的表达量进行分析；构建原核表达载体，将该重组质粒转至大肠杆菌体内，诱导表达。为进一步研究BoaGGPPS1基因的生物学功能及该基因所编码的酶在调控芥蓝中类胡萝卜素的含量奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为芥蓝‘明丰香菇′，待幼苗长出3～4片真叶，剪取其新鲜叶片提取总RNA，用于基因克隆。将成熟期芥蓝的根系、花薹、叶柄、叶片、花序、果荚和幼果分别取样并提取总RNA，用于基因表达分析。

1.2 试验试剂

反转录试剂盒(PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit)、DNA分子量标准DL2000、Taq酶、蛋白分子量标准(6 500～200 000) 均购于大连宝生物公司，DNA胶回收试剂盒、异丙基硫代半乳糖苷、氨苄青霉素均购于上海生物工程有限公司，DNA高保真聚合酶、克隆载体pEASY-Blunt、原核表达载体pEASY-Blunt E1、BL21 (DE3)表达感受态细胞、Trans1-T1克隆感受态细胞均购于北京全式金生物技术有限公司。

1.3 总RNA提取与cDNA合成

采用Chen等[13]改良的CTAB法提取芥蓝叶片的总RNA，依据反转录试剂盒说明书进行cDNA合成，并将所得产物于-20 ℃备用。

1.4 基因克隆

根据NCBI已公开的十字花科植物白菜、结球甘蓝等GGPPS基因序列，为BoaGGPPS1基因设计特异性引物(表1)，并合成。PCR扩增体系共40.0 μl：模板1.6 μl，引物(10.0 μmol/L)各1.6 μl，Buffer 8.0 μl，dNTPs (2.5 mmol/L) 3.2 μl，Taq酶0.8 μl，ddH2O 23.2 μl。PCR扩增条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，54 ℃ 20 s，72 ℃ 18 s，40次循环；72 ℃再延伸10 min，最终于12 ℃保存。将产物用琼脂糖凝胶(1.0%)电泳检测后，用上海生物工程有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收目的基因BoaGGPPS1片段。将回收产物与pEASY-Blunt克隆载体连接，转至大肠杆菌Trans1-T1中，涂板后过夜培养，经挑菌、摇菌等操作后，进行菌落PCR筛选，并测序。

1.5 生物信息学分析

利用NCBI-ORF、ExPASy在线软件计算GGPPS蛋白的分子量、等电点、不稳定系数等理化性质，利用TMHMM软件分析和推测蛋白质跨膜结构，利用SignalP4.0 Serve对蛋白质进行信号肽分析，利用SSpro 4.0对芥蓝BoaGGPPS1蛋白进行二级结构分析，利用WoLF PSORT软件进行亚细胞定位，利用NCBI-BLAST及DNAMAN软件进行序列同源性比对及保守结构域分析并构建系统进化树[14-15]。

仿真结果判读是根据虚拟装配过程仿真中的验证结果，依照相关的评价原则，对主装配过程中的干涉情况及人机工程进行分析与评价，对装配顺序、装配路径、装配空间、人机工程等方面存在的问题进行反馈与优化，当通过装配工艺的改进仍然不能满足要求时，需要对产品设计及资源设计进行反馈与优化，直到得到合理的装配工艺。

表1 芥蓝BoaGGPPS1基因克隆及表达所用引物

Table 1 Primer sequences for cloning and expression of BoaGGPPS1 gene

  

引物 引物序列(5′→3′)GGPPS1⁃FATGGCTTCTTCAGTGACTCTAGGTTCATGGPPS1⁃RTCAGTTCTGTCTATTGGCAATGTAGTGGPPS1⁃semiRT⁃FTCGGCGACGAGCTCCGACGGPPS1⁃semiRT⁃RCGGATACGTCAGCTTATCAGCGAT⁃CAAAβ⁃actin⁃FCCACCAATCTTGTACACATCCβ⁃actin⁃RAGACCACCAAGTACTACTGCAC

1.6 基因表达分析

根据已分离的BoaGGPPS1基因碱基序列，设计特异性半定量引物，内参基因β-actin引物参照文献[16](表1)。

以成熟期芥蓝不同器官的cDNA为模板，对BoaGGPPS1基因表达量进行半定量分析。PCR体系(20 μl)为：Taq酶10 μl，上、下游引物各1 μl，模板1 μl，ddH2O 7 μl。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共30个循环，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并利用Gel-Pro软件对电泳图进行光密度分析。基因表达水平用相对于β-actin 基因表达量的百分数值表示。试验设置3次重复，数据用Excel 2013软件进行整理分析。

1.7 原核表达载体构建及表达

利用在线软件Rare Codon Calculator(RaCC)对芥蓝BoaGGPPS1序列进行稀有密码子分析。将原核表达载体pEASY-Blunt E1与纯化回收的BoaGGPPS1基因片段进行连接，将连接产物转至大肠杆菌Trans1-T1体内，转化及筛选方法按1.4的方法，提取筛选出的重组质粒pEASY-Blunt E1-BoaGGPPS1(碱裂解法)，将该重组质粒转入大肠杆菌表达感受态BL21(DE3)中，挑菌后扩大培养至OD值为 0.6～0.8，在37 ℃、1 mmol/L的IPTG条件下，诱导表达8 h后提取蛋白质，最后将待上样样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝R250染色和脱色处理后，观察目的蛋白在大肠杆菌内的表达情况和存在形式[17]。

塑料打包带(绳)是一种单轴取向的塑料捆绑材料，其厚度为0.5～1.2 mm，宽度为12～22 mm。市面上的塑料打包带(绳)的成分主要有聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)三种[1-3]，其填料主要有SiO2、CaCO3、高岭土、滑石粉等[4]。

事例2（图2）：“腾云河”2005年5月6日进港，航经二虎锚地在位1时突遇特大暴雨，凭着平时对岸线的熟悉，位2时转向船首对着缺口位置，就是坭洲头前导标，15分钟特大暴雨过后，船位3在导标线上。该轮项船长也竖起了大姆指。

2 结果与分析

2.1 芥蓝BoaGGPPS1基因的克隆

经NCBI-CDD、序列比对等分析发现，BoaGGPPS1蛋白含有GGPPS酶家族的5个保守结构域，表明BoaGGPPS1蛋白为该家族的一个成员。结果表明GGPPS基因家族不同成员的功能也有所不同，拟南芥中已分离出的12个GGPPSs成员中，AtGGPPS5可能是一个假基因，AtGGPPS12是非功能性的，且GGPPSs在拟南芥中的表达模式也存在明显差异，只有AtGGPPS1和AtGGPPS11在所有器官和组织中均表达，属于组成型表达，其他基因均呈现特异性表达[6]；烟草中已分离出5个GGPPSs成员中，其中NtGGPPS1和NtGGPPS2分别参与了赤霉素与叶绿素的生物合成[20]。本试验目前只从芥蓝中分离得到BoaGGPPS1基因，将在后续的研究中继续分离该基因家族的其他成员，并通过利用基因沉默及过表达等技术手段进一步研究其功能，为今后芥蓝中类胡萝卜素含量调控的研究奠定基础。

2.2 生物信息学分析

利用NCBI-ORF、ExPASy软件对芥蓝BoaGGPPS1基因所编码的蛋白质进行理化分析。试验结果表明，BoaGGPPS1蛋白由370个氨基酸残基组成，共5 634个原子，分子式为C1741H2845N491O543S14，理论分子量为39 790，等电点(pI)为6.07，为弱酸性蛋白质，不稳定指数为45.77，属不稳定蛋白质；脂肪指数为99.68，平均亲水系数为-0.05。利用TMHMM分析发现BoaGGPPS1蛋白无跨膜结构域，属于膜外在蛋白；利用SignalP分析发现BoaGGPPS1蛋白不存在信号肽结构，为非分泌蛋白。利用SSpro 4.0对BoaGGPPS1蛋白进行二级结构分析，发现该蛋白二级结构中α-螺旋(H)占60.6%，β折叠(E)占2.2%，无规则卷曲(C)占37.2%。经WoLF PSORT分析，BoaGGPPS1位于叶绿体。

利用ScanProsite工具预测，BoaGGPPS1蛋白含2个多聚异戊二烯合成酶特征结构域“152LIhDDlpcmDnddlRRG168”和“288IGllFQVvDDIlD300”；依据NCBI-CDD保守结构域分析，发现BoaGGPPS1蛋白属于异戊二烯合成酶家族，含有底物结合袋、两个富含天冬氨酸区域、底物-Mg2+结合位点、特异结构域Trans_IPPS_HT、超家族Isoprenoid_Biosyn_C1等(图2)。将芥蓝BoaGGPPS1氨基酸序列与8种不同植物的GGPPS氨基酸序列分别进行两两比对分析，BoaGGPPS1的氨基酸序列与结球甘蓝(Brassica oleracea var. capitata)、白菜(Brassica rapa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、葡萄(Vitis vinifera)、蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)、苹果(Malus domestica)、可可(Theobroma cacao)、毛果杨(Populus trichocarpa)等的氨基酸序列一致性分别为98%、96%、86%、80%、74%、70%、70%、69%。对这9种植物的GGPPS蛋白氨基酸序列进行多序列比对，试验结果表明，GGPPS蛋白N端高度不保守，而多肽链的中部和C端具有高度保守性(图3)。

  

图1 芥蓝BoaGGPPS1基因CDS及推导的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence of BoaGGPPS1 CDS and its deduced amino acids

  

图2 芥蓝BoaGGPPS1蛋白保守结构域Fig.2 Conserved domain of BoaGGPPS1

  

BoaGGPPS1：芥蓝，BocGGPPS：结球甘蓝(XP_013596174.1)，BrGGPPS：白菜(XP_009141710.1)，AtGGPPS：拟南芥(NP_195399.1)，MdGGPPS：苹果(AHA61556.1)，MtGGPPS：蒺藜状苜蓿(XP_003629488.1)，PtGGPPS：毛果杨(XP_006383249.1)，TcGGPPS：可可(EOX91186.1)，VvGGPPS：葡萄(CAN78430.1)。图3 GGPPS蛋白的氨基酸序列比对Fig.3 Alignment of amino acid sequences of GGPPS

将芥蓝BoaGGPPS1蛋白与其他18种不同植物进行系统进化树分析，采用邻近法(Neighbor-joining)构建系统发育树(图4)，结果表明，该系统进化树主要分为3支，第一支中十字花科的芥蓝与其同科的结球甘蓝、白菜、甘蓝型油菜、山萮菜和拟南芥聚在一起，第二支中蔷薇科的苹果与水蜜桃聚在一起，豆科的蒺藜状苜蓿单独形成一个分支，说明同科植物GGPPS蛋白的同源性更高。在系统进化树中，芥蓝BoaGGPPS1与结球甘蓝BocGGPPS的亲缘关系最近。

2.3 BaGGPPS1基因在芥蓝器官中的表达

将回收纯化的BoaGGPPS1基因片段与表达载体pEASY-Blunt E1进行25 ℃连接15 min，转入克隆感受态中，经阳性筛选、测序等检测后，选择构建好的表达载体，进行重组质粒提取，将提取的重组质粒与空载分别转入表达感受态细胞中，经扩大培养、诱导等步骤后，提取总蛋白质，用SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色检测(图6)，发现重组质粒在BL21(DE3)中进行了表达，并在44 300附近具有特异性表达条带，该结果与预测的39 790相一致。分离上清和沉淀中的蛋白质，发现该蛋白质在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在。

“殊书，这是你妈妈特意交代的。”马副县长不好意思地解释。正在这时，何大爷进来了。这老爷子也不知怎么听说县里来大官了，若不，他是从不登乡政府大门的。只见他一身干净衣裤，一定是吴站长为他洗的。虽然年迈，步履有些蹒跚，可面色红润，腰板硬朗。

  

图4 19种不同植物GGPPS氨基酸序列的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of GGPPS amino acid sequences of 19 different plants

  

图5 BaGGPPS1基因在芥蓝不同器官中的表达Fig.5 Expression of BaGGPPS1 in different organs of Brassica oleracea var. alboglabra

2.4 原核表达

[5] UKIBE K, HASHIDA K, YOSHIDA N, et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for astaxanthin production and oxidative stress tolerance[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(22): 7205-7211.

对BoaGGPPS1基因在成熟期芥蓝各器官中的表达情况进行分析，结果表明，BoaGGPPS1基因在芥蓝各器官中均有表达，但其表达量存在明显差异。BoaGGPPS1基因在芥蓝叶片中的表达量最高，果荚次之，随后是花薹、叶柄、花序和幼果，根系中的表达量最低(图5)。

  

M:Protein marker(6 500～200 000); 1～4为总蛋白质检测; 5～6为上清液中蛋白质检测; 7～8为沉淀中蛋白质检测。1：未诱导空载; 2：诱导空载; 3：未诱导BL(DE3)(pEASY-Blunt E1-BoaGGPPS1); 4：诱导8 h的BL(DE3)(pEASY-Blunt E1-BoaGGPPS1); 5、7：未诱导BL(DE3)(pEASY-Blunt E1-BoaGGPPS1); 6、8：诱导8 h的BL(DE3)(pEASY-Blunt E1-BoaGGPPS1)。图6 pEASY-Blunt E1-BoaGGPPS1在大肠杆菌中的表达Fig.6 Expression of pEASY-Blunt E1-BoaGGPPS1 protein in Escherichia coli

3 讨 论

类胡萝卜素作为自然界中广泛存在的一种脂溶性异戊二烯类色素，具有参与光合调节、生物代谢和生长调节、营养作用、增强免疫力等丰富的生物学功能。本试验成功分离出BoaGGPPS1基因的CDS,全长为1 113 bp，其编码的蛋白酶BoaGGPPS1可能催化底物生成芥蓝类胡萝卜素生物合成途径中的直接前体物质。研究报道，GGPPS是多基因家族，同一植物中GGPPS蛋白家族的不同成员可能位于不同细胞器，并且同一GGPPS蛋白在不同植物中也可能位于不同细胞器[18]。在拟南芥中共发现12个GGPPS成员，通过亚细胞定位检测，GGPPS蛋白位于线粒体、质体或内质网上，烟草中NtGGPPS1位于质体[8]，NtGGPPS3位于叶绿体和质膜[19]。本试验根据WoLF PSORT预测BoaGGPPS1蛋白可能位于叶绿体中，推测其主要参与MEP途径的萜烯类化合物合成。

本试验采用半定量PCR方法对BoaGGPPS1基因在芥蓝不同器官中的表达情况进行分析，该基因在芥蓝的各器官中均有表达，但其表达量存在明显差异，说明该基因表达具有一定的组织特异性。结合BoaGGPPS1基因在芥蓝叶片中的表达量最高，根系中表达量最低的现象，推测该基因可能参与了叶绿素、类胡萝卜素和质体醌等与光合作用相关萜类化合物的合成。

经1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增产物后，得到一条长度约为1 100 bp的特异性条带，该条带大小与预测片段一致。阳性克隆测序后，得到一条长1 113 bp的序列(图1)，并将其命名为BoaGGPPS1。

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2012年6月10日5时，绥宁县枫木团乡黄泥井村一带突降特大暴雨。村干部用专门配发的手摇警报器报警，果断组织危险区3个集中院落200多名熟睡中的群众紧急转移到安全区。6时30分，泥石流奔涌着冲向坡下村庄，冲毁道路6处，冲倒房屋1栋，损毁房屋4间，淹没农田20余亩。由于报警及时，危险区群众无一伤亡。

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对BoaGGPP1基因碱基序列进行稀有密码子分析，结果显示该序列稀有密码子的出现频率较低，且稀有密码子非成串出现，因此选用大肠杆菌表达感受态细胞BL21(DE3)。

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方案一 （PPS含基布滤料）试样针刺工艺路线如图1；方案二、三 （PPS无基布滤料）试样针刺工艺路线如图2。

机械密封，主要由金属滑板、压紧装置(弹性元件)、橡胶织物等三大部分组成，常见的机械密封以弹簧式机械密封为主。

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从生育期观察记载（见表1）情况可知，两地试验膜下滴灌处理的制种玉米拔节期、抽雄期、成熟期较常规漫灌处理均有提前，生育期分别缩短了3d和2d。说明膜下滴灌能促进制种玉米生长发育，缩短生育期。

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岁甲午十月，我年当五十。知命犹未能，知非正其日。堂中伐大鼓，笙竽张四壁。大儿捧兕觥，小儿列瑶席。诸妇玉面妆，诸孙亦林立。拜跪不可数，彩衣纷如织。各各介眉寿，深杯几盈百。九微夺明月，满座皆佳客。颂祝吐奇葩，珠玑已成袭。人生遇欢会，欢会莫此极。我心惨不乐，欲泣不成泣。酸风射眼来，思今倍感昔。[9]272

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（2）黏粒含量大部分满足规程要求，局部地段（寨里村上游400m～杨孟村东长8km的堤段，南四门堤北青村西长10km）的筑堤土料黏粒含量偏高，土料不易压实，施工时应注意质量控制。

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为了使故障判断更为准确，笔者又在MICU侧对N10和Q1的电压进行了测量(图7)，同时也在这一侧做了对地测试，得到的结果还是一样，由此可以非常肯定的得出结论，故障原因在多路控制器MICU，于是进行了更换并且匹配以后，故障得到了彻底的排除。