克隆是目前最常用的一种研究基因功能的方法。传统PCR产物克隆方法主要有2种：黏性末端连接[1]和平末端连接[2]。平末端连接方式操作相对简单，无需经过多次酶切，但是克隆成功率较低。传统的克隆方法看似简单，但试验设计和操作过程比较繁琐，在设计引物时目的片段酶切位点的选择有时受载体上酶切位点的限制，并且这种方法仅适合于克隆单个基因。在多数实际研究中，构建重组载体时会受到载体序列上酶切位点的限制，尤其是多个目的基因片段与载体的重组更容易受到传统载体构建方法不足的影响[3]。因此，开发新的简便快速高效构建载体的方法很有必要。

Aslanidis等[4]在1990年首次提出了不依赖连接反应的克隆(Ligation-independent cloning, LIC)方法。这种克隆方法不受酶切位点的限制，任何基因的片段都可以克隆到载体上，而且无需使用连接酶和内切酶，连接效率高，实验操作也简便。

微管结合蛋白MAP65-1和MAP65-2是植物MAP65蛋白家族中的成员，与酵母中的Ase1家族及脊椎动物中的PRC1家族同源[5-6]。Chang-Jie等[7]用生化方法从烟草(Nicotiana tabacum)BY-2细胞中最先发现了微管结合蛋白，并命名为MAP65，该蛋白质能使微管成束。随后Hussey等[8]发现在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中也存在MAP65家族的成员。目前对模式植物拟南芥中MAP65-1研究较多，因为拟南芥基因组小，生长周期短，利于遗传转化。AtMAP65-2与AtMAP65-1有78%生物序列相似性[9]。AtMAP65-1蛋白质在整个细胞周期都有表达，并且与有丝分裂的纺锤体和成膜体微管的形成有关[6,9-10]。AtMAP65-1可以促进微管聚合并稳定已聚合的微管，AtMAP65-2不参与微管的装配与成核，但在低温下MAP65-2比MAP65-1更能稳定已聚合的微管[11-12]。在本实验室初期的研究中发现UV-B辐射后小麦的根尖产生异常有丝分裂[13]，推测UV-B辐射后MAP65-1和MAP65-2蛋白质的丰度或者亚细胞定位发生改变，进而使微管不能成束，细胞骨架结构破坏，导致纺锤体在多方向上发生牵拉作用使染色体产生聚集或排斥。本研究运用不依赖于连接反应的克隆(Ligation-independent cloning, LIC)方法构建pCHF3-MAP65-1-YFP和pCHF3-MAP65-2-YFP表达载体，为后续研究UV-B辐射下MAP65-1和MAP65-2在细胞中的定位及在有丝分裂各时期的表达奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 选用野生型拟南芥(Col型)，种子先用1%次氯酸钠消毒12 min，再用灭菌的蒸馏水冲洗5次，然后用 0.1% 的琼脂粉水悬浮种子，点种在MS培养基上，4 ℃低温放置3 d后转移至生长室中。生长室的温度为(22±1) ℃，光照度为 5 500～6 500 lx，光周期为16 h∶8 h(光∶黑暗)，相对湿度为70%。

其中wni(x)=wni(x;xn1,…,xnn)是可测权函数, i=1,…,n, w(·)是种宽泛的权函数,很多估计都是这种加权的形式, 如Jackknife估计和最近邻估计。w(·) 是同时与x及设计点列xn1,…,xnn有关, 所以简写为wni，且满足下面基本假设:

1.1.2 菌株、质粒及试剂 大肠杆菌DH5α为本实验室所有。质粒小提试剂盒、DNA聚合酶Exon3酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、DNA切胶回收试剂盒、DNA marker 均购自TaKaRa(Japan)公司，限制性内切酶购自NEB(Beijing)公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 取在MS培养基上生长9 d的拟南芥幼苗，将幼苗转移到液氮中，用预冷的研棒将叶片研磨成粉状。使用Trizol试剂提取RNA后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。RNA质量合格后，使用PrimeScipt© RTReagent Kit(TaKaRa公司产品)将RNA反转录为cDNA，之后将cDNA储存于-80 ℃冰箱中备用。

徐进步被他瞪得一哆嗦,赶紧摆手道:“不是我说的,是他!我从不背后说领导的怪话。”他又企图往赵天亮身上赖,赖人仿佛也有惯性。

1.2.2 MAP65-1和MAP65-2基因的克隆和表达载体的构建 根据拟南芥微管结合蛋白基因MAP65-1和MAP65-2的CDS序列全长及表达载体序列设计引物，引物序列见表1。使用TaKaRa Biotechnology公司的PrimeSTAR HS DNA聚合酶进行MAP65-1和MAP65-2基因片段的扩增。扩增体系(10 μl)：1 μl cDNA，1 μl引物，5 μl Primerstar，3 μl H2O。PCR扩增40个循环，扩增出特异性条带，然后放大到50 μl体系中进行扩增，使用PCR产物切胶回收试剂盒进行产物回收。使用BamH I、Sal I双酶切pCHF3-YFP载体，电泳检验酶切结果。

表1 MAP65-1和MAP65-2基因片段的克隆引物

Table 1 MAP65-1 and MAP65-2 gene primers for cloning of the fragment

  

引物 序列MAP65⁃1⁃FP5′⁃GAGCTCGGTACCCGGATGGCAGTTACAGATACTGAAAGTC⁃3′MAP65⁃1⁃RP5′⁃GCCCTTGCTCACCATTGGTGAAGCTGGAACTTGATG⁃3′MAP65⁃2⁃FP5′⁃GAGCTCGGTACCCGGATGGCAGTGACAGAAGCAGAAA⁃3′MAP65⁃2⁃RP5′⁃GCCCTTGCTCACCATCGGTGAAGCCATCACTGGG⁃3′

下划线部分为与载体同源的30 bp DNA片段。

[7] CHANG-JIE J, SONOBE S. Identification and preliminary characterization of a 65 kDa higher-plant microtubule-associated protein[J]. Journal of Cell Science, 1993, 105(4): 891-901.

2 结 果

2.1 拟南芥RNA的提取结果鉴定

用Trizol试剂提取拟南芥幼苗RNA，提取完成后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。结果(图1)显示3条清晰的条带，说明RNA完好，没有发生降解。

首先，政府不能过多干预城市商业银行的业务战略和开展，更不能为追究“政绩”而强迫城商行优先选择大型企业作为客户，过度扩张。同时，需要充分认识小微企业健康发展对于地方经济具有十分重要的作用。地方政府要保障城市商业银行有一个较为自主的决策环境，能够真正根据市场需求做出业务规划。

2.2 MAP65-1和MAP65-2基因的扩增

以拟南芥RNA为模板，采用反转录试剂盒两步法反转录成cDNA。以cDNA为模板，用目的基因的上下游引物，并采用Primerstar高保真防突变酶，扩增MAP65-1和MAP65-2基因。扩增的MAP65-1和MAP65-2基因大小分别约为1 764 bp和1 737 bp(图2)。

  

M：Marker；1～3：RNA。图1 拟南芥幼苗总 RNA 的琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 The agarose gel electrophoresis diagram of the total RNA of Arabidopsis thaliana seedlings

  

M：DNA Marker；1、2：MAP65-1基因;3、4：MAP65-2基因。图2 MAP65-1和MAP65-2基因RT-PCR电泳图Fig.2 The agarose gel electrophoresis diagram of MAP65-1 and MAP65-2 with RT-PCR

2.3 pCHF3-YFP载体的酶切

使用Bam H I和Sal I双酶切pCHF3-YFP载体，酶切后电泳结果显示载体被切成线性载体(图3)。切胶回收产物，测得回收后产物浓度为25 ng/μl。

  

M：DNA maker；1：pCHF3-YFP载体；2：双酶切后的pCHF3-YFP载体。图3 pCHF3-YFP载体酶切验证电泳图Fig.3 The agarose gel electrophoresis diagram of pCHF3-YFP vector with enzyme digestion verification

2.4 目的基因和载体的重组转化

将MAP65-1和MAP65-2目的基因的PCR产物和酶切后的线性载体用LIC方法连接，再将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞。取培养物涂布于Spec抗性平板上，37 ℃倒置培养16 h后平板上长出单菌落，挑取部分单菌落接种至新的盐酸壮观霉素LB固体培养基上。以单菌落为模板，用目的基因引物进行菌落PCR扩增，PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。将验证正确的单菌落从培养基上接种到Spec液体LB培养基中活化，活化之后提取质粒。提取的质粒用Sac I和Sma I双酶切，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果(图4)显示3条带(约12 000 bp、815 bp、520 bp)，验证正确。

  

M为DNA maker；A、B图中1～9为抗性平板上挑取的单菌落；C图中1和3是pCHF3-YFP质粒，2是Sac I和Sma I酶切后的pCHF3-MAP65-1-YFP质粒，4是Sac I和Sma I酶切后的pCHF3-MAP65-2-YFP质粒。图4 pCHF3-MAP65-1-YFP菌落PCR(A)及pCHF3-MAP65-2-YFP菌落PCR(B)和酶切验证(C)电泳图Fig.4 The agarose gel electrophoresis diagram of the pCHF3-MAP65-1-YFP(A) and the pCHF3-MAP65-2-YFP (B) colony verification with RCR and these enzyme digestion verification(C)

2.5 重组质粒pCHF3-MAP65-1-YFP和pCHF3-MAP65-2-YFP测序结果比对

[10] SMERTENKO A P, CHANG H Y, SONOBE S, et al. Control of the AtMAP65-1 interaction with microtubules through the cell cycle[J]. Journal of Cell Science, 2006, 119(15): 3227-3237.

3 讨 论

[9] MAO T, JIN L, LI H, et al. Two microtubule-associated proteins of the Arabidopsis MAP65 family function differently on microtubules[J]. Plant Physiology, 2005, 138(2): 654-662.

本指南中证据等级和推荐强度依据定量系统评价证据分级(Grade of Recommendations Assessment，Development and Evaluation,GRADE) 系统分级，证据质量分为“高、中、低”级别；推荐强度分为“强推荐和弱推荐”两个等级。“强”一般指基于高级别证据的建议，临床行为与预期结果存在一致性；“弱”一般指低级别证据，临床行为与预期结果间存在不确定性。

在本实验室前期的研究中发现，用一定剂量的UV-B辐射小麦时，小麦根尖体细胞中染色体发生了异常分裂[14]，推测这种现象的产生原因是UV-B辐射破坏了细胞骨架结构，导致纺锤体在多个方向上发生牵拉作用使染色体聚集或排斥。而MAP65-1和MAP65-2是一类微管结合蛋白质，能够使微管成束，稳定微管结构，所以进一步推测UV-B照射后MAP65-1和MAP65-2蛋白质丰度或者亚细胞定位发生改变进而导致微管结构破坏。为了验证这一假设，本研究利用LIC技术成功快速地构建了pCHF3-MAP65-1-YFP和pCHF3-MAP65-2-YFP表达载体，为后续研究试验提供了材料。

“50年代淘米洗菜，60年代摸虾做菜，70年代游泳痛快，80年代水质变坏，90年代风光不再，直到今天依然受害。”这段顺口溜生动描述了滇池水质变迁，道出云南省对高原湖泊治理的艰难探索和不懈努力。

参考文献：

[14] CHANDA P K, EDRIS W A, KENNEDY J D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli[J]. Protein Expression and Purification, 2006, 47(1): 217-224.

[1] STOLS L, GU M, DIECKMAN L, et al. A new vector for high-throughput, ligation-independent cloning encoding a tobacco etch virus protease cleavage site[J]. Protein Expression and Purification, 2002, 25(1): 8-15.

[2] DIECKMAN L, GU M, STOLS L, et al. High throughput methods for gene cloning and expression[J]. Protein Expression and Purification, 2002, 25(1): 1-7.

[3] CHEO D L, TITUS S A, BYRD D R N, et al. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones[J]. Genome Research, 2004, 14(10b): 2111-2120.

[4] ASLANIDIS C, DE JONG P J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR)[J]. Nucleic Acids Research, 1990, 18(20): 6069-6074.

[8] HUSSEY P J, HAWKINS T J, IGARASHI H, et al. The plant cytoskeleton: recent advances in the study of the plant microtubule-associated proteins MAP-65, MAP-190 and the Xenopus MAP215-like protein, MOR1[J]. Plant Molecular Biology, 2002, 50(6): 915-919.

[6] SMERTENKO A P, CHANG H Y, WAGNER V, et al. The Arabidopsis microtubule-associated protein AtMAP65-1: molecular analysis of its microtubule bundling activity[J]. The Plant Cell, 2004, 16(8): 2035-2047.

用LIC方法将MAP65-1和MAP65-2基因克隆到pCHF3-YFP载体中。克隆体系：MAP65-1或MAP65-2基因1.5 μl，pCHF3-YFP载体2.0 μl，10×Exon3 buffer 1.0 μl，H2O 5.5 μl，冰浴5 min后加入1 μl Exon3酶(20 U)，再冰浴1 h后加入1 μl 0.5 mol/L EDTA(pH=8.0)终止反应，然后进行大肠杆菌转化，涂盐酸壮观霉素(Spec)抗性LB培养基平板，第2 d即可见菌落长出。将菌落进行PCR鉴定。将PCR验证成功的pCHF3-MAP65-1-YFP菌落、pCHF3-MAP65-2-YFP菌落分别用SacI和SmaI进行酶切鉴定。将酶切验证正确的重组质粒送到北京华大基因公司进行测序验证。

[5] CHAN J, MAO G, SMERTENKO A, et al. Identification of a MAP65 isoform involved in directional expansion of plant cells[J]. FEBS Letters, 2003, 534(1-3): 161-163.

本试验结果表明，运用LIC技术构建载体，不仅简便、快捷而且连接效率高。常规酶切连接方法操作过程繁琐，需与多个中间载体连接，连接效率很低，而且筛选重组子的工作量很大，而采用LIC方法可以减少连接、转化次数，快速地筛选到所需构建载体。LIC技术目前在很多方面都得到了广泛应用，例如在目的基因克隆、蛋白质融合表达等方面[14-15]。Stols等[1]利用LIC的原理首次成功构建了携带有His标签的表达载体pMCSG7，目前被用于大规模靶基因克隆和表达。Donnelly等[16]将载体pMCSG7的TEV蛋白质酶识别位点上游加上一个MBP标签，这样该载体表达的蛋白质就能被酶切，除去标签从而得到所需的蛋白质。Tan等[17]利用LIC技术成功构建了含有6His-tag、TEV、NBbvCIA识别位点以及Swa I位点的pET30a-LIC载体，此载体可快速地筛选出可溶蛋白质和表达蛋白质。随后Cabrita等[18]和Dan等[19]将包含有MBP、GST等其他亲和融合标签的LIC表达载体列入基因组计划。Eschenfeldt等[20]构建了15个LIC载体，将MBP、GST亲和融合标签用于高通量克隆和改善表达蛋白质的可溶性。LIC技术加快了载体构建的进程，尤其是提高了连接效率[21]。

常规理化因子包括总磷（TP）、总氮（TN）、叶绿素a（Chla）、氨氮（NH3-N）、高锰酸盐指数（CODMn）、溶解氧(DO)、水温（WT）和透明度（SD）参照《水和废水监测分析方法》（第四版）进行检测。

为了进一步验证重组质粒，将酶切验证正确的重组质粒送到北京华大基因公司测序。测序后，在NCBI网站上进行核苷酸序列比对，比对结果显示序列正确，重组质粒构建成功。

[11] LI H, ZENG X, LIU Z Q, et al. Arabidopsis microtubule-associated protein AtMAP65-2 acts as a microtubule stabilizer[J]. Plant Molecular Biology, 2009, 69(3): 313-324.

[12] 栗 华.两种拟南芥微管结合蛋白AtMAP65-1和AtMAP65-2的功能分析[D].北京：中国农业大学, 2007.

[13] 韩 榕,王勋陵,岳 明,等. 增强UV-B 辐射对小麦体细胞分裂的影响[J]. 遗传学报, 2002, 29(6): 537-541.

走进滕王阁公园，就和清新的空气撞了个满怀。里面有婀娜的翠柳、碧绿的池塘、红红的金鱼和灰褐的鸳鸯。再往里走，便看见一个广场，上面画着阴阳太极图，抬头望去，只见一座高大雄伟的阁楼耸立在广场上，那就是滕王阁。

[15] WEEKS S D, DRINKER M, LOLL P J. Ligation independent cloning vectors for expression of SUMO fusions[J]. Protein Expression and Purification, 2007, 53(1): 40-50.

[16] DONNELLY M I, ZHOU M, MILLARD C S, et al. An expression vector tailored for large-scale, high-throughput purification of recombinant proteins[J]. Protein Expression and Purification, 2006, 47(2): 446-454.

在课堂观察中我发现，相当多的同学拿到练习之后，问题都还没看，就匆忙聚焦文本。不带着问题，走远了反倒不知道缘何出发，初心怎记？

[17] TAN R, MA L. Novel ligation-independent cloning vectors for production of native proteins[J]. Journal of Hubei University (Natural Science), 2009, 4: 22.

[18] CABRITA L D, DAI W, BOTTOMLEY S P. A family of E. coli expression vectors for laboratory scale and high throughput soluble protein production[J]. BMC Biotechnology, 2006, 6(1): 12.

[19] DAN H, BALACHANDRAN A, LIN M. A pair of ligation-independent Escherichia coli expression vectors for rapid addition of a polyhistidine affinity tag to the N-or C-termini of recombinant proteins[J]. Journal of Biomolecular Techniques JBT, 2009, 20(5): 241.

[20] ESCHENFELDT W H, LUCY S, MILLARD C S, et al. A family of LIC vectors for high-throughput cloning and purification of proteins[J]. High Throughput Protein Expression and Purification: Methods and Protocols, 2009, 498: 105-115.

[21] 刘 超,林陈水. 不依赖于连接反应克隆 (LIC) 的技术进展[J]. 基因组学与应用生物学, 2011, 30: 1081-1085.

回顾当初，多年前在篁村镇搞篮球比赛的时候，陈林、陈海涛父子未必会想到有一天他们会投身职业篮球，更不会想到若干年后，他们的球队会成为广东体育的一面旗帜。他们彻底地从发烧友变成了圈中人，建立了国内最“职业”的俱乐部，也是国内为数不多的有“百年”雄心的俱乐部。这种多年的专注与坚持，在不断有玩家进出的体育市场上，显得尤为珍贵。

where nʹ is the refractive index of the fiber and ρ is the diameter of the fiber taper. When βms=βft, the phase matching between the tapered fiber and the microsphere is obtained.