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miR-27a与SCF 靶向关系鉴定

更新时间:2009-03-28

miRNAs 通常都是通过与靶基因 mRNAs 按序列配对的方式结合来抑制靶基因的表达,由于碱基种类少,种子序列个数少(约 8 个碱基),所以出现同样序列的概率极高,因此 miRNAs 与 mRNAs 的配对是“一对多,多对一”的方式[1],因此 miRNAs 的生物学功能极其复杂。探究 miR-27a 与 干细胞因子(SCF) 的靶向关系,有助于通过已知的 SCF 的功能,推测和探究 miR-27a 生物学功能,为 miR-27a 功能的研究开辟新方向。研究结果表明,miR-27a 参与多种细胞的增殖分化、凋亡,血管生成,黑色素生成,脂肪形成等生物学过程[2-7]。还与多种癌症(乳腺癌、胃癌和宫颈癌等)的发生、发展和预后密切相关[8-11]。而SCF通过与 c-kit 结合参与造血干细胞、生殖细胞、黑色素细胞和肥大细胞的迁移、存活及增殖等生物学过程[12]。随着越来越多的 miRNAs 被发现,miRNAs 功能的研究及其作用机理的探究越来越受到人们的关注,miRNAs 不编码蛋白质,是通过作用于靶基因来发挥作用的,因此,寻找 miRNAs 的靶基因尤其关键。研究者发现,在浅色哺乳动物皮肤中 miR-27a 表达量显著高于深色皮肤[7, 13],因此,推测 miR-27a 可能作用于促进黑色素生成的基因,而SCF在黑色素生成中通过与 c-kit 结合发挥促进作用,因此,本试验假设 SCF基因是 miR-27a 的靶基因之一。利用生物信息学预测及双荧光素酶报告基因检测系统等,验证miR-27a 与 SCF 之间是否存在靶向关系,为进一步探究和完善miR-27a的生物学功能提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

本试验所用 C57BL/6 小鼠和 HEK 293 T 细胞及 pMSCV 和 pmirGLO 载体均来自山西农业大学羊驼生物工程实验室,分别选 2 月龄的棕色和灰色小鼠各3只,取皮肤组织,用于提取总 RNA,同时收集鼠尾,用于提取基因组 DNA。

本试验所用的 PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time) kit 和 SYBR© PrimeScriptTMⅡ RT-PCR Kit 以及限制性内切酶均购自大连宝生物公司,Site-Directed Gene Mutagenesis Kit 购自上海碧云天生物技术有限公司,DMEM 培养基购自 Gibco 公司,胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司,转染试剂 lipofectamine 2000 reagent 购自 Invitrogen 公司,双荧光测定试剂盒 Promega Dual Luciferase Assay Kit 购自 Promega 公司。

1.2 总RNA提取和qRT-PCR

本试验中总 RNA 提取采用 TRIzol 法,设计并合成 miR-27a 和 SCF 的引物(表1),分别以18 SU6为看家基因。反转录用 PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time) kit,荧光定量 PCR 用 SYBR© PrimeScriptTMⅡ RT-PCR Kit,每次试验进行 4 次重复。

肌肉的绞痛,韧带、关节囊的钝痛,神经根的放射痛,神经的闪电样锐痛,交感神经的灼痛,骨的深部痛,骨折的剧痛,脉管系统的弥散性痛……不管发生在什么地方,骨骼肌肉系统疾病与疼痛关系友好。

1.3 靶基因预测

在 PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de/), TargetScan (http://www.targetscan.org/) and DIANA-microT (http://www.microrna.gr/microT) 3个数据库中对 miR-27a 的靶基因进行预测。

1.4 载体构建

从 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索小鼠pri-miR-27a 序列(NR_029746.1),在此基础上,从 UCSC(http://genome.ucsc.edu/)中搜索其上下游各延伸 100 bp 的序列,以此为参考,设计引物(表1),并在上下游引物的5′端分别加上 XhoⅠ和 EcoRⅠ酶切位点序列和保护碱基,以小鼠基因组 DNA(酚氯仿法提取)为模板进行 PCR 扩增,将产物克隆到 pUC-T 载体上,分别用 XhoⅠ和 EcoRⅠ限制性内切酶对 pUC-T 载体和 pMSCV PIG 载体进行双酶切,纯化产物,T4 连接酶 16 ℃过夜连接,构建重组载体 pMSCV-pri-miR-27a,经转化、LB 固体培养基培养、液体培养基摇菌,质粒提取(去内毒素),获得大量重组质粒,测序鉴定重组效果,-80 ℃保存备用。

从 NCBI 中搜索小鼠 SCF 3′UTR 序列(NM_013598.2),设计引物(表1)扩增包含 miR-27a 结合位点的片段,以小鼠 cDNA(TRIzol 法提取)为模板,上下游引物的5′端分别加上 SacⅠ和 XbaⅠ酶切位点序列和保护碱基,将pUC-T 载体和 pmirGLO 载体进行双酶切、重组、测序,最后获得 pmirGLO-SCF-wt-3′UTR,-80 ℃保存备用。

1.5 构建突变载体

以 pmirGLO-SCF-wt-3′UTR 为模板,设计结合位点4个连续碱基突变的引物(表1),用Site-Directed Gene Mutagenesis Kit 进行突变,将突变过的载体转化、培养,提取质粒,测序,最终保留突变成功的载体,即为 pmirGLO-SCF-mut-3′UTR。

1.6 细胞培养及转染

HEK 293 T 细胞为实验室保存,培养在添加 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中。转染分3组进行:pMSCV-pri-miR-27a + pmirGLO-SCF-wt-3′UTR,pMSCV-pri-miR-27a + pmirGLO-SCF-mut-3′UTR,pMSCV NC(空载体)+ pmirGLO-SCF-wt-3′UTR。转染比例:24孔细胞培养板每孔150 μg pmirGLO-SCF-wt-3′UTR 或 pmirGLO-SCF-mut-3′UTR + 250 μg pMSCV-pri-miR-27a 或 pMSCV NC(空载体)。转染 48 h后,收集细胞,用 Promega Dual Luciferase Assay Kit 处理,用 GLOMAXTM 96 Microplate Luminometer 测定荧光活性。

表1 所有引物序列及用途

Table 1 Primers used in this study

  

引物名称 引物序列(5′→3′) 用途SCFFGTCATTGTTGGCTACGAGARealtimePCRSCFRCACGAGGTCATCCACTATTTTRealtimePCRSCF3′UTRFCGAGCTCTGTTACCTTCGCACAGTGGCLuciferasereporter⁃wtSCF3′UTRRGCTCTAGAGCTCCACCGCATGGATAGAALuciferasereporter⁃wtSCF⁃3′UTR⁃mutFGGAGCAGAGTGCTTCGCACACAACCCTGCACTGAATTALuciferasereporter⁃mutSCF⁃3′UTR⁃mutRTAATTCAGTGCAGGGTTGTGTGCGAAGCACTCTGCTCCLuciferasereporter⁃mutmiR⁃27aFACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGRealtimePCRUniversalPrimerTGGTGTCGTGGAGTCGRealtimePCRU6FCTCGCTTCGGCAGCACARealtimePCRU6RAACGCTTCACGAATTTGCGTRealtimePCRmiR⁃27aRCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACTRealtimePCRMir⁃27aF⁃XhoⅠAAGCTCGAGCTGTCGCCAAGGATGTCTGTPCR⁃CloneMir⁃27aR⁃EcoRⅠGGAATTCAGGAGGCAGAGCAGGGTGPCR⁃Clone18S⁃FCTAAGGAGAAGGGCCAGTCCRealtimePCR18S⁃RCTCAAGTTGGGGGACAAAAARealtimePCR

1.7 数据分析

[5] LIN Q, GAO Z, ALARCON R M, et al. A role of miR-27 in the regulation of adipogenesis [J]. FEBS J, 2009, 276(8): 2348-2358.

2 结 果

2.1 miR-27a 和 SCF 的表达量

根据荧光定量 PCR 的结果,miR-27a 在灰色小鼠皮肤中的表达量极显著高于棕色小鼠(P<0.01);而 SCF 在棕色小鼠皮肤中的表达量显著高于灰色小鼠(P<0.05)(图1),这种相反的表达趋势说明 miR-27a 与 SCF 可能存在靶向关系,并且 miR-27a 可能抑制黑色素生成。

  

**表示差异极显著(P<0.01);*表示差异显著(P<0.05)。图1 miR-27a 和 SCF 分别在棕色和灰色小鼠皮肤中的表达量Fig.1 Expression of miR-27a and SCF mRNA in brown and gray mouse skin

2.2 载体重组及突变

经测序发现,小鼠 pri-miR-27a 和 SCF 3′UTR 分别成功重组到 pMSCV PIG和pmirGLO载体上,插入片段分别为186 bp和658 bp,并且测序结果与 NCBI 上的参考序列完全一致,无突变、变异等,可用于后续研究。同时,载体成功突变,与野生型相比,存在 4 个连续碱基的突变,即位于SCF cDNA 1 202~1 205 bp 的 TGTG 突变为 ACAC,与引物设计时的突变碱基的位置和种类一致,可用于后续研究。

2.3 靶基因预测

通过3个数据库的分析发现,SCF 是 miR-27a 的靶基因,并且结合位点位于SCF cDNA的1 200 ~1 207 bp,并且物种间序列保守(图2)。

  

图2 SCF 3′UTR上miR-27a的结合位点、突变位点及物种间的保守性Fig.2 The binding site and mutation site of miR-27a on the SCF 3′UTR and the conservatism across different species

2.4 细胞培养及转染

通过观察发现,HEK 293 T细胞生长良好,转染 48 h 后,在荧光显微镜下观察细胞,结果(图3)显示,绿色荧光蛋白表达良好,视野内荧光密度及广度都很好,说明转染效果良好,可用于测定双荧光活性。

  

A为共转染 miR-27a 过表达载体和SCF 3′UTR 双荧光报告载体的 HEK 293 T 细胞(×100)白光照片; B为共转染 miR-27a 过表达载体和SCF 3′UTR 双荧光报告载体的 HEK 293 T 细胞(×100)荧光照片。图3 转染效率Fig.3 Transfection efficiency

2.5 双荧光活性

2种质粒共转染 HEK 293 T细胞 48 h 后,收集细胞,测定细胞中的萤火虫荧光和海肾荧光的活性值,其比值即为荧光活性,结果显示,共转 pMSCV-pri-miR-27a和 pmirGLO-SCF-wt-3′UTR 的细胞中,荧光活性值为 7.38±0.43,而其他两组分别为 13.18±2.06和 12.97±1.65,荧光活性下降约 44%,下降效果显著(P<0.05)(图4)。

  

a:pMSCV+SCF-3′UTR wt;b:pMSCV-miR-27a+SCF-3′UTR wt;c:pMSCV-miR-27a+SCF-3′UTR mut。*表示差异显著(P<0.05)。图4 3组转染中的相对荧光值Fig.4 Relative luciferase value in three groups

3 讨 论

miRNAs 是短片段 RNA,通常只有18~25 nt,不能编码蛋白质,通过与靶基因 mRNAs 3′UTR或 5′UTR 的不完全匹配抑制 mRNAs 翻译成蛋白质或通过降解 mRNAs 发挥抑制作用 [1, 14-18]。随着研究的深入,人们还发现一些 miRNAs 也可以与靶基因的 CDS 区结合来发挥作用[19]。本研究中,miR-27a 就是与靶基因 SCF 的3′UTR 结合的,miRNAs 对靶基因有抑制作用,因此其在组织细胞中的表达趋势可能是相反的,而本研究中 miR-27a 与 SCF mRNA 在不同颜色小鼠的皮肤中的表达趋势正是呈现这种相反的现象,这就为我们的假设提供基础。

miRNAs 与其靶基因的靶向关系的确定主要通过2种方法,一种是生物信息学预测,另一种是试验验证,二者结合,效果最佳。生物信息学预测通常是基于种子序列的互补配对、保守性、自由能及结合位点的开放性等[20]。试验验证也主要为双荧光报告试验和过表达/敲除试验,前者从序列配对层面进行验证,后者从生物学功能层面进行验证。

本研究利用3个 miRNAs 数据库进行生物信息学预测,因3个数据库的算法略有差异[20],保证了预测的准确性,结果显示,SCF 是 miR-27a 的靶基因,并且结合位点(种子序列)位于 SCF mRNA 3′UTR,这符合 miRNAs 作用于靶基因的原理,同时为我们的假设提供了理论依据。

④在同一条河上,上游水库先蓄水,下游水库后蓄水;在干支流之间,支流水库先蓄,干流水库后蓄。对于长江干流,应该是金沙江等上游的水库先蓄,而三峡水库后蓄。同样,支流上的水库影响是局部的,干流的影响是全局的,支流水库应该考虑先蓄。

[13] TIAN X, JIANG J, FAN R, et al. Identification and characterization of microRNAs in white and brown alpaca skin [J]. BMC Genomics, 2012, 13: 555-567.

最后,通过构建 miR-27a 的过表达载体及靶基因 SCF 3′UTR 的双荧光报告载体,并将其共同转染 HEK 293 T 细胞,测定荧光活性,从而确定miR-27a 与 SCF 之间的靶向关系。这一试验是从序列匹配方面对 miRNAs 与靶基因的匹配关系进行验证,其原理是:当过表达载体表达的 miRNAs 与双荧光报告载体上的靶基因 3′UTR 序列配对并结合时,就阻断双荧光报告载体上萤火虫荧光蛋白的表达,从而使荧光活性降低。

研究结果表明, miR-27a 参与细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤发生等多种生物学过程。miR-27 促进胎儿成骨细胞增殖,内皮细胞增殖,血管生成,抑制脂肪细胞的分化和脂肪形成,也促进小鼠黑色素生成[2-7]。此外,miR-27a 还与多种癌症的发生、发展和预后密切相关,如乳腺癌、胃癌和宫颈癌等[8-11]。研究结果表明 miR-27a-3p 与 Wnt3a 在不同毛色的小鼠皮肤中也表现出完全相反的表达趋势[7]。除此之外,本课题组之前在羊驼上的研究结果也表明,miR-27a-3p 在白色羊驼皮肤中的表达量是棕色羊驼皮肤中的5.99倍[13],因此,推测 miR-27a 在黑色素生成过程中可能发挥抑制作用。

位于宜兴的木构农房绿色改良技术集成与示范项目,隶属于郑州大学主持的“十二五”国家科技支撑计划课题“传统农房建造技术改良与应用”(2015BAL03B03)。项目运用现代木结构技术,改善传统木构民居在结构安全、房屋节能、居住舒适度、建造方式等问题。笔者在郑州大学研究生在读期间有幸参与了项目设计建造的全过程。

[2] WANG T,XU Z. miR-27 promotes osteoblast differentiation by modulating Wnt signaling [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 402: 186-189.

通过与 c-kit 结合,SCF可以间接影响黑色素细胞的迁移、增殖及存活等生物学过程[12]。当哺乳动物的皮肤黑色素细胞和成黑素细胞中有 c-kit 存在时,SCF介导黑色素细胞迁移、分化、生存、凋亡及黑色素生成等[21]。SCF有两种亚型,即膜结合型和可溶型,在缺乏膜结合型 SCF 的小鼠中,成黑色素细胞可以被检测到,但其不能迁移到皮肤组织,导致其毛色呈白色[22-23]。此外,表皮中 SCF 水平降低或者其对 c-kit 的竞争增强均会导致毛干不着色;相反,过表达膜结合型 SCF 会导致毛囊和表皮色素沉着过多[21]

参考文献:

[1] BARTEL D P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function [J]. Cell, 2004, 116:281-297.

哦,我听了我老婆的话,把它收起来了,免得让人误会。周书记笑哈哈地说,然后他示意我在他大班台对面的椅子上坐下,收起了笑容问,怎么?对县委、政府的任命有意见?

因此,我们推测,miR-27a 可能通过靶向 SCF 影响哺乳动物皮肤中的黑色素细胞及黑色素生成。

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荧光定量 PCR 数据采用 2-△△Ct计算法,荧光活性值 = 萤火虫荧光值 / 海肾荧光值,最终数据分析均用 SPSS 软件进行,数据用平均值±标准差表示。

RANSAC算法的缺点在于它的迭代次数没有上限,从而导致计算量大。但如果设置的迭代次数过少,可能得不到最优的模型,甚至可能得到错误的模型。RANSAC算法的另一个缺点是它需要设定相关参数的阈值,不同的阈值设置可能会得到截然不同的结果。一个RANSAC程序只能计算出一个模型。

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图8给出传统电网和超导磁场储能型微网的电机震荡状态。即给出超导磁场储能技术投入之后的永磁发电装置转速波动之后的状态,传统电网控制下的发电装置转速往往有周期性振荡现象并存在相应的振荡发散性质[11];超导磁场储能型微网的发电装置转速也存在振荡性质,但其振荡幅度迅速衰减并归于零,而整个振荡进程往往仅维持越1 s左右。

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第二层叫作WEB服务器,扮演着信息传送的角色。当用户想要访问数据库时,就会首先向WEB服务器发送请求,WEB服务器统一请求后会向数据库服务器发送访问数据库的请求,这个请求是以SQL语句实现的。

采集节点的数据经GPRS网络传送到上位机后,经MatlAB7.0处理后,得到的土壤水分含量盐分补偿前后效如图6所示。未补偿时, 由于土壤盐分Ts的影响,EC-5高估实际水含量θ′,且偏差Es随Ss的增大而增大;θ′越大时,相同的Ss引起的误差较大,最大误差为0.098 4cm3·cm-3。经过补偿后,精度可达0.15%,θ′越大补偿精度越高(MSEmin=0.091 1),因此选择合适的LS-SVM训练参数,可以得到较高的训练精度。

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随着我国改革开放以后国民生活水平的不断提高,劳动人民的工作环境以及工作方式都得到了不同以往的巨大良性变化。加之国民人均寿命的不断延长,我国劳动人民想工作、能工作的欲望和能力都在增长,因此,在延迟退休的基础上,要进行与之相关的养老金和养老保险的配套改革。在人口老龄化加剧的今天,社会保险基金面临的压力不言而喻,延迟退休是国际趋势,想要完成政策目标,同步推进养老金与养老保险的改革势在必行。要从费率与费基以及劳动人民的工作年限、劳动人民的缴费年限以及目前所希望的延迟退休年龄进行综合考虑,完成配套性的改革。

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关于MM患者中Th17细胞比率的研究结论并不一致。研究[15]报道,MM患者骨髓中Th17细胞增多;也有研究[16]发现,MM患者中Th17细胞较正常对照无明显改变,本研究结果与之相似。

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赵园园,孟金柱
《江苏农业学报》 2018年第02期
《江苏农业学报》2018年第02期文献

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