桃果实属于呼吸跃变型果实，采后果实呼吸跃变致使成熟衰老进程加快，出现果实软化、腐烂、风味劣变等现象。采摘后的桃果实可以通过低温冷藏抑制其代谢活动[1]，使其呼吸得到抑制，达到果实保鲜的目的，但是桃果实对冷害较为敏感，易出现不能正常后熟、絮败、果实褐变、风味丧失等冷害问题[2]，诱发果实产生生理紊乱[3-4]。研究结果表明，桃果实存在中间冷害温度特性，0 ℃贮藏时能减轻冷害症状，使储藏时间变长[5]。因此，在储藏过程中保持桃果实正常风味是采后桃果实储存的重点。

随着工业4.0的不断推进，连续接触作业系统的智能化水平应不断提高，这也要求力控末端执行器向智能化方向发展。一方面，通过智能化技术提高其动静态性、适应性和易用性；另一方面，利用故障智能诊断和预报警技术，实时监测系统运行状态，必要时进行预警和及时维护，保障生产作业的顺利进行，并有效降低设备的维修成本。

由表2可知，摩拉水牛乳脂肪球的表面积、长度与宽度要明显大于荷斯坦牛乳，但球度要低于荷斯坦牛乳，这种脂肪球流变特性的不同可能是水牛乳发酵制品更为黏稠和具有更高触变性的原因。

大多数植物组织中都含有磷脂酶D(PLD)，幼苗和种子中含量尤为丰富。它是一种多功能酶，能催化磷酸二酯键水解和碱基交换。它还是一种重要的跨膜信号转导酶[6]。早在1947年，Chaikof和Hanahan在胡萝卜和白菜的提取物中首次分离出具有活性的PLD，之后在棉花籽、蓖麻籽、花生中也分离出PLD[7-8]。此后又有40多种植物的PLD被确认[9]。到目前为止已经发现PLD存在于病毒、原核生物、真核生物中[10]。在生长条件下，植物会受到各种环境胁迫，在已经报道的PLD中，磷脂酶Dα(PLDα)可能在植物应对各种胁迫中起关键作用[11]，其在抗冷害胁迫中发挥着尤为重要的作用[12-13]。其水解产物磷脂酸可以作为第二信使，参与信号的传导。在各种环境胁迫如冷害、干旱、高盐、营养不良、病虫害等逆境条件下，PLD能产生激活细胞内与抗性有关的细胞生理反应，从而对环境胁迫做出应答[14-15]。除此之外，在生长、发育等过程中，PLD都能被激活[16-18]。

目前，关于PLDα的许多机理尚不完全清楚，在体外重组PLDα蛋白对于了解桃果实环境适应性与后熟机理发挥着非常重要的作用，本试验借助分子生物学手段，体外表达了PLDα蛋白，并对其进行了生物学分析，探究冷信号对PLDα基因表达的影响，以期为下一步深入研究桃果实的环境适应性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

桃果实(Prunus persica L.Batsch, cv. Feicheng)采摘于山东省泰安市肥城桃园镇肥城桃基地。从长势良好的植株上随机采摘尺寸接近且无机械损伤的七成熟桃果实，并立刻运回实验室，4 ℃下预冷24 h后，分别置于常温(25 ℃)和低温(0 ℃)贮藏，常温储藏的样品隔天取样，低温储藏的样品按周取样(每周1次)，样品切块并立即用液氮处理，之后置于-80 ℃环境保存。

感受态大肠杆菌E.coli DH5α、表达载体pET-30a均来源于本实验室。克隆载体pMD18-T Vector购买于TaKaRa公司。表达菌种Transetta(DE3)购买于北京全式金公司。

试验所用引物均由华大基因科技公司合成(表1)。

看不见尽头的路，脚步走得更慢，偶尔的小石头几乎让我摔倒，就在黑暗里这样跌跌撞撞地走。走到一半的时候，忽然我的面前出现两个男人，我从气息都能感觉到不是什么善类，我想我是要倒霉了。他们开始抢夺我的包、我的手机，我开始大喊救命。在抢夺中我摸到他们衣服的质地还有衣服上沾上的已经干掉的水泥，闻到汗臭味以及劣质香烟的味道。是附近正在建大楼的民工，我白天经过的时候注意过。据说他们老板已经欠了工人好几个月工资了，那一刻，我突然心软。

表1 试验所用PCR引物及序列

Table 1 PCR primers and sequences used in the experiment

  

引物名称 序列(5′→3′)引物用途PLDα⁃FGGGGTACCATGGCGGAGCCCCAG⁃GAGCAAT蛋白表达引物PLDα⁃RCAAGCTTAGTAGTAAGGATCGGAG⁃GAAGGTAGPLDα⁃SGGGACTCAAGGAGGCCAAAGRT⁃PCRPLDα⁃ASCAGGATTACGAGGGCATAAGACATUB⁃SGCACCAACTTGTTGAGAATGCqPCRTUB⁃ASTTTCAACTGACCAGGGAACC

GGTACC为Kpn I酶切位点；AAGCTT为Hind III酶切位点。

1.2 试验方法

1.2.1 PLDα生物信息学分析 在NCBI (National center for biotechnology information)的GenBank中检索，得到桃果实PLDα基因碱基序列及其编码的蛋白质氨基酸序列，用在线网站工具对PLDα蛋白进行二维结构(https://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)和三维结构(http://www.swissmodel.expasy.org/)模拟，使用MEGA 4.1软件对桃果实PLDα蛋白与其他植物PLDα蛋白氨基酸序列进行进化关系分析，并构建系统进化树。利用ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白质的理化性质以及亲水性。

1.2.2 肥城桃果实总RNA的提取及第一链cDNA的合成 用改良CTAB法[19]提取桃果实总RNA，超微量紫外可见分光光度计检验其纯度及完整性。使用宝生物公司反转录试剂盒合成第一链cDNA。

从PLDα蛋白氨基酸序列(图1)发现，该蛋白存在2个HKD基序，分别为HQKIVVVD和HTKMMIVD，两基序间隔320个氨基酸，这与标志序列相符合。借助ProtParam tool预测PLDα蛋白分子式为C4 135H6 363N1 139O1 202S26，原子总数12 865，分子量92 097.48，理论等电点5.90，理论半衰期30 h。不稳定系数为41.22，表明该蛋白不稳定。亲水性平均系数(Grand average of hydropathicity)为-0.417，预测该蛋白为疏水性蛋白。对PLDα蛋白进行二级结构预测，从图2中发现，肥城桃果实PLDα蛋白由12段α螺旋、26段β折叠和无规则卷曲交替构成。图3显示了PLDα蛋白不同角度的三维立体结构，可以发现其蛋白中心有一“洞穴”结构，这和蛋白的疏水性是相一致的。

1.2.4 PLDα基因表达量检测 桃果实PLDα基因表达量的分析采用试剂盒(TaKaRa SYBR© Premix Ex Taq)说明书的方法，设计PLDα基因的荧光定量PCR引物以及内参引物PLDα-S、PLDα-AS、TUB-S、TUB-AS(表1)，以cDNA 为模板，用BioRad CFX connect 实时荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR检测。每个样品平行测定3次，以试验基因拷贝数与内参基因拷贝数之比作为衡量试验基因表达量的标准。

2 结果与分析

2.1 PLDα生物信息学分析

1.2.3 PLDα蛋白的体外表达 根据PLDα氨基酸序列全长，使用Primer Premier 5.0软件设计带有酶切位点(Kpn I和Hind III)的引物PLDα-F、PLDα-R(表1)。以cDNA为模板经过PCR获得PLDα基因的全长，PCR产物回收目的基因后与pMD18-T Vertor构建克隆载体。克隆载体与pET30a分别用Kpn I和Hind III双酶切并回收后，用T4 DNA Ligase(TaKaRa)连接回收片段，构建重组质粒pET30a-PLDα，将重组质粒导入表达菌株Transetta(DE3)中，双酶切验证和菌液PCR验证后诱导蛋白质体外表达，取100 μl上述菌液加入到50 ml液体培养基(含50 μg/L Kana)中，37 ℃恒温振荡培养至OD600为 0.4～0.6，取1 ml菌液用于聚丙烯酰胺电泳检测，向剩余菌液中加入50 μl 1 mol/L IPTG(终浓度为0.1 mmol/L)，37 ℃条件下摇菌分别诱导2 h、4 h、6 h，取1 ml该菌液用于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

8.总结提升。总结提升是教研活动的关键环节。通过这个环节，可以使教师进一步明确课堂教学该如何落实实施。例如，在关于阅读教学的教研活动中，经总结后得出了提升小学语文阅读教学效率的四条基本步骤：一是激发兴趣，预习汇报；二是诵读课文，把握内容；三是聚焦主题，深入研讨；四是阶段小结，语用迁移。

  

图1 肥城桃果实PLDα氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequence of PLDα in Feicheng peach fruits

2.2 PLDα蛋白系统进化树分析

系统进化树(图4)显示，同属蔷薇科的桃和草莓(Fragaria x ananassa)在进化关系上位于同一簇分支，聚为一类，说明二者亲缘关系最近，且该基因在亲缘关系较近的物种间具有非常高的一致性。

2.3 PLDα蛋白体外表达

[10] SELVY P E, LAVIERI R R, LINDSLEY C W, et al. Phospholipase D: enzymology, functionality, and chemical modulation [J]. Chemical Reviews, 2011,111(10): 6064-6119.

重组质粒pET30a-PLDα体外表达电泳结果如图6A所示，分子量约为101 000。从图6B来看诱导时间为4 h、6 h时，重组蛋白表达量均较高。

2.4 不同储藏条件下PLDα基因表达量的变化

  

图2 PLDα蛋白二级结构预测Fig.2 Secondary structure prediction of PLDα protein

有研究结果表明，PLD几乎在植物所有的生命阶段及对环境胁迫的应答中起着重要的作用[22]。不同PLD的功能可以是独特的也可以是重叠的，这取决于具体的环境胁迫，根据不同的环境胁迫，不同的PLD会表现出各自的功能。PLDα与植物应对低温胁迫密切相关[23]，同时也能促进气孔闭合并减少水分流失。本试验实时荧光定量PCR结果表明，低温能提高PLDα基因mRNA基因表达水平，Mao等[24]对冷胁迫下黄瓜果实PLD基因研究结果表明PLD在黄瓜响应冷胁迫过程中起重要作用，由此推测PLDα可能以信号分子的身份参与果实对冷胁迫的感应与识别。PLDα基因表达水平与桃果实呼吸跃变的特性两者变化是一致的，由此推测桃果实PLDα基因表达特征与桃呼吸跃变的特性可能有关。关于PLDα响应低温胁迫的机理研究尚在进行中，本试验研究结果为深入研究桃果实的耐冷性和低温贮藏奠定了理论基础。

  

图3 PLDα蛋白三级结构预测Fig.3 Tertiary structure prediction of PLDα protein

  

分支上的数值表示1 000次重复计算得到的Bootstrap值。图4 肥城桃果实PLDα与其他物种PLDα系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of PLDα in Feicheng peach and PLDα proteins in other plants

  

图5 桃果实总RNA 1%琼脂糖凝胶电泳Fig.5 1% agarose gel electrophoresis of total RNA in peach fruits

  

A： PLDα重组蛋白表达;B：PLDα重组蛋白诱导时间优化。M：低分子蛋白质分子量标准；1：含pET30a质粒，经IPTG诱导的蛋白质粗提物；2：含pET30a质粒，未诱导的蛋白质粗提物；3：含pET30a-PLDα质粒，经IPTG诱导的蛋白质粗提物；4：含pET30a-PLDα质粒，未经IPTG诱导的蛋白质粗提物；1′：pET30a-PLDα质粒经IPTG诱导2 h的蛋白质粗提物；2′、4′、6′：pET30a-PLDα质粒未经IPTG诱导的蛋白质粗提物；3′：pET30a-PLDα质粒经IPTG诱导4 h蛋白质粗提物；5′：pET30a-PLDα质粒经IPTG诱导6 h蛋白质粗提物。图6 PLDα 重组蛋白 12% SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳Fig.6 Analysis of recombinant PLDα protein by 12% SDS-PAGE

  

图7 常温(a)和低温(b)贮藏条件下桃果实PLDα基因表达水平Fig.7 PLDα expression level under normal(a) and low(b) temperature storage condition

3 讨 论

本试验通过GenBank检索得到PLDα的全长序列，在此基础上体外重组了pET30a-PLDα克隆载体，并在Transetta(DE3)中成功表达获得PLDα重组蛋白。对PLDα蛋白二级结构模拟可以看出该蛋白由α螺旋、β折叠和无规则卷曲构成，其中β折叠结构所占比例较大。三维结构模拟的“洞穴”结构可以很好地解释该蛋白的疏水性。而蛋白质系统进化树则表明桃果实PLDα蛋白与草莓PLDα蛋白二者亲缘关系最近，且该基因在亲缘关系较近的物种间具有非常高的一致性。从桃果实基因表达量的变化可以看出，低温储藏使PLDα基因的表达水平明显提高。

PLDα的标志序列为HKD基序，PLDα氨基酸序列中含有2个H×K××××D基序，其中H为His(组氨酸)、K为Lys(赖氨酸)、D为Asp(天冬氨酸)，HKD1和HKD2之间相距约320个氨基酸，同时HKD基序也是催化水解的活性部位[20]。而其催化水解产物磷脂酸(PA)能够参与植物对环境胁迫的应答。对PLDα氨基酸序列分析结果表明，本试验体外表达的蛋白质氨基酸序列同样存在2个HKD基序(HQKIVVVD和HTKMMIVD)，两基序中间包含320个氨基酸，这与标志序列相符合。由此可以证明，PLDα在植物应对环境胁迫中起着重要的作用。康虹丽等[21]对蒙古冰草的研究结果表明，PLDα分布在细胞质、细胞核的可能性分别为56.5%和21.7%，而分布在液泡中的可能性仅为4.3%，PLD酶类含有具有催化活性的N端和负责感受信号刺激的C端。

在线共享式课程丰富了教育形式，为学习者提供了多元的教育资源；提高了教育供给的质量和效率，更贴近学习者的学习习惯和需求。但目前在线共享课程还未发展成熟，很多问题还彻底未解决。如何对学习者进行真正有效的线上学习行为监管，如何确保远程教学真正达到传统课堂面对面教学中的生动效果，如何构建一个更为全面、合理、多元的评价机制，激发学习者学习的主动性，这一系列的问题还有待在今后的教学实践中进一步深化研究。

由图7可知，在常温储藏条件下，PLDα基因表达量在第6 d出现一个小高峰，之后大幅降低，在第8 d降到最低值，此时基因表达量为0 d的9.8%，在整个常温储藏过程中PLDα基因表达量是低于0 d的。在冷藏条件下，PLDα基因表达量大幅降低，1周时降到最低值，此时基因表达量为0 d的56%，之后逐渐升高，在3周达到峰值，此时基因表达量为0 d的1.4倍。在整个储藏过程中，低温条件下PLDα基因的表达水平明显高于常温储藏，可见，PLDα基因的表达受低温的调控，可能参与桃果实对低温胁迫的响应。低温储藏过程中，PLDα基因表达量出现跃升过程(第3周)，常温储藏过程中，PLDα基因表达量同样出现跃升过程(第6 d)，这与桃果实呼吸跃变规律相一致，可见，PLDα基因的表达可能与果实采后呼吸跃变有关。

③空气弹簧压力较小时的压缩过程：活塞被向下压，阻尼力由底阀和油液流过该阀的阻力所决定。活塞杆压出的油液一部分经底阀流入储油腔。另一部分油液经工作腔1内的孔流向PDC阀。由于控制压力(空气弹簧压力)及油液流过PDC阀的阻力变小，因而减振器阻尼力就减小。如图15所示。

[12] WELTI R, LI W, LI M, et al. Profiling membrane lipids in plant stress responses role of phospholipase Dα in freezing-induced lipid changes in Arabidopsis [J]. Journal of Biological Chemistry, 2002,277(35): 31994-32002.

是的，接下来，她要达到目的的方式依旧是“磨”。她相信她能水滴石穿、铁杵磨成针：看妈妈和我谁更有耐心！我不跟孩子比赛，跟孩子比赛，不管比什么，都没有赢家。还有一点我也明白：当孩子挑战以前有效的规则时，就是孩子想要更多权利和自由的时候。我需要结束“磨嘴皮”比赛；她需要有事情做，还想要在“看电视”这件事上有更多的权利——没问题！“选择轮”是个好的解决办法。

[1] SUN Y, GU X, SUN K, et al. Hyperspectral reflectance imaging combined with chemometrics and successive projections algorithm for chilling injury classification in peaches [J]. LWT-Food Science and Technology, 2017,75: 557-564.

[2] JIN P, WANG K, SHANG H, et al. Low-temperature conditioning combined with methyl jasmonate treatment reduces chilling injury of peach fruit [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2009,89(10): 1690-1696.

[3] WANG K, YIN X R, ZHANG B, et al. Transcriptomic and metabolic analyses provide new insights into chilling injury in peach fruit [J]. Plant, Cell & Environment, 2017,40(8): 1531-1551.

[4] LURIE S, CRISOSTO C H. Chilling injury in peach and nectarine [J]. Postharvest Biology and Technology, 2005,37(3): 195-208.

[5] PAN L, ZHANG Q, ZHANG W, et al. Detection of cold injury in peaches by hyperspectral reflectance imaging and artificial neural network [J]. Food Chemistry, 2016,192: 134-141.

[6] JANG J H, LEE C S, HWANG D, et al. Understanding of the roles of phospholipase D and phosphatidic acid through their binding partners [J]. Progress in Lipid Research, 2012,51(2): 71-81.

[7] HANAHAN D J, CHAIKOFF I L. A new phospholipide-splitting enzyme specific for the ester linkage between the nitrogenous base and the phosphoric acid grouping [J]. Journal of Biological Chemistry, 1947,169(3): 699-705.

纸面石膏板是一种新型的建筑装饰轻质板材料，具有质轻、隔声、隔热、抗震、收缩率低、强度高、自动微调室内湿度、加工性能强及施工方法简便的特点。[1]目前，主要以天然石膏和脱硫石膏为原料进行制作。近年来，由于生态环保的意识加强，一些地区天然石膏受到限产，加之脱硫石膏价格上升，导致建筑石膏的原料紧缺，然而随着磷石膏净化除杂技术的提高，给磷石膏制备建筑石膏创造了条件。贵州省瓮福磷矿与山东的泰山集团合作生产纸面石膏板，每年稳定消耗约30万吨磷石膏，每年生产约4000万平方米纸面石膏板。

[8] HANAHAN D J, CHAIKOFF I L. On the nature of the phosphorus-containing lipids of cabbage leaves and their relation to a phospholipide-splitting enzyme contained in these leaves [J]. Journal of Biological Chemistry, 1948,172(1): 191-198.

图7列出了随钢箱梁长度变化截面2和截面3所受正弯矩变化情况。从图7可以看出，随着钢箱梁长度的增长，截面2所受弯矩逐渐减小，平均减小幅度约为10.9%；截面3所受弯矩在钢箱梁长度由56 m增长至96 m时保持在±3%左右的波动，超过96 m以后则以约5%的幅度稳定增长。因此在尽量减小截面2和截面3所受弯矩的同时缩短钢箱梁长度情况下得出钢箱梁长度约为96 m比较合适。

J, IWASAKI Y. Phospholipase D as a catalyst: application in phospholipid synthesis, molecular structure and protein engineering [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2013,116(3): 271-280.

提取的总RNA，电泳结果如图5所示。可以看出28 S与18 S条带明亮，且28 S 与18 S 光密度之比为2.05，接近2∶1。使用微量紫外分光光度计对总RNA溶液进行浓度分析，OD280/OD260为2.01，OD260/OD230为2.00，表明所得RNA纯度较高，蛋白质及有机物含量较低，可以利用提取的RNA反转录合成第一链cDNA。

渠道融合式阅读推广的“融合”更强调integration和cohesion，即侧重于多种阅读推广渠道的有机整合应用，使其产生一种聚合力。

[11] BARGMANN B O R, LAXALT A M, RIET B, et al. Multiple PLDs required for high salinity and water deficit tolerance in plants [J]. Plant and Cell Physiology, 2009,50(1): 78-89.

参考文献:

[13] YANG N, DING F X, WU G F, et al. Phospholipase Dα from Chorispora bungeana: cloning and partial functional characterization [J]. Plant Growth Regulation, 2015,75(2): 511-520.

北京皇城根医院，你晕倒在为民旅店的走廊上，幸亏你身上有电话本，医院才找到我。你昏迷了三天。我是今天早上到的。吓死我了，叔叔，你一个人跑来干吗？多吓人？

[14] HONG Y, ZHANG W, WANG X. Phospholipase D and phosphatidic acid signalling in plant response to drought and salinity [J]. Plant, Cell & Environment, 2010,33(4): 627-635.

Penfolds奔富目前在中国市场上，听说过的和看到过的，包括葛兰许和Bin 707在内的奢华和旗舰系列，今年7月在澳洲首发的特瓶系列，还有这些年总是见诸报端的Ampoule等限量版，以及更加亲民的寇兰山、麦克斯和Bin系列等在内，起码有11个系列至少59款以上的产品（详见下图）。这其中，还不包括2014年3月富邑集团对外发布的，自2013年份起，市场上最热销的洛神山庄（Rawson's Retreat）系列从此摘除Penfolds品牌logo，成为旗下的一个独立品牌，其基础系列、珍藏及气泡系列，和黑金17款酒形成3个系列矩阵，开始走大单品策略。

[15] HOU Q, UFER G, BARTELS D. Lipid signalling in plant responses to abiotic stress [J]. Plant, Cell & Environment, 2016,39(5): 1029-1048.

[16] LU S, YAO S, WANG G, et al. Phospholipase Dε enhances Braasca napus growth and seed production in response to nitrogen availability [J]. Plant Biotechnology Journal, 2016,14(3): 926-937.

[17] PETERS C, LI M, NARASIMHAN R, et al. Nonspecific phospholipase C NPC4 promotes responses to abscisic acid and tolerance to hyperosmotic stress in Arabidopsis [J]. The Plant Cell, 2010,22(8): 2642-2659.

[18] LI G, XUE H W. Arabidopsis PLDζ2 regulates vesicle trafficking and is required for auxin response [J]. The Plant Cell, 2007,19(1): 281-295.

[19] 陈长宝,朱树华,周 杰. 改良CTAB法提取成熟肥城桃果实的总RNA [J]. 山东农业科学, 2009(5): 102-104.

[20] 王俊斌,李 明,丁 博,等. 小麦磷脂酶Dα的基因克隆及其编码序列的生物信息学分析 [J]. 华北农学报, 2013,28(1): 117-122.

[21] 康虹丽. 蒙古冰草磷脂酶D基因全长cDNA 序列的克隆及生物信息学分析 [D]. 呼和浩特：内蒙古农业大学, 2008.

[22] HONG K, ZHANG L, ZHAN R, et al. Identification and characterization of phospholipase D genes putatively involved in internal browning of pineapple during postharvest storage [J]. Frontiers in Plant Science, 2017,8: 913.

[23] 王海燕,孙 磊. 磷脂酶 D 调控植物抗逆性的机理研究进展 [J]. 中国农学通报, 2011,27(21): 13-17.

[24] MAO L, PANG H, WANG G, et al. Phospholipase D and lipoxygenase activity of cucumber fruit in response to chilling stress [J]. Postharvest Biology and Technology, 2007,44(1): 42-47.