芜菁（Brassica rapa L.）属十字花科芸薹属2年生根菜类蔬菜。在新疆维吾尔语中称恰麻古，是维吾尔族居民食药两用的传统蔬菜［1］。目前，新疆地区所栽培的芜菁品种混杂，多为农户自行留种后育成的农家品种，由于这些农家品种存在提早抽薹现象严重且容易遭受病虫害，因此选育新的杂交品种已成为芜菁育种的主要方向。选育新的杂交品种需要纯合的亲本进行杂交，获得纯合的亲本一般通过常规技术进行多代自交，此方法耗时长、效率低。利用游离小孢子培养方法，可在1～2年内获得稳定的纯合自交系，缩短育种周期，提高育种效率［2］。因此，游离小孢子培养技术是芜菁育种的一条有效途径。

有关游离小孢子培养技术方面前人做了许多研究，其中，Lichter利用小孢子培养技术首次在甘蓝型油菜上成功地获得再生植株［3］；Sato等通过大白菜游离小孢子培养形成双单倍体植株用于育种［4］；Takahata等对3种花青菜的供体植株进行低温处理，然后再进行小孢子培养获得胚状体［5］；蒋武生等对芜菁小孢子热激处理后培养获得胚状体［6］；乔丽桃等对芜菁花蕾长度与小孢子单核靠边期的关系进行初步探究，并观察了芜菁小孢子胚胎发生的显微结构［7］；王娜等研究了芜菁花蕾大小与小孢子发育时期、小孢子胚胎发生率的对应关系［8］，但在试验过程中发现，芜菁胚状体发生率较低，这为后续试验的进行带来不便。因此，本试验对芜菁小孢子胚状体发生过程中的影响因素进行研究，以提高芜菁小孢子出胚率，从而为新疆芜菁的遗传育种研究提供基础条件。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料来源于新疆柯坪县当地农家芜菁品种阿恰芜菁。2015年8月于新疆农业大学林学与园艺学院试验田中种植芜菁材料，将收获的芜菁肉质根置于4℃低温下保存。2016年4月21日将已经通过低温春化的肉质根种植于露地，5月8日植株陆续抽薹开花，植株生长环境温度范围为12～26℃。

1.2 试验方法

1.2.1 花蕾的采集与处理 于每日 08：00—10：00（采蕾环境温度范围为15～18℃）随机摘取供试植株的主花序或一级分枝花序放入培养皿中，置于放有冰袋的泡沫箱中及时带回组培实验室。将花序上的花蕾轻轻用镊子取下，选取处于单核靠边期的花蕾［8］（约2.0～3.0mm）转移到2%NaClO（含2滴吐温乳化剂）中消毒10 min，再用无菌水冲洗3次，每次5 min。花蕾消毒及小孢子游离与培养的整个试验过程均在无菌条件下完成，且所用试验工具及液体都经灭菌后置于4℃条件预冷。

图5(b)是温度对苯酚降解的影响。随着反应温度的升高，苯酚的降解速率有所加快，在45 ℃时，10 min即可达到降解平衡。但是温度对反应速率的影响并不明显，即使在较低温度下仍然可以获得较高的催化反应速率。因此，当利用Fe3O4-C空心微球处理含酚废水时，可以选择在室温下进行。

对于商业综合体的开发而言，地段选择是首要工作，也是重中之重的工作。特别是对于一线城市，应该在原有地段的商业综合体进行二次开发，推倒重来进行建设。并且要把该地段具备的发展潜力和资金投入等因素。应当广泛建立与商业综合体相匹配的市场营销模式，为商业综合体实现持续稳定的发展提供良好保障。对于二、三、四线城市的商业综合体项目建设，也要选择城市商业中心位置用于商业综合体的开发建设，并且在项目投建之前，必须要充分做好项目评估工作，重点分析该项目是否与城市的经济发展水平相适应的问题，切不可贸然实施。必须要稳扎稳打，循序渐进地开展商业综合体项目建设，并制定完善的工作预案来应对可能造成的风险隐患。

1.2.2 小孢子的游离与培养 将消毒过的花蕾置于烧杯中，并加入1 mL B5洗涤培养基（pH值5.8），用注射器活塞压榨花蕾，释放小孢子，通过45μm尼龙筛网过滤小孢子悬浮液。将收集的滤液用B5培养基定容至5 mL，4℃、800 r／min离心5 min，之后倒掉上清液，留下沉淀，再倒入5mL B5培养基，重新悬浮小孢子并离心，共离心3次。最后，将收集到的小孢子用1 mLNLN培养基制成悬浮液，调整小孢子密度为10万～20万个／mL，分装至直径为60 mm的培养皿中，每皿约3 mL，用Parafilm膜封口。

蔗糖在小孢子培养的过程中调控着培养基的营养成分和渗透压［10］。由表2可知，13%蔗糖浓度（NLN－13）诱导率最高，为1.25胚／蕾；在蔗糖浓度为15%（NLN－15）时，出胚量相对较少，平均为0.85胚／蕾；蔗糖浓度为9%（NLN－9）时，未出现胚状体。结果表明，当蔗糖浓度为13%（NLN－13）和15%（NLN－15）时能够诱导出胚状体，但13%（NLN－13）的蔗糖浓度最适于芜菁小孢子的胚胎发生。

由表3可知，NLN－13培养基中单独添加6－BA时，小孢子胚诱导率较CK并无显著提高；添加0.1 mg／L 6－BA时出胚率相对最高，达到2.10胚／蕾；高浓度的6－BA有抑制胚状体的现象发生，当6－BA浓度为0.4 g／L时，出胚率降低到0.6胚／蕾，在所有激素处理中处于最低水平。培养基中单独添加NAA时，出胚率显著高于CK，随NAA浓度增加，出胚率呈先上升后下降的趋势，当NAA浓度为0.2 mg／L时达到最高，为8.60胚／蕾，是 CK的4.7倍，添加0.2 mg／LNAA是所有处理中能最有效提高出胚率的方法。在培养基中同时添加NAA与6－BA时，出胚率有小幅提升；当同时添加0.2 mg／L NAA和0.2 mg／L 6－BA时，芜菁小孢子的胚胎发生率达到最高，为3.15胚／蕾；增大NAA与6－BA浓度分别到0.4 mg／L时，胚诱导率下降到1.10胚／蕾。在培养基中加入激素能有效地提高小孢子胚胎发生的频率，但是加入激素后，胚状体的发育状况也受到影响。单独添加6－BA的处理中，所诱导出的胚状体发育不完全，畸形胚数量相对较少；单独添加0.2 mg／L NAA时，子叶形胚占胚状体总数的比率相对较高，达到72.1%；当NAA浓度为0.4 mg／L时，子叶形胚比率下降到 52.3%。综上所述，在培养基中单独添加0.2 mg／L NAA可以有效提高芜菁小孢子胚诱导率，且子叶形胚比率相对较高。当在培养基中同时添加NAA与6－BA时，并不能使小孢子胚胎发生与发育朝着良好的方向发展。

由表1可知，在其他培养条件相同的情况下，25℃（CK）条件下恒温培养未出现胚状体；热激温度为33℃、时间为24 h时，出胚率最高，为1.25胚／蕾，48 h后胚诱导率降至0.60胚／蕾，72 h后胚诱导率仅为0.05胚／蕾；当热激35℃、时间为 24 h时，胚诱导率为 0.35胚／蕾，48 h时为 0.20胚／蕾。本研究过程中还发现，33℃培养条件下形成的胚状体中子叶形胚比率最高，达到94.5%；而35℃时，子叶形胚比率仅为63.6%，这可能是由于热激温度过高，不适于小孢子的发育。有研究认为，热激时间以24 h为出胚率最高，小孢子培养的前12 h是小孢子分裂的敏感期，而胚胎发生的敏感期在开始培养的24 h内［9］。由此可见，热激处理对于芜菁的小孢子胚胎发生是必需的，本研究得出33℃、24 h的热激处理适用于芜菁游离小孢子培养。

从图1可以看出，小孢子的膨大情况各不相同，同一处理中出现了膨大的小孢子和未有变化的小孢子（图1－A）；随着培养时间的增加，小孢子形成细胞团（图1－B）；细胞团发育成为胚状体的过程为球形胚－鱼雷形胚－心形胚－子叶形胚（图1－C、图1－D、图1－E、图1－F）；未含激素的培养基中产生的小孢子胚发育状况良好（图1－G）；添加激素后小孢子胚胎数明显增多，但胚状体发育情况各异，出现较多畸形胚（图1－H）；胚状体转接至固体培养基后转绿（图1－I）。将小孢子胚接种于 B5＋0.2 mg／L 6－BA ＋0.05 mg／L NAA固体培养基上，胚状体逐渐转绿并开始萌发，胚状体萌发后形成较多幼芽。然后将幼芽转入B5＋0.2 mg／L NAA生根培养基上可以生根，形成完整植株。

2 结果与分析

2.1 不同热激温度、时间处理对芜菁胚状体发生的影响

培养基中添加6－BA和NAA培养：将小孢子沉淀物均匀悬浮于含有不同浓度 NAA（0.1、0.2、0.4 mg／L）、6－BA（0.1、0.2、0.4 mg／L）激素含量的 NLN－13培养基中，并分装于60 mm培养皿中，每皿3 mL，Parafilm膜封口。以不添加任何激素的NLN－13培养基作为对照组（CK）。经33℃、24 h热激处理后转到25℃黑暗静置培养。

 

表1 不同热激温度、时间处理对芜菁胚状体发生的影响

  

注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。下表同。

 

热激温度（℃）诱导率（胚／蕾）24 h 48 h 72 h子叶形胚占胚状体总数的比例（%）25 0.00c 0.00c 0.00b 0.0 33 1.25a 0.60a 0.05a 94.5 35 0.35b 0.20b 0.00b 63.6

2.2 不同蔗糖浓度对芜菁胚状体发生的影响

1.2.3 不同处理方法对小孢子胚胎发生率的影响 小孢子的高温热激处理：将不添加激素的NLN－13小孢子悬浮液放入恒温箱中黑暗静置培养，分别设置25℃（CK）、33℃、35℃共3种温度和24、48、72 h共3种时间的热激处理，随后转到25℃继续黑暗静置培养。

飞入混沌，飞入天空，飞入《福音书》。 陀思妥耶夫斯基以自己的辩证法焚毁了所有的丑，敞开了完全的自由，无限的自由以通向各种各样的美……[5]545

 

表2 不同蔗糖浓度对芜菁胚状体发生的影响

  

蔗糖浓度（%）产胚数（个）诱导率（胚／蕾）0.00c 13（CK） 25 1.25a 9 0 15 17 0.85b

2.3 不同激素配比对芜菁胚状体发生的影响

不同蔗糖浓度的培养基培养：分别用 NLN－9（蔗糖9%）、NLN－13（蔗糖13%）（CK）、NLN－15（蔗糖15%）3种不同蔗糖浓度且不含激素的NLN液体培养基悬浮培养小孢子，随后分装于60 mm培养皿中，每皿3 mL，Parafilm膜封口。经33℃、24 h热激处理后转到25℃黑暗静置培养。

2.4 小孢子离体发育过程

1.2.4 胚状体的观察 以上试验每个处理均取20个花蕾。培养30 d后统计产胚量，并将形成的小孢子胚转入固体培养基中培养。在培养过程中使用倒置显微镜观察小孢子的变化，采用 Duncans新复极差法进行产胚量间差异显著性比较。

不合理的教材结构，也严重限制了小学生思维能力的形成，比如说上述所提到的“位置和方向”这一知识点，内容跨度大，耗时长，无论是对学生知识点的理解和掌握还是对学生知识结构的形成都极为不利，要解决这一难题，除了在教材的编制上更为严谨外，教师在知识的传达方面也应更为完善，教师可以通过拓展方式，将不同的知识点进行延伸整合，以保证知识点能前后联系，从而让学生构建完整的知识体系，在拓展知识过程中，可以进一步要求学生对知识内容进行深度探究，以提升学生的自主思维能力。

3 结论与讨论

目前游离小孢子培养技术在大多数蔬菜的育种工作中都得以运用，本试验在已确定小孢子处于单核靠边期时花蕾大小的对应关系后，主要针对南疆地区主栽农家芜菁品种阿恰芜菁进行诱导，探究小孢子出胚的最适条件以获得更多数量的双单倍体纯合植株。

高温热激处理可以改变小孢子的发育途径，使其不能形成成熟的花粉粒转而向胚胎发育的途径发展，形成小孢子胚［11］。本研究认为，33℃、24 h的高温热激处理对芜菁小孢子胚胎发生是必要的，出胚率为1.25胚／蕾，而且小孢子胚的生长状况良好，多数可发育成子叶形胚。培养基中的蔗糖一方面维持着小孢子生长发育所需要的营养物质，另一方面调节着培养基中的渗透压［12－13］。在诱导油菜、大白菜等小孢子胚状体过程中发现，当NLN培养基中的蔗糖浓度为13%时，小孢子胚的发生与发育状况最好［14］，这与本研究所得结论一致。蒋武生等研究发现，不含任何激素的NLN培养基有利于胚状体的发育［15］；朱守亮等在 NLN－13培养基中添加0.1 mg／L 6－BA和 0.05 mg／L NAA能够诱导出高胚产量［16］；李岩等研究发现，NLN培养基中加入0.05mg／LNAA和0.05mg／L 6－BA的胚诱导率显著高于不加入任何激素的NLN培养基［17］；戴希刚等在进行羽衣甘蓝的小孢子培养试验中发现，6－BA对胚胎发生有抑制作用［18］。本试验结果表明，在NLN培养基中单独添加0.2 mg／L NAA可以显著提高小孢子出胚数，单独添加低浓度的6－BA能够促进芜菁小孢子胚的发生，但效果不如NAA明显，混合加入NAA与6－BA对小孢子胚的产生无明显作用。同时研究发现，添加激素后小孢子的胚胎发育受到一定影响，培养过程中出现畸形胚，胚状体到一定时期并不会再向着子叶形胚发展。本试验研究认为，采用33℃热激处理24 h时，在NLN－13中加入0.2 mg／L NAA是芜菁游离小孢子的胚胎发生与发育的最佳条件。

综上所述，宫腔镜手术中通过对围术期血糖的监测，能够有效预防水中毒并发症的发生，做到早发现、早治疗，大大提高了宫腔镜手术的安全性。

 

表3 不同激素浓度对芜菁胚状体发生的影响

  

激素浓度（mg／L）6－BA NAA胚状体总数（个）子叶形胚（个）鱼雷形胚心形胚、球形胚（个）畸形胚（个）诱导率（胚／蕾）子叶形胚占胚状体总数的比例（%）0.0 0.0 36 34 2 0 1.80cde 94.4 0.1 0.0 42 13 21 8 2.10bcde 31.0 0.2 0.0 37 23 12 2 1.23cde 62.2 0.4 0.0 12 3 6 3 0.60e 25.0 0.0 0.1 72 46 14 12 3.60b 63.9 0.0 0.2 172 124 23 25 8.60a 72.1 0.0 0.4 65 34 13 18 3.25bc 52.3 0.1 0.1 52 26 11 15 2.60bcd 50.0 0.2 0.2 63 39 23 1 3.15bc 61.9 0.4 0.4 22 13 5 4 1.10de 59.1

 

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