在水产养殖中，由副溶血弧菌诱发的病害频繁发生，病死率较高，已经成为水产养殖中最严重的病害之一（黄琪琰 1996；李立华 2016）。目前针对由副溶血弧菌引起的细菌性疾病的研究主要是使用现有的抗生素，但大量使用抗生素，不仅破坏生态环境，还会导致副溶血弧菌产生耐药性（吴后波和潘金培 2001；赵明军等 2009）。因此，寻找新型的抗生素已经成为人们研究的热点（展翔天等2002；Chen et al.2015），而海洋真菌已经成为抗生素的新资源。近年来研究发现海洋真菌代谢旺盛，生命活动复杂，并且与动植物有复杂的生态关系，因此能够产生活性独特的次级代谢产物，许多海洋真菌产生的次级代谢产物已经广泛的用作抗细菌、抗真菌和抗肿瘤的药物（Suryanarayanan 2012；Anak et al.2016）。许多研究者已经从海洋真菌中分离得到很多结构新颖的、有活性的化合物，并对其菌株的发酵条件、化合物的分离鉴定做了研究，也取得了很好的成果（Ebada et al.2011；Zhou et al.2011）。作者从海南陵水采集的海绵中分离得到海洋真菌Penicillium chrysogenum LS16，该菌对水产致病菌——副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus有较强的抑菌作用，表现出良好的生物防治潜力。本文采用硅胶柱层析、高效液相色谱等色谱层析技术、从海绵共生真菌LS16中分离提取抗菌活性物质，以副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus 为指示菌，进行生物活性追踪，采用1H NMR和13C NMR等波谱数据鉴定其化学结构，分子式为C15H15NO3，为抗水产致病菌提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

旋转蒸发仪（IKA公司），分析型高效液相色谱仪为 Waters 600 controller（美国 Waters公司），分析型色谱柱为 YMC‐Pack ODS‐A（北京慧德易科技有限公司），超高效液相色谱仪为ACQUITY UPLC H‐Class Bio（美国 Waters公司），硅胶柱层析所用硅胶为 100–200目（青岛海洋化工有限公司），Sephadex LH‐20，核磁共振仪为 Avance‐500 型（瑞士布鲁克公司），质谱仪为 LCQ‐Advantage液质联用（美国菲尼根质谱公司），高效液相色谱和LC‐MS 所用甲醇为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司），其他试剂为化学纯或分析纯，水为超纯水。

“不要急，先听我说完。在现实里，男主人公不是带着两个疑问黯然离去吗？在现实结束的地方正是小说的开端，这也是小说家的用武之地。S返回果城，跟踪监控那个情敌。有大半年，他一无所获，他看到的全是其夫唱妇随的恩爱镜头。S涌起了对前妻的刻骨思念，又为她被‘霸占’而火冒三丈。功夫不负有心人，S终于拍摄到了情敌出轨的镜头，S激动得浑身颤栗，想起了昔日看着那个女人掏出那个大牛皮信封的情景。就要一报还一报了。S曾猜想那沓照片肯定跟那个男人有关，只是苦于没有真凭实据，也没有蛛丝马迹。”

1.2 菌株和培养基

海绵由实验室从海南陵水采集，通过分离纯化获得真菌菌株LS16并保存。供试菌副溶血弧菌V.parahemolyticus由宁波大学海洋学院陶震老师实验室提供。

菌株LS16的发酵及保藏培养基为PDB培养基（马铃薯 10g，葡萄糖 20g，海水 1L）。供试菌的活化以及培养用TSB培养基（胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，海水 1L）。

1.3 菌株LS16的鉴定

1.3.1 形态学鉴定：接种菌株LS16于PDA培养基中，28℃条件下放入恒温培养箱中培养，每天定时观察菌落形态。

课后，与科学教师交流，她不是纯粹的台湾籍教师，是本地人但在这所学校工作多年，或多或少地有点我国大陆教师的味道。

1.3.2 分子生物学鉴定：按真菌基因组DNA抽提试剂盒的提取方法，从培养好的 LS16菌体中提取DNA。以菌株LS16的基因组DNA为模板，采用真菌通用引物 NS1（5′‐GTAGTCATATGCTTGTCTC‐3′）和NS8（5′‐TCCGCAGGTTCACCTACGGA‐3′）进行 PCR 扩增。PCR 反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，进行 30 个循环；72℃ 10min，4℃保存。PCR产物纯化后由上海生工生物工程有限公司完成测序。将菌株的核酸序列与 GenBank中相关核酸序列进行BLAST比对，用 MEGA软件构建系统发育树，确定菌株的分类地位。

1.4 活性物质分离与鉴定

1.4.1 菌株LS16发酵液的制备：菌株LS16在500mL三角瓶中发酵，每个三角瓶接种 200mL的液体培养基，接种量10%，置于28℃、180r/min恒温振荡培养箱中培养4d获得种子液。

Li LH,2016.The present situation and development trend of China′s aquaculture disease control technology.Heilongjiang Science and Technology Information,2016(8): 274 (in Chinese)

将种子液接种到装有大米培养基的三角瓶中，每瓶接种50mL，共接种96瓶，置于28℃静置发酵30d。每瓶加入100mL的甲醇，100Hz、37℃超声15min，用纱布过滤，得到9.2L滤液。再按上述方法重复2次，共获得27L滤液。将滤液倒入反应釜中，加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，静置分层后，依次倒出下层液体和上清液，将下层液体再加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，将两次得到的上清液混合。利用IKA真空旋转蒸发仪，37℃旋转浓缩蒸发至干，获得菌株LS16发酵的萃取物为34.2g。

1.4.2 抗菌实验：将培养好的副溶血弧菌配置成107CFU/mL的菌悬液，取 100μL菌液均匀涂布在TSA培养基的平板上，用无菌镊子夹取灭过菌的牛津杯放置在平板上。取 1g粗提物用乙酸乙酯溶成40mg/mL的溶液，加入200μL于牛津杯内，同时另外一个牛津杯加入等体积的乙酸乙酯作对照。做 3组平行，最后将平板放入37℃恒温培养箱中培养。

1.4.3 抗菌活性物质的提取纯化：粗提物用硅胶柱进行初步分离，硅胶柱的直径和长为10cm×15cm，干法上样，用9种不同极性的洗脱液进行洗脱，分别为石油醚∶乙酸乙酯=1∶0（V/V）2 000mL，石油醚∶乙酸乙酯=100∶10（V/V）2 000mL，石油醚∶乙酸乙酯=100∶30（V/V）3 000mL，石油醚∶乙酸乙酯=100∶50（V/V）4 000mL，石油醚∶乙酸乙酯= 100∶100（V/V）3 000mL，石油醚∶乙酸乙酯=50∶100（V/V）2 000mL，石油醚∶乙酸乙酯=0∶100（V/V）3 000mL，甲醇∶乙酸乙酯=100∶100（V/V）2 000mL，甲醇∶乙酸乙酯=1:0（V/V）2 000mL。按极性进行洗脱，按照洗脱顺序将洗脱液装瓶，每瓶装500mL，用真空旋转蒸发仪将洗脱液蒸至10mL，采用薄层色谱法点样，合并样品得7个组分，以副溶血弧菌为指示菌测定组分的抗菌活性，将组分放置‐20℃冰箱保存。

将具有抗菌活性的组分进一步进行分离，采用葡聚糖凝胶层析柱近一步分离除杂，分离介质为Sephadex LH‐20，以甲醇‐二氯甲烷（1:1）为洗脱液进行洗脱，每个三角瓶收集100mL，利用UPLC检测并合并蒸干。将上述蒸干的组分，用等量的ODS拌样，使其成粉末状，将样品上柱，填满棉花，过中压柱层析，用甲醇∶超纯水=3:7的洗脱液进行梯度洗脱，最终的洗脱液为 100%甲醇，流速为20mL/min，洗脱时间为 120min，每 3min收集一管，用UPLC检测每管样品并合并，测定其抑菌活性。用一定量的甲醇将上述有抑菌活性的组分溶解，利用HPLC制备系统分离制备，进样量为80μL，利用C18半制备柱，65%/35%甲醇和水作为洗脱液等度洗脱，不同的峰收集在不同的试管中，蒸干得到化合物，测定其抑菌活性。

Fang ZH,Xu XY,2012.The present situation and prospect of the prevention and control of aquaculture diseases.Agriculture and Technology,32(10): 130 (in Chinese)

1.4.4 抗菌活性组分的纯度检测：取少量样品溶于乙腈，经0.22μm的有机膜过滤后，利用HPLC以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱。色谱条件为10% ACN 到 100% ACN，分析柱为 YMC‐Pack ODS‐A，PDA检测器，检测波长为220nm，进样量为 10μL，以0.8 mL/min的流速洗脱50min。

1.4.5 抗菌活性组分的结构鉴定：将纯化合物转移至核磁管中，加入600μL氘代氯仿溶解，在Bruker Avance 500MHz上进行扫描，测定氢谱和碳谱，以四甲基硅烷（TMS）为内标，得到该化合物的波谱数据。进一步对化合物进行质谱测定，得到该化合物的分子量，综合推断其化学结构。

党内法规是规范党内行为主体的行为规范体系，健全党内法规体系是推动全面从严治党向纵深发展的根本保障，习近平总书记指出，“各级党组织要把严守纪律、严明规矩放到重要位置来抓，努力在全党营造守纪律、讲规矩的氛围”[7]P156。健全的法规制度体系是保证政党组织健康发展的必备要件，制度建设是全面从严治党的根本抓手和治本之策，要健全和完善党内法规制度体系，培育党内制度文化、优化制度环境，向制度建设要长效。

2 结果与分析

2.1 菌株LS16的鉴定结果

在PDA培养基上，菌株LS16菌落长得比较快（28℃生长4d），针状，颜色为青绿色（图1）。菌株LS16经PCR扩增得到ITS基因片段，测序结果通过BLAST比对，发现LS16菌株的序列与产黄青霉属菌Penicillium chrysogenum的相关序列相似度比较高，两者在系统发育树（图2）上属于同一分支，结合其形态特征，将菌株LS16初步鉴定为产黄青霉属菌。

  

图1 菌株LS16的菌落图 Fig.1 Colonies of the strain Penicillium chrysogenum LS16.

  

图2 基于菌株LS16 ITS基因片段序列构建的系统发育树 Fig.2 Phylogenetic tree based on sequence construction of strain Penicillium chrysogenum LS16 ITS gene fragment.

2.2 菌株LS16发酵液抗菌活性测试

致谢：感谢宁波大学陶振老师赠送供试致病菌株。

  

图3 菌株 LS16发酵液萃取物的抑菌效果图 A：乙酸乙酯对照；B：菌株LS16发酵液乙酸乙酯萃取 Fig.3 Antibacterial activity of the crude extracts from the strain Penicillium chrysogenum LS16.A: The control of ethyl acetate; B: Extraction phase of strain LS16 fermentation liquid by ethyl acetate.

2.3 抗菌活性物质的提取纯化及抗菌活性

依次用不同的洗脱液进行梯度洗脱，TLC检测不同的收集瓶，结果表明，不同比例的洗脱液洗脱的速度不同，经 TLC检测紫外灯和香草醛显色结果，合并具有相同斑点的洗脱液。通过抑菌实验检测，只有组分15–22和23–28具有抑菌活性（表1）。

将上述具有抑菌活性的组分合并，用甲醇:二氯甲烷=1:1的洗脱液等度洗脱，共收集 20瓶洗脱液（1–20），经 UPLC 检测，其中 1–6 瓶、17–20 瓶在254nm波长没有吸收，合并在254nm有吸收的组分7–16瓶，记为C组分。C组分经中压柱层析梯度洗脱，每 3min收集一管，共收集 40管（1–40），经 UPLC检测，其中 1–7管在 254nm 处没有吸收，合并在254nm波长有相同吸收的组分，其中8–12管、13–19管、20–24管、25–31管、32–36管、37–40管合并，通过抑菌实验检测，20–24管有抑菌活性，记为 C1组分，其他组分均无活性。将C1组分用高效液相色谱法进行分离，65%甲醇进行等度洗脱，进样量为80μL，254nm紫外检测，见峰收集。洗脱18min时开始出现单一峰，开始收集，得到5个化合物（图4），5个化合物的干重分别为1.3、12.4、0.4、4.2和4.4mg。经检测只有化合物2具有抗菌活性（图5），抑菌圈直径为28.36mm，具有较强的抑菌活性，化合物1、3、4、5无显著的抑菌活性，故没有鉴定其结构。

 

表1 粗提物硅胶柱层析结果 Table1 The result of crude extract after silica gel column chromatography

  

注：“+”代表有抗菌活性；“‐”代表无抗菌活性 Note: “+” Indicated that the collection of fluid showed antibacterial activity to Vibrio parahemolyticus; “‐” Indicated that the collection of fluid showed no antibacterial activity to V.parahemolyticus.

 

洗脱液比例 Elution ration 洗脱体积 Elution volume (mL) 收集瓶 Collecting pipe 抑菌活性 Antibacterial activity 石油醚 2 000 1–4 ‐ Petroleum ether 石油醚∶乙酸乙酯（10:1） 2 000 5–8 ‐ Petroleum ether : Ethyl acetate (10:1) 石油醚∶乙酸乙酯（10:3） 3 000 9–14 ‐ Petroleum ether : Ethyl acetate (10:3) 石油醚∶乙酸乙酯（2:1） 4 000 15–22 + Petroleum ether : Ethyl acetate (2:1) 石油醚∶乙酸乙酯（1:1） 3 000 23–28 + Petroleum ether : Ethyl acetate (1:1) 石油醚∶乙酸乙酯（1:2） 2 000 29–32 ‐ Petroleum ether : Ethyl acetate (1:2) 乙酸乙酯 3 000 33–38 ‐ Ethyl acetate 甲醇∶乙酸乙酯（1:1） 2 000 39–42 ‐ Methanol : Ethyl acetate (1:1) 甲醇 1 000 43–44 ‐ Methanol

  

图4 C1组分高效液相色谱分离的洗脱曲线 Fig.4 The HPLC elution curve of compound C1.

2.4 抗菌活性成分的纯度检测

Zhuang YB,Teng XC,Wang Y,Liu PP,Li GQ,Zhu WM,2011.New quinazolinone alkaloids within rare amino acid residue from coral‐associated fungus,Aspergillus versicolor lcj‐5‐4.Organic Letters,13(5): 1130

  

图5 菌株LS16发酵液中目标成分的抑菌效果图 A：乙酸乙酯对照；B：菌株LS16发酵液中目标成分 Fig.5 Antibacterial activity of target compound of strain Penicillium chrysogenum LS16 crude extracts.A: The control of ethyl acetate; B: The target compound from the fermentation broth of LS16.

  

图6 组分2高液相色谱纯度检测 Fig.6 HPLC spectrum of compound 2.

2.5 化合物结构鉴定

该化合物为黄色粉末，阳离子在m/z 258.006处给出准分子离子峰 [M+H]＋（图7），表明化合物的相对分子质量为257，通过相对分子质量可以确定该化合物含有 N元素。结合氢谱和碳谱，可以确定该化合物的分子式为C15H15NO3，不饱和度为9。化合物的 1H NMR（图8）和 13C NMR（图9）的数据见表2。从图8可知，氢信号δ 7.53（1H，d，J=8.3Hz），δ 6.99（1H，d，J=8.3Hz），表明苯环上有两个邻位氢并且具有四取代；此外，通过氢信号 δ 7.13（1H，s），δ 9.4（1H，s）可以确定含有烯氢；而氢信号 δ 0.98（3H，d，J=6.3Hz）、δ 1.24（3H，d，J=6.6Hz），δ 2.42（1H，m）提示两个甲基与一个次甲基相连，氢信号δ 2.50（3H，s）则表明一个甲基与季碳相连。从图9可知，13C NMR谱图共显示15个碳信号，碳信号δ 198.75（C‐2）表明有羰基碳；另外，碳信号 δ 16.0（C‐12），16.0（C‐13），23.8（C‐10）表明有 3 组甲基碳存在，碳信号δ 34.1（C‐11）为次甲基碳信号。该化合物的数据与 Kohno et al.（1999）报道的基本一致，其化学结构式见图10，为生物碱类化合物。

3 讨论

随着水产养殖规模的不断增加，而管理与技术的发展相对滞后，出现了水域坏境恶化等问题，导致水产动物病害频发，其中副溶血弧菌病害给水产养殖造成了严重的危害，也是目前海洋鱼类等海洋经济动物养殖业发展的最主要障碍之一（方朝辉和徐小雅 2012；Stephanie et al.2017）。在养殖过程中，大量的使用抗生素来防治细菌病，不科学的滥用抗生素，会导致水环境不断恶化，严重危害水生动物的生长（唐开华和何宝富 2008；周泽琴等 2015）。关于抗副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus活性成分的分离纯化以及生物防治鲜见报道。生物 碱作为一种重要的天然产物，种类繁多，大多数生物碱具有生理活性，国内外很多学者报道植物和微生物都能产生生物碱，随着对生物碱的研究，越来越多的具有抑菌、杀菌活性的生物碱类化合物被发现，Zhou et al.（2014）研究发现海绵来源的曲霉Aspergillus sp.产生的生物碱可以选择性地抑制弧菌的生长，Zhuang et al.（2011）研究发现珊瑚来源的曲霉 Aspergillus versicolor产生的生物碱对白色念珠菌有中等抑制活性。本研究采用牛津杯法对海绵共生真菌 LS16发酵液进行抗副溶血弧菌 V.parahemolyticus活性的研究，通过乙酸乙酯萃取、硅胶柱吸附层析、Sephadex LH‐20柱层析、UPLC、HPLC等技术，对抗菌活性物质进行分离纯化，并采用NMR对活性组分进行结构鉴定，确定活性组分为C15H15NO3，此化合物属于生物碱类化合物。抗副溶血弧菌V.parahemolyticus的活性测试表明，此化合物有较强的抗菌活性，说明该化合物具有开发成水产抗生素的潜力，为从海洋微生物发酵的次级代谢产物中分离新的水产抗生素奠定了基础。

  

图7 化合物 2 的 ESI‐MS（positive）图谱 Fig.7 ESI‐MS spectrum of compound 2.

  

图8 化合物2的1H NMR图谱 Fig.8 1H NMR spectrum of compound 2.

  

图9 化合物2的13C NMR图谱 Fig.9 13C NMR spectrum of compound 2.

  

图10 化合物2的结构式 Fig.10 The structure of compound 2.

 

表 2 化合物 2 的 1H NMR、13C NMR 数据 Table 2 1H NMR and 13C NMR data for compound 2

  

Position 13C 1H 2 110.6 3 198.8 3a 115.8 4 124.4 7.53 (1H,d,8.3) 5 119.7 6.99 (1H,d,8.3) 5a 142.1 6 119.4 7.13 (1H,s) 7 156.7 9 147.2 9.48 (1H,s) 9a 114.8 9b 171.7 10 23.8 2.50 (3H,s) 11 34.1 2.42(1H,m) 12 16.0 0.98 (3H,d,6.3) 13 16.0 1.24 (3H,d,6.6)

菌株 LS16发酵液乙酸乙酯萃取物的抗菌活性测试表明，菌株LS16发酵液乙酸乙酯萃取物对副溶血弧菌有抑菌作用，牛津杯中加有乙酸乙酯萃取物的实验组平均抑菌圈直径为 12.24mm （图3），加乙酸乙酯的对照组抑菌圈直径为零，即说明菌株 LS16发酵液乙酸乙酯萃取物有较强的抑菌活性。

[REFERENCES]

具体的处理时间，1月24日与1月30日至2月2日两个时间段处理的花序，拉长花序的效果不一样，处理后产生的副作用也不一样。处理时间早，花序拉得长。1月24日花序长至7～10 cm （新梢 20～25 cm，5 片真叶完全展开），处理倍数为1∶60 000，花序处理后果穗长度适中，处理后产生的副作用也小。在2月2日处理的，花序处理时间相对晚，处理时采用1月24日的浓度，处理后的果穗比1月24日处理的重，但副作用也比较明显，比如有的果穗上出现不脱落和发育不全的小果粒，花序拉得过长，果穗稀疏松散等。

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2.1.3 心肺复苏致心脏破裂 男性3名，女性1名；年龄62.3±22.4岁；心脏质量382.5±43.5 g；心包积液量41.3±30.1 mL，均无凝血块，心包积液量明显小于急性心梗致心脏破裂和主动脉夹层破裂致心包填塞组（P＜0.01，表1，表4，图1）。

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林小敏走前,留下了那个塑料袋。袋里装的,是两条中华烟和一张纸条。卢一平掂着礼品,心里一阵酸楚。毕竟有人看到我了,毕竟有人想起我了,毕竟有人求到我了！尽管林小敏的表现,已经引起卢一平的警觉了,但是,有一点是做对了——她让卢一平多少找回了一些当年的感觉！

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园中的朋友，访也访不完，但是我们心有灵犀一点通，它们一定不会怪罪我，在我读书的空当儿，它们就是我心灵深处最可爱的伙伴，我爱它们！

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将2.2中制备好的化合物，按照1.3.4中的色谱条件进行纯度检测，根据 HPLC检测结果，该化合物的纯度为96.3%（图6），达到化合物鉴定的要求。

[附中文参考文献]

刘家平表示，与华谊集团合作开发603地块，既是桃浦转型赋予临港集团的宝贵机遇，也是市国资委、普陀区、华谊集团对临港集团的信任。桃浦地区作为全市五大转型区域的先发区域，临港集团必将不辱使命、不负重托，坚持对标国际最高标准、最好水平，从建设高品质城区的定位进行整体规划建设，加快培育高质量产业，建设高品质物业，集聚高素质人才，打造高活力生态，建设有温度、有活力的卓越科创园区，为实现桃浦地区“脱胎换骨”式的转型发展而努力。

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已有研究表明世界上一些国家和地区成为自然灾害风险分析的热点地区，不仅与本地区灾害频发有关，也与该地区高度的国际化水平有关[1-2，9].世界银行的研究报告中指出因全球金融、贸易等的高速发展，使得自然灾害影响的空间波及效应明显增强[34，38].史培军等同样强调在全球化的背景下，互联网、无线通信等高新信息技术的发展，为巨灾风险的时空转移提供了基础[7].

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目前国内农业需求市场冷清；工业方面，复合肥和胶合板企业开工率持续保持低位，原料采购和贸易商备肥需求受高价影响有所缩减，但生产企业库存压力较小，挺价意愿明显。国际方面，国际价格持续上涨。供给方面，尿素开工率缓慢上行。综上预计近期尿素价格或将稳中略跌，需要关注下游采购情况。

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对EP（D）M产品而言，重要的不单是几个主要指标参数（如门尼黏度、乙烯含量、第三单体含量和充油份数）的变化范围要窄，Keltan也通过积极参加相关标准委员会（如荷兰标准制定组织NEN，国际标准化组织ISO，美国试验材料学会ASTM等）及其相关会议，持续探索最适合的测试方法。近年来，Keltan在开发EP（D）M化学组成及支化度等测试上作出了非常突出的贡献。

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建筑工程项目施工安全管理挣值法的4个安全绩效评价指标为：安全保障水平偏差指标、安全成本值偏差指标、安全保障水平绩效指标、安全成本绩效指标。其计算式如(4)～(7)所示。