牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)为芍药科芍药属名贵观赏和药用木本花卉，花大而美，有“花中之王”的美誉[1]。迄今为止，牡丹的组织培养已有大量研究[2-7]，主要集中在品种的选择[8-10]、外植体遗传因素的影响[11-12]、外植体的种类及取材时间[13-15]、基本培养基类型及生长调节物质[16-18]、环境因子调控[19-21]等方面，但尚未建立起高效稳定的再生体系。

体细胞胚胎发生具有数量多、繁殖速度快、结构完整、植株再生率高、不受季节影响等特点，是植物大规模繁殖的主要手段之一[22-25]。目前，胡萝卜、拟南芥、龙眼等都建立了体胚发生及再生植株培养体系，且发现提高非胚性愈伤组织向胚性愈伤组织转化率是建立其体胚间接发生途径的关键步骤之一[26-28]。在大花蕙兰[29]、枸杞[30]等植物体胚发生过程中发现适宜的激素浓度可以促进体胚的发生，频率有一定的影响。另外，有研究表明，超氧物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性和可溶性蛋白含量变化与胚性愈伤组织的诱导及体胚发生的频率密切相关[31-34]。但目前牡丹尚未建立体细胞胚发生途径，非胚性愈伤组织向胚性愈伤组织转化率是限制因子之一[35-38]。因此，本试验以牡丹品种‘凤丹白’愈伤组织为材料，拟探究不同6-BA和NAA比例及浓度处理对胚性愈伤组织诱导及抗氧化酶(POD、SOD、CAT)活性和可溶性蛋白含量的影响，以期为探索牡丹非胚性愈伤组织向胚性愈伤组织转化的可行条件和建立稳定的牡丹体胚发生体系提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以牡丹品种‘凤丹白’(P. suffruticosa ‘Fengdanbai’)未萌动鳞芽为外植体(采自洛阳神州牡丹园苗木基地)，获得试管苗，然后转入1/2MS+Ca2+(WPM)+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L+PVP 1.0 g/L+LH 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L(pH=5.8)的固体培养基上培养40 d，获得愈伤组织。将诱导出的愈伤组织转入1/2 MS+Ca2+(WPM)+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+PVP 1.0 g/L+LH 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L(pH=5.8)的固体培养基上增殖培养后作为供试材料。

培养条件：温度(24±1)℃,光强 40 μmol/(m2·s)，光照时间12 h/d。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 本试验以1/2 MS+Ca2+(WPM)+PVP 1.0 g/L+LH 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L为基本培养基，外源添加不同比例和浓度的NAA和6-BA为处理，以CK为对照，共设置10个处理(表1)。将供试的愈伤组织材料分别接种于不同处理培养基中，并分别于培养的第0、5、10、15、20、25和30天取样，测定POD、SOD和CAT活性，各处理重复3次。

 

表1 牡丹胚性愈伤组织诱导过程中NAA和6-BA不同浓度配比

 

Tab.1 Different concentration ratios of NAA and 6-BA in the induction process of peony embryo callus

  

处理Treatment外源激素种类及浓度ThetypesandconcentrationsofexogenoushormonesNAA/(mg·L-1)6-BA/(mg·L-1)CK00100．3200．5300．740．10．350．10．560．10．770．20．380．20．590．20．7

1.2.2 指标测定及统计分析 采用愈创木酚法测定POD活性[39]；氮蓝四唑(NBT)法测定SOD活性[40]；KMnO4法测定CAT活性[40]；可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法[39]测定，每项指标测定均重复3次，取其平均值。利用石蜡切片法[41-42]进行细胞形态学观察。

1.3 数据分析

试验数据采用DPS 7.05和Excel 2003进行处理分析，均采用邓肯氏新复极差测验法(SSR法)测验其差异显著性，显著水平P≤0.05。

2 结果分析

2.1 解剖结构观察

通过细胞学观察发现，不同激素处理对牡丹‘凤丹白’胚性细胞发生时间的影响存在显著差异，且诱导效果差异较大，以处理8(NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L)效果为最佳。此处理下，第20天开始出现胚性细胞(图1A)；第25天胚性细胞大量出现，并与非胚性细胞共存(图1B)；第30天出现胚性细胞、非胚性细胞和早期球形胚共存的现象，其中非胚性愈伤组织的细胞排列疏松、液泡较大，形状不规则，而胚性愈伤组织细胞小，排列紧密，细胞核较大，为细胞分裂提供物质基础，有利于体胚的进一步发育(图1C)。

  

图1 不同浓度NAA和6-BA处理下牡丹体胚发生的细胞学观察Fig.1 Cytological observations of the different concentration ratios of NAA and 6-BA in the induction process of peony embryo callus

2.2 抗氧化酶活性的变化

2.2.1 POD活性 不同浓度NAA和6-BA处理对牡丹‘凤丹白’愈伤组织POD活性变化的影响存在显著差异(表2)。各处理中POD活性整体呈现“下降—上升—下降—上升”或“上升—下降—上升”的趋势。但处理4和6整体呈下降趋势；处理9在1～5 d达到峰值，然后反应值于20 d(胚性细胞出现时间)降到最小值后有所上升，和其它处理的变化趋势相反。处理1、2、3、5、6和8均在起始阶段呈下降趋势，但达到极小值的时间多集中于5～10 d，而后再于15～20 d达到最大值，这与胚性细胞出现时间相同；其中处理3和8的POD活性在第20天达到最大值后保持较高水平，并且于25～30 d分别是其它处理平均水平的1.8～2.3倍。

 

表2 不同浓度NAA和6-BA对牡丹体胚发生过程中POD活性变化的影响

 

Tab.2 Effects of different concentration ratios of NAA and 6-BA on POD activity in the process of the embryo of peony

  

处理Treatment培养天数/d Cultivateddays051015202530CK73．64ab29．23e15．03f16．16f98．18a56．09b56．03bc173．64ab61．24b52．63c60．21b84．22a65．63b49．96d273．64bc26．27h64．59c56．23d95．55a76．22bc21．27h373．64c5．296j15．51j51．14e96．02a91．98a90．91a473．64a51．44c50．57cd43．26d54．78c49．24d44．92d573．64c70．8cd28．65i78．21c62．42d54．08e101．54a673．64a54．23c23．4g48．36d60．164b43．48d41．45e773．64e32．08i97．03d172．2a56．12f66．64e75．5e873．64c10．71j98．8b35．24i124．25a120．34a115．74a973．64b100．26a92．66a21．68f18．89g38．24f84．1b

同列数据后标不同字母表示处理间差异显著(P<0.05；n=3)。下表同。

Different letters indicate significant differences between treatments at P<0.05(n=3).The same as below.

2.2.2 SOD活性 不同浓度NAA和6-BA处理对牡丹‘凤丹白’愈伤组织SOD活性变化的影响差异较大(表3)。大多数处理的SOD活性整体呈“上升—下降”趋势；而处理CK和8整体呈上升趋势。各处理间SOD活性达到最大值的时间亦不同，处理1和9的SOD活性达到最大值的时间是第5天，而后呈下降趋势，特别在20～30 d之间呈显著下降趋势；处理2、3、4、5、6和7达到最大值的时间虽然与处理1和9不同，但在20～30 d之间的变化趋势类似。处理CK与处理8均呈上升趋势且于第30天达到最大值，但二者上升趋势不同：处理CK呈波浪式上升趋势，且在第25天达到仅次于第0天的极小值；而处理8整体处于一直上升趋势，且在第15天开始显著高于0～10 d的SOD活性；其变化趋势与胚性细胞出现以及形成时间重合。

 

表3 不同浓度NAA和6-BA处理下牡丹体胚发生过程中SOD活性变化的影响

 

Tab.3 Effects of different concentration ratios of NAA and 6-BA on SOD activity in the process of the embryo of peony

  

处理Treatment培养天数/d Cultivateddays051015202530CK9．31e12．12d23．97b17．17bc24．51b11．35d31．97a19．31d26．43a21．9ab26．17a24．57a21．02ab16．32b29．31d8．592d23．44a12．11c27．92a9．84d23．9a39．31e8．16d13．06d15．88d55．04a30．62c21．74d49．31h8．343h47．64b53．67a59．44a46．2b23．53d59．31f13．33de33．56a11．19e8．95f10．37de18．69d69．31d23．05b34．67a12．14c19．11bc5．96e12．99c79．31d33．36a37．98a10．23d17．21c15．59c16．65c89．31d13．12c16．75c24．37b27．77b33．78a37．08a99．31d37．37a25．52b31．24a18．74c15．28c17．05c

2.2.3 CAT活性 不同浓度NAA和6-BA处理对牡丹‘凤丹白’愈伤组织CAT活性变化的影响存在显著差异(表 4)。各处理CAT活性整体呈现“下降—上升—下降—上升”或“上升—下降—上升”的趋势。但处理CK和6于第1～5天达到最大值后整体呈下降趋势，且处理CK下降的最小极值处于第20天(胚性细胞出现时间)；处理9在1～5 d达到峰值后于第10天降到最低值，然后呈上升趋势，但在第20天的反应值仍低于第5天；处理1、3、4和5均在第25天达到峰值，其中处理1和4的最小极值均出现在第20天，处理3和5的最小极值分别在第10天和第5天；而处理2和8反应的最大值均出现在20 d，其中处理2在20 d之前的变化趋势不稳定且整体反应值处于较低水平，处理8在0 d后反应值一直呈上升趋势，于20 d达到峰值后虽有所下降但整体保持较高水平，并且于25～30 d的CAT活性是其它处理平均活性的2.53～8.89倍。

中国以煤为主的能源资源禀赋决定了中国经济的高碳特性,但是,中国政府大力提高能效、开发非化石能源,在“十一五”规划中明确提出了降低单位国内生产总值能耗的约束性指标,并在2009年联合国哥本哈根气候会议前,向国际社会作出公开承诺,在2020年将单位国内生产总值的二氧化碳排放量相对于2005年水平减少40%～45%。这些举措充分展现了中国政府节能减排的政治意愿和坚定决心。

 

表4 不同浓度NAA和6-BA处理下牡丹体胚发生过程中CAT活性变化的影响

 

Tab.4 Effects of different concentration ratios of NAA and 6-BA on CAT activity in the process of the embryo of peony

  

处理Treatment培养天数/d Cultivateddays051015202530CK14．88e54．49a25．02d11．53e7．15f7．88f7．08f114．88i9．86j5．95j8．65j7．1j91．55a12．18i214．88b8．243d13．76b10．67c17．1a16．52a10．62c314．88h28．51e6．29i43．92c8．85i63．35a4．395j414．88h14．52h11．45h8．12i6．7i68．74a4．09j514．88c8．68d9．32d19．65b18．81b22．35a14．71c614．88e59．68a25．76d5．82g18．82c3．15g9．06f714．88d7．98e13．11d46．2a6．74f16．36d8．91e814．88j28．11i42．17e94．82a95．02a85．8ab86．18ab914．88b17．56a9．74c10．49c15．8b15．95b16．21a

2.3 可溶性蛋白含量的变化

不同浓度NAA和6-BA处理对牡丹‘凤丹白’愈伤组织可溶性蛋白活性变化的影响各不相同(表 5)。大部分处理的可溶性蛋白含量整体呈现“下降—上升—下降—上升”或“下降—上升—下降”的趋势，只有处理9在1～5 d呈上升趋势后下降，20 d(胚性细胞开始出现时间)的反应值低于0 d，于25 d急速上升到峰值后下降到最小极值。处理1于15 d达到峰值后于25 d(胚性细胞大量出现时间)降到最小极值；处理2于10 d达到最大值后于20 d降到最小值；处理5在5～25 d的可溶性蛋白含量不稳定，于20 d降到最小极值后到第25天反弹到最大反应值；处理6于第10天升到最大值后开始下降并于30 d(早期球形胚出现时间)降到最小极值。而处理CK、3、4、7和8均在1～5 d出现最小极值，其中处理CK于25 d升到峰值后下降；处理3和7均于25 d达到峰值，且5～25 d之间的反映值不稳定，呈现忽高忽低的变化趋势；处理4和8均于30 d达到峰值，其中处理8在5 d后一直呈上升趋势，处理4在20～30 d的反映值不稳定且整体反应值低于处理8。

 

表5 不同浓度NAA和6-BA处理下牡丹体胚发生过程中可溶性蛋白含量的影响

 

Tab.5 Effects of different concentration ratios of NAA and 6-BA onsoluble protein in the process of the embryo of peony

  

处理Treatment培养天数/d Cultivateddays051015202530CK22．64a9．27d18．36b24．15a25．38a15．38bc14．76bc122．64ab9．71e22．55ab27．16a16．71c9．44e26．98a222．64a13．87c23．61a22．37a12．72c19．1b15．11bc322．64bc10．24d19．36c28．4b16．79c39．47a17．33c422．64b14．76d23．35b25．56ab27．6ab25．38ab33．09a522．64b16．01d17．59d19．63c10．42e30．61a15．2d622．64a18．83b23．35a22．46a13．61c11．22c9．44d722．64a16．26c25．47a20．78b18．48bc25．74a24．73a822．64c17．92d19．83d31．41b37．95ab39．41ab41．24a922．64ab26．45a20．69ab18．57b18．48b27．95a11．39d

3 结论与讨论

研究表明，SOD、POD及CAT与体细胞胚的诱导、分化以及成熟都存在密切关系[43]。POD与能量和呼吸代谢密切相关，在体细胞胚胎发生过程中起着重要的调节作用，许多植物在体胚发生过程中，POD表现出较高活性[44-47]。SOD参与细胞的分裂和分化，对体细胞胚的分化发育起促进作用[48-49]。CAT与细胞分裂、分化及多细胞原胚和球形胚的发育有关。胚性愈伤组织的形成需要大量的蛋白质合成，可溶性蛋白的积累能为胚性愈伤组织的进一步发育提供物质和能量基础[47]。

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张慧君等[51]研究橡胶树体细胞胚发生中抗氧化酶活性的变化时发现，SOD活性值的增加对胚性细胞的分化和发育有一定的促进作用。詹园凤等[32]对大蒜胚性细胞发生的研究表明，在胚性愈伤组织分化时期，SOD的活性会升高，而当其分化为体细胞胚胎后，SOD会达到峰值。由此可以说明，SOD活性值的增加对胚性细胞的分化发育具有一定的促进作用[52-56]。本研究发现在牡丹愈伤组织体胚发生过程中，处理8的SOD在0 d后一直呈上升趋势且于30 d升到峰值，此时正是胚性细胞出现到大量形成的时期，这和崔凯荣[30]的研究一致。

张建瑛等[31]在研究胡桃楸体胚发生过程中指出，高水平的CAT活性对多细胞原胚和球形胚的形成和发育有促进作用。本研究发现，处理8的CAT活性在0～20 d变化较剧烈，20～25 d迅速上升达到最大值，CAT活性的升高能够促进胚性细胞的形成和早期发育，这与张建瑛等[31]的研究结论一致。

小麦的胚性愈伤组织形成后到球形胚一直保持较高的蛋白质水平，而且蛋白质的合成速率明显高于非胚性愈伤组织[57]。在水稻胚性愈伤组织中，水溶性蛋白质含量远远高于非胚性愈伤组织，即使胚性愈伤组织继代10次后，蛋白质含量会有所下降，但仍高于非胚性愈伤组织[58]。在石刁柏的体细胞胚发生中可溶性蛋白在球形胚时期可溶性蛋白质含量最高[47]。本研究中可溶性蛋白的含量也以处理8表现最好，在20～30 d之间保持较高含量，且在30 d有球形胚出现时达到最大值，这与杨和平等[47]的研究相符合。

可见高水平的抗氧化酶类活性和可溶性蛋白含量有利于牡丹‘凤丹白’愈伤组织由非胚性愈伤向胚性愈伤的转变，促进球形胚形成，显著加快胚性愈伤的生长发育速度，POD、SOD、CAT和可溶性蛋白之间彼此作用、相互协调，共同促进体胚的生长发育过程。

这一阶段起始于弹-靶开始接触的瞬间。此时弹体自由表面反射的稀疏波尚未到达弹-靶界面，故此可以认为接触面处于一维应力状态。此阶段的持续时间很短，对于平头弹丸及球形弹丸，大致持续到侵彻深度达到弹径长度为止。在此阶段中，影响靶侵彻深度的主要因素是弹-靶接触面处弹体与靶材料的密度和可压缩性。

因此，本研究认为外源添加NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L对牡丹‘凤丹白’牡丹愈伤组织的诱导效果最佳，显著提高其抗氧化酶类的活性和胚性细胞的诱导水平，促进胚性细胞的形成和发育，为后期体胚发生相关研究提供理论依据和技术支持。

海南省澄迈县福山镇食品药品监督管理所自2014年成立以来，仅有4名工作人员，需监管个体户、餐饮单位和小作坊共544家。尽管如此，该所切实履行监管职责，有效保障了辖区内人民群众的饮食用药安全。

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1.5.1 致死剂量LPS组小鼠生存率及生存时间观察（n=6）给予致死计量LPS打击后，每12 h观测1次，连续观察至处理组小鼠全部死亡，统计小鼠存活率及每组小鼠生存时间。

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1996年，适逢团场机车改制，在很多机车驾驶员犹豫时，孙改会不管不顾，硬是靠东挪西凑的钱，在连队带头把他那辆开惯了的铁牛55拖拉机买了下来。同时，他和妻子承包的棉花地也增加到了100余亩。尽管孙改会领着妻子每天忙得跟个陀螺似地，但一年年不断递增的经济收入让他把想要创业、创新的视野和心胸放得更长、更远。

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透析组sTWEAK与CRP、FIB及WBC均呈显著负相关（P＜0.05），受试者对照组sTWEAK与CRP、FIB、Glu（血糖）呈显著负相关（P＜0.05），见表2。

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本研究发现，愈伤组织在体细胞胚发生过程中，抗氧化酶类活性变化效果不同，但整体均有效缩短了延迟期，其中以添加NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L的处理8效果最好，该处理条件下诱导培养的愈伤组织于第20天开始有胚性细胞形成(图1A)，第25天出现大量胚性细胞(图1B)，第30天有少量早期球形胚形成(图1C)。POD活性在0～20 d变化较剧烈，于20 d达到最大值后略有下降，但仍维持在较高水平，即POD活性在胚性细胞形成初期有所上升，随后缓慢下降，这与王静等[50]的研究结果一致。

从大赛的实施过程可以很明显的看出，大赛不仅为学生提供了一个很好的实践平台，一个展示自我的平台，极大地提高了学生的创新意识、实践能力和团队协作能力[6]。

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Design of Marine Shaft Generator with Combined Magnetic Structure and SVPWM Control

2.2 两组产妇产后出血发生情况比较 观察组产妇产后出血2例(5.00%)，对照组8例(20.00%)发生率显著低于对照组(χ2=11.14，P<0.05)。

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(1)淀粉膜：淀粉膜是将稀碱溶液改性后的淀粉作为基材，然后添加一定量甘油所形成的果蔬保鲜膜，其材料来源广泛，制作技术低下，价格也比较低廉，因此在目前的果蔬保险行业也获得了良好的应用效果。在进行淀粉膜材料的选择过程中，豌豆淀粉膜还具备有更加优越的阻油性，也就能够发挥出更好的果蔬保鲜效果。

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命题2.9 若是伪BCI-代数X的一个犹豫模糊闭滤子，则为X的一个犹豫模糊交换滤子当且仅当对任意x,y ∈ X,

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选取2015年1月～2017年12月吉林市职业病防治院接收的突发性职业中毒患者86例作为研究对象，将其随机分为研究组与对照组，各43例。其中，研究组男25例，女18例，年龄25～59岁，平均年龄（45.2±4.7）岁，中毒类型：三氯乙烯19例，二甲基甲酰胺15例，二氯乙烷9例；对照组男26例，女17例，年龄24～58岁，平均年龄（45.5±4.3）岁，中毒类型：三氯乙烯21例，二甲基甲酰胺14例，二氯乙烷8例。两组患者的性别、年龄及中毒类型等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

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1.4 统计学处理 采用SPPSS 20.0统计软件分析数据，包括Fisher精确概率法、正态检验、独立样本t检验。P＜0.05差异有统计学意义。

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