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新型乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒的临床评价

更新时间:2009-03-28

乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝DNA 病毒,HBV复制过程中易发生核苷酸错误配对,导致同一病毒核苷酸序列的差异,表现为HBV不同的基因型[1]。根据HBV全基因序列异质性大于或等于8%或S区基因序列异质性大于或等于4%,可分为A~I 9种基因型[2]。有研究报道HBV基因型与乙型肝炎的疾病进程、临床表现、预后与抗病毒治疗应答等密切相关[3-5]。目前临床基因分型方法有基因测序法、限制性内切酶长度多态分析法、型特异性引物PCR法、基因芯片法等[6-8]。此类方法操作过程均较繁琐,对实验室条件和人员要求较高,临床普及困难。本研究探讨HBV基因分型检测试剂盒采用荧光免疫技术,基于双抗加心法,操作简便,同时以实时荧光PCR法为对照,对该试剂(以下简称验证试剂)进行临床验证评价,探索一种高效、准确、易于普及的HBV基因型分型方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集解放军302医院临床检验医学中心分子诊断室研究对象的血清333例,50例配对的血清和血浆,―20 ℃冻存。

1.2 仪器与试剂 验证试剂为HBV基因分型检测试剂盒(荧光免疫层析法)(北京万泰,批号BGFC20141204),对应仪器采用RTR-FS100荧光扫描分析仪;对照试剂为HBV基因分型测定试剂盒(荧光PCR法),试剂盒内含HBV B、C质粒阳性质控(上海之江,H20150701);对应仪器采用SLAN荧光定量PCR检测系统及相应软件。基因测序法使用第1代测序方法,均由上海生工公司完成。

1.3 方法

1.3.1 验证试剂 (1)原理:采用荧光免疫技术和双抗体夹心法,硝酸纤维素膜检测区分别包被抗-HBsAg抗体、抗-A型HBV抗体、抗-B型HBV抗体、抗-C型HBV抗体、抗-D型HBV抗体,玻璃纤维垫上包被荧光标记HBsAb。检测时标本HBV与荧光标记抗体结合在毛细作用下沿膜移动,与固定在膜上的包被抗体形成复合物,通过检测仪定性分析基因型。(2)操作:取80 μL血清或血浆标本置入试剂加样区,20 min后荧光扫描分析仪读取分型结果。

1.3.2 对照试剂操作 提取核酸-配制试剂-加样-PCR扩增;循环参数设置:37 ℃ 2 min,94 ℃ 2 min,再按94 ℃ 10 s,62 ℃ 40 s,循环40次,单点荧光检测为62 ℃,反应体系为40 μL,荧光通道检测选择FAM通道。

1.4 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行数据分析,计算验证试剂与对照试剂检测结果的符合率及其95%CI,并计算Kappa值分析结果的一致性。

2

2.1 2种方法检测A基因型结果 A基因型血清标本验证试剂检出15例,对照方法检出12例,2种方法的符合率为15/12。B基因型血清标本验证试剂与对照试剂结果的阳性符合率为98.00%,阴性符合率为99.06%,总符合率98.91%。95%CI:97.24%~99.70%,Kappa值为0.954,一致性最强。C基因型血清标本验证试剂与对照试剂结果的阳性符合率为98.78%,阴性符合率为86.99%,总符合率94.84%。95%CI:92.05%~96.86%、Kappa值为0.881,一致性最强。D基因型血清标本验证试剂与对照试剂结果的阳性符合率为87.50%,阴性符合率为100.00%,总符合率99.73%。95%CI:98.50%~99.99%,Kappa值为0.932,一致性最强。见表1~3。

2.2 2种方法不一致标本的第3方检测结果 验证试剂与对照试剂有28例血清标本HBV 基因型检测结果不一致,采用第3方基因序列检测方法进行验证,其结果与验证试剂一致标本17例,不一致11例。见表4。

2.3 验证试剂对相同血清和血浆标本的检测结果 验证试剂对同一例血清、血浆标本检测B基因型结果的阳性符合率为100.00%,阴性符合率为100.00%,总符合率100.00%,95%CI:92.89%~100.00%,Kappa值为1.000,一致性最强。验证试剂对同一例血清、血浆标本检测C基因型结果的阳性符合率为100.00%,阴性符合率为100.00%,总符合率100.00%,95%CI:92.89%~100.00%,Kappa值为1.000,一致性最强。见表5、6。

 

1 2种方法检测B基因型血清标本的结果比较(n)

  

检测方法血清对照试剂阳性(+)阴性(―)合计验证试剂阳性(+)49352阴性(―)1315316合计50318368

 

2 2种方法检测C基因型血清标本的结果比较(n)

  

检测方法血清对照试剂阳性(+)阴性(―)合计验证试剂阳性(+)24216258阴性(―)3107110合计245123368

 

3 2种方法检测D基因型血清标本的结果比较(n)

  

检测方法血清对照试剂阳性(+)阴性(―)合计验证试剂阳性(+)707阴性(―)1360361合计8360368

 

4 2种方法的不一致标本第3方检测结果比较

  

序号临床诊断对照试剂初检结果复检结果验证试剂初检结果复检结果第3方检测第3方与验证试剂的一致性105HBV(+)未检出未检出CCC一致171HBV(+)CC未检出未检出PCR扩增(―)一致190HBV(+)未检出未检出CCC一致191HBV(+)未检出未检出CCC一致196HBV(+)B+CB+CBBB一致201HBV(+)未检出未检出CCC一致210HBV(+)未检出未检出BBPCR扩增(―)不一致244HBV(+)未检出未检出CCC一致262HBV(+)CC未检出未检出C不一致269HBV(+)未检出未检出CCPCR扩增(―)不一致271HBV(+)未检出未检出CCC一致282HBV(+)未检出未检出CCPCR扩增(―)不一致295HBV(+)未检出未检出CCC一致303HBV(+)未检出未检出CCPCR扩增(―)不一致314HBV(+)未检出未检出CCC一致315HBV(+)未检出未检出CCC一致321HBV(+)未检出未检出CCC一致368HBV(+)DDCCD/C重组不一致376HBV(+)未检出未检出BBB一致385HBV(+)未检出未检出CCPCR扩增(―)不一致397HBV(+)未检出未检出CCD/C重组不一致407HBV(+)CC未检出未检出C不一致408HBV(+)CB未检出未检出PCR扩增(―)一致104HBV(+)未检出未检出未检出未检出B不一致247HBV(+)未检出未检出未检出未检出C不一致353HBV(+)未检出未检出未检出未检出PCR扩增(―)一致399HBV(+)未检出未检出未检出未检出PCR扩增(―)一致403HBV(+)未检出未检出未检出未检出PCR扩增(―)一致

 

5 验证试剂检测相同血清血浆B基因型标本的结果比较(n)

  

检测类型血清对照试剂阳性(+)阴性(―)合计血浆阳性(+)505阴性(―)04545合计54550

 

6 验证试剂检测相同血清血浆C基因型标本的结果比较(n)

  

检测类型血清对照试剂阳性(+)阴性(―)合计血浆阳性(+)44044阴性(―)066合计44650

3

目前普遍认为基因型C型引起的炎性坏死及纤维化程度比B型更严重,HBV e抗原阳性率更高,平均年龄高于B型,且C型与肝硬化、肝癌有关;基因型B型的累积生存率明显高于C型,基因型D型易在年轻患者中发生原发性肝细胞癌,F型比A、D型更易引起与肝脏疾病相关的病死率[9-11]。因此,临床开展HBV 基因分型检测对患者十分必要,但目前分型方法实验条件较高且难以普及,寻找一种高效、准确、简便的HBV基因型分析方法对基层临床实验室至关重要。

③Guba,E.G.,& Lincoln,Y.S.,Effective evaluation,JOSSEYBASS,1982.

国家食品药品监督局注册的HBV基因分型检测试剂盒共有7个生产厂家,主要以PCR产品、测序法、反向点杂交为主,且主要检测B、C基因型,仅有上海之江和厦门泰普的产品可以检测B、C、D基因型,未有可同时检测A、B、C、D基因型的上市批准产品。血清学方法检测基因分型是以抗原抗体反应为基础,具有经济、易操作、高通量等优点。有研究报道,PCR检测技术分型的阴性患者35%可使用血清学分型技术检测,血清学分型要优于PCR技术。本研究结果表明,18例患者使用PCR技术无法分型,但采用血清学方法能够分型。也有研究显示,血清学分不出型别的标本比例高达23.4%。本研究有9例患者无法分型,

本研究试剂盒以抗原抗体反应为基础,采用荧光免疫技术和双抗体夹心法,在硝酸纤维素膜检测区分别包被抗-HBV表面抗原抗体、抗-A型HBV抗体、抗-B型HBV抗体、抗-C型HBV抗体、抗-D型HBV抗体,玻璃纤维垫上包被荧光标记的HBV表面抗体。检测时标本置入试剂加样区,标本中的HBV与荧光标记抗体结合,在毛细作用力下沿膜移动,与固定在膜上的包被抗体形成复合物,通过荧光扫描分析仪定性分析HBV基因型。

本研究以测序法作为参比方法,验证万泰新试剂对A基因型的检出性能,且验证试剂和对照试剂(B、C、D基因型)对血清标本中HBV基因分型的试验结果之间具有较好的符合程度,临床应用中两者具有等效性。383例标本中,有28例检测结果不一致,但以参比方法为准,28例标本有17例与参比方法一致,另外11例标本有2例是混合感染导致结果不一致。相对于对照方法所需的较高试验条件、熟练操作人员、复杂操作步骤等,验证试剂方法具有操作简便、检测时间短、灵敏度高等优点,且验证试剂对血清与血浆的检测能力具有一致性。

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综上所述,HBV基因分型检测(免疫荧光法)试剂盒能满足国内医疗机构临床HBV基因分型的检测需求,便于及时报告结果,辅助临床诊断,尤其可在基层医疗卫生机构普及使用。

参考文献

[1]苏荣,罗娜,杨彦斌,等.HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者乙肝病毒基因变异和分型研究[J].南方医科大学学报,2012,32(12):1804-1807.

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刘立明,赵晓茹,夏利芳,王童,刘亚楠,任君,郭桐生
《检验医学与临床》 2018年第10期
《检验医学与临床》2018年第10期文献

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