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TGF-β1介导的Smad通路在肾脏纤维化中的作用及机制

更新时间:2009-03-28

随着人们生活方式的改变,慢性肾脏病(chronic kidneydisease,CKD)已经成为威胁人类公共健康的主要疾病之一。肾小管间质纤维化是慢性肾脏疾病进行性发展的关键因素,细胞炎症介质释放、氧化应激等也参与了其病理过程〔1〕。肾小管上皮细胞间充质转化(epithelial myofibroblast transdifferentiation,EMT)是肾小管上皮细胞失去上皮细胞表型,细胞间连接消失,细胞骨架重新构建,细胞迁移及浸润能力增强,转化为间质细胞的过程〔2〕。转化生长因子β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)是促进肾脏纤维化的关键因子,Smad蛋白是其TGF-β家族下游重要的信号转导蛋白,多项研究表明TGF-β1/Smad通路在肾脏纤维化的过程中起到关键性的作用〔3〕,本研究进一步验证TGF-β1/Smad通路在肾脏纤维化中的作用及机制,从而预测相应的靶基因,为延缓或防止肾脏纤维化提供新的治疗方案。

1 材料与方法

1.1 材料 人肾脏近曲小管上皮细胞HK-2(美国ATCC公司),胎牛血清(FBS,杭州四季青生物工程材料有限公司),DMEM/F12培养基(Gibco公司),从Peprotech公司购买TGF-β1、α-SMA、E-cadherin、Smad 2、p-Smad 2、Smad 3、p-Smad 3等。

1.2 细胞培养及分组 HK-2细胞于含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基中,并置于37 ℃、 5% CO2 条件下使其贴壁培养。细胞融合至80%~90%时,用0.25%胰酶消化。分组:(1)HK-2组;(2)HK-2+TGF-β1(5 ng/ml)组;(3)HK-2+TGF-β1(10 ng/ml)组;(4)HK-2+TGF-β1(15 ng/ml)组。

1.3 Western Blot检测各组蛋白表达量 各组分别取30 μg蛋白,进行凝胶电泳(SDS-PAGE)直至蛋白电泳至槽的下端,将蛋白电转移至0.22 μm的PVDF膜上。5%的牛奶封闭(4 ℃,2 h),分别用一抗α-SMA(1∶500)、E-cadherin(1∶500)、Smad 2(1∶500)、p-Smad 2(1∶500) 、p-Smad 3(1∶500)、Smad 3(1∶500)、GAPDH(1∶1000)孵育(4 ℃,过夜),洗膜(10 min,3次)后,以1∶10 000稀释的二抗室温孵育2 h,再次洗膜(10 min,3次)。ECL底物化学发光(Multi Sciences)显色后,用Tanon Gis软件进行分析。

1.4 细胞免疫荧光 HK2细胞制成均匀细胞悬液,接种于放置有玻片的6孔板中,每孔约3 ml 细胞悬液。37 ℃孵育24 h,待细胞接近60%~70%汇合,PBS洗3次。4%多聚甲醛固定30 min(室温),血清封闭液,37 ℃,60 min。一抗4 ℃过夜。滴加0.01 M PBS 1∶100 稀释的生物素化二抗,37 ℃,60 min。滴加0.01M PBS 1∶100 稀释的SABC-FITC,30 min,PBS洗3遍,将玻片移至载玻片上,加入抗荧光淬灭剂,甘油封片,荧光显微镜观察。

1.5 RT-PCR 收集HK-2细胞后,加入 Trizol 试剂( Invitrogen,美国) 裂解细胞,提取RNA,后采用 Takara 逆转录试剂盒对总RNA 进行逆转录。得到的 cDNA 进行常规 PCR 反应,从而检测目的基因的表达水平。

1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件处理及分析数据,组间比较采用两独立样本的t检验,P<0.05表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度TGF-β1诱导肾脏纤维化模型

2.1.1 光镜下细胞形态学改变 以不同浓度(5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml)的 TGF-β1分别刺激HK-2细胞,可见诱导48 h后,随浓度增加HK-2细胞的正常铺路石样形态消失,呈成纤维细胞形态改变,即细胞排列不规则、长梭形改变,5 ng/ml时细胞形态变化不大,10 ng/ml时细胞纤维化形态较明显,15 ng/ml时细胞凋亡现象明显(图1)。

2.1.2 Western blot检测TGF-β1诱导HK-2时的α-SMA、E-cadherin蛋白水平变化 Western blot结果显示:随着TGF-β1浓度的增加,α-SMA的蛋白表达量相较对照组增加,E-cadherin的表达量减少,差异有统计学意义(P<0.05),TGF-β1浓度为15 ng/ml时细胞凋亡较多,因此α-SMA、E-cadherin蛋白表达量相较前组变化不大(图2)。

 

1 不同浓度的TGF-β1刺激肾小管上皮细胞后的形态学改变

  

2 不同浓度TGF-β1刺激HK-2细胞后的蛋白表达情况与无TGF-β1刺激组比较:*P<0.05,**P<0.01

2.1.3 细胞免疫荧光检测TGF-β1诱导HK-2时的α-SMA、E-cadherin蛋白水平变化 细胞免疫荧光结果显示:TGF-β1刺激HK-2细胞,相较其它组,10 ng/ml时细胞α-SMA的蛋白表达量(红色荧光)相对较多、E-cadherin的蛋白表达量(绿色荧光)相对较少(图3)。且与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 TGF-β1诱导肾脏纤维化的机制 Western blot检测smad通路的相关蛋白表达水平,结果显示:HK-2组低表达p-smad2/3;TGF-β1刺激后,p-smad2/3表达量增加,且有统计学意义(P<0.05)(图4)。对于TGF-β1诱导的纤维化模型组,Zeb1、snail高表达,且具有统计学意义(P<0.05)(图5-A),并且纤维化模型组中,miR-200c的表达量降低(图5-B)。

 

3 不同浓度TGF-β1刺激HK-2细胞后的细胞免疫荧光检测结果与无TGF-β1刺激组比较:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.000

  

4 不同浓度TGF-β1刺激HK-2细胞后的Western Blot结果与无TGF-β1刺激组比较:*P<0.05,**P<0.01

 

5 TGF-β1诱导HK-2细胞后的Western BlotRT-PCR结果与无TGF-β1刺激组比较:*P<0.05,***P<0.000

3 讨论

肾脏纤维化是慢性肾脏病患者最主要的病理特征,表现为细胞外基质的大量沉积,炎症细胞浸润,成纤维细胞增生,导致肾间质的纤维化及肾小球硬化。其中上皮细胞间充质转化( EMT)即血管内皮细胞向肌成纤维细胞的转分化是导致肾纤脏维化发生的重要因素〔4〕,近年来发现TGF-β1/Smad信号通路可介导 EMT的发生,从而促进肾脏纤维化的发展。

转化生长因子-β1(TGF-β1)作为TGF-β超家族的一员,是一种具有多项调节功能的纤维形成生长因子,几乎可在体内所有细胞内合成,在EMT过程中起到关键性作用。有研究表明,TGF-β可引起miRNA和DNA甲基转移酶的表观遗传学异常,从而抑制Klotho并增强肾纤维化〔5〕。又有研究表明,TGF-β1诱导肾脏EMT,而miR-200b可以逆转肾脏纤维化的进展〔6〕。我们课题组前期的实验表明,骨髓间充质干细胞(MSC)及其分泌的微泡(MV)可延缓TGF-β1诱导的肾脏纤维化,α-SMA在mRNA和蛋白水平表达量降低,E-cadherin在mRNA和蛋白水平表达量增加〔7-8〕

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Smads是TGF-β家族的下游信号转导蛋白,可以将TGF-β信号介导的相关蛋白由细胞膜直接转导到核内,活化的Smad2、Smad3与Smad4形成三聚体,进入细胞核内,促进转分化相关基因高表达,从而引起细胞组织纤维化。Dalia等〔9〕在研究米氮平抑制5-HT引起的肝脏纤维化过程中发现,p-Smad3表达量下降,说明米氮平可以抑制TGF-β介导的smad通路在肝脏纤维化中的作用。另有研究表明,在体外,Smad2 和Smad3受较多致纤维化因子的影响,通过基因敲除Smad3后,可以抑制小鼠和细胞的纤维化进展〔10〕。此外,Li等〔11〕在研究TGF-β1诱导的肾脏纤维化模型中,Smad信号通路起到关键性的作用,p-Smad2表达增加,Smad7蛋白表达降低,并且过表达Smad7可以抑制TGF-β信号的传导,主要是由于其竞争性的与TβRⅠ结合,降解活化的 TβRⅠ,从而反馈性抑制Smad2/3的磷酸化。这表明TGF-β1/Smad信号通路在肾间质纤维化的发生发展中起到关键作用,我们的研究再次证实了在TGF-β1介导下肾小管上皮细胞通过Smad通路诱导肾脏纤维化,与以往的研究相符。

转录因子snail是一种含有锌指结构的DNA结合蛋白,能诱导上皮细胞间质转分化,其激活后进入细胞核与E-钙黏蛋白启动子中特异性的DNA序列结合,使E-钙黏蛋白的转录受到抑制,其蛋白表达下降,最终导致上皮细胞转分化〔12〕。ZEB家族也属于锌指蛋白类,过表达Zeb1能够下调上皮细胞连接蛋白、E-钙黏蛋白的表达。有研究表明,Zeb1和Zeb2通过与E-cadherin 基因启动子上游的序列特异性结合,从而抑制E-cadherin表达,导致上皮细胞向间质细胞表型转化,即发生EMT的现象〔13〕。另有多项研究表明,miR-200家族可以通过下调ZEB的表达进而抑制肿瘤细胞EMT的进展〔14-15〕。目前,最新研究表明,miR-200可以通过抑制锌指蛋白转录子snail1来促进细胞维持上皮表型,抑制EMT进程〔16〕。本研究中,TGF-β1诱导的肾脏细胞纤维化的模型中,snail、Zeb1的蛋白表达较对照组升高,促进上皮间充质转分化的发生,miR-200c的表达量降低,由此我们推测过表达miR-200c可能在延缓肾脏纤维化的进程中起到一定的作用,此方面的研究相对较少,我们课题组还在进一步的研究中。

本研究明确了TGF-β1诱导肾脏纤维化,并探讨其相关机制,适宜浓度的TGF-β1可以诱导肾脏细胞纤维化,主要是由于激活Smad通路及其下游相关蛋白的表达增加,但仍需要深入研究,以便为临床上延缓肾脏纤维化提供更加明确的理论依据。

参考文献

〔1〕 CORESH J,SELVIN E,STEVENS L A,et al.Prevalence of chronic kidney disease in the United States〔J〕.JAMA,2007,298(17):2038.

〔2〕 MUNOZ-FELIX J M,GONZALEZ-NUNEZ M,MARTINEZ-SALGADO C,et al. TGF-beta/BMP proteins as therapeutic targets in renal fibrosis. Where have we arrived after 25 years of trials and tribulations?〔J〕.Pharmacol Ther,2015,156:44.

〔3〕 WANG L Y,DIAO Z L,ZHENG J F,et al.Apelin attenuates TGF-beta1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-epsilon in human renal tubular epithelial cells〔J〕.Peptides,2017,96:44.

〔4〕 TOGEL F,ZHANG P,HU Z,et al.VEGF is a mediator of the renoprotective effects of multipotent marrow stromal cells in acute kidney injury〔J〕.J Cell Mol Med,2009,13(8B):2109.

〔5〕 YIN S,ZHANG Q,YANG J,et al.TGFbeta-incurred epigenetic aberrations of miRNA and DNA methyltransferase suppress Klotho and potentiate renal fibrosis〔J〕. Biochim Biophys Acta,2017,1864(7):1207.

〔6〕 TANG O,CHEN X M,SHEN S,et al.MiRNA-200b represses transforming growth factor-beta1-induced EMT and fibronectin expression in kidney proximal tubular cells〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2013,304(10):F1266.

〔7〕 HE J,WANG Y,SUN S,et al.Bone marrow stem cells-derived microvesicles protect against renal injury in the mouse remnant kidney model〔J〕.Nephrology (Carlton),2012,17(5):493.

〔8〕 WANG Y,LU X,HE J,et al.Influence of erythropoietin on microvesicles derived from mesenchymal stem cells protecting renal function of chronic kidney disease〔J〕.Stem Cell Res Ther,2015,6:100.

〔9〕 EL-TANBOULY D M,WADIE W,SAYED R H.Modulation of TGF-beta/Smad and ERK signaling pathways mediates the anti-fibrotic effect of mirtazapine in mice〔J〕.Toxicol Appl Pharmacol,2017,329:224.

〔10〕 LAN H Y,CHUNG A C.Transforming growth factor-beta and Smads〔J〕.Contrib Nephrol,2011,170:75.

〔11〕 LI J H,ZHU H J,HUANG X R,et al.Smad7 inhibits fibrotic effect of TGF-Beta on renal tubular epithelial cells by blocking Smad2 activation〔J〕.J Am Soc Nephrol,2002,13(6):1464.

〔12〕 HAN W Q,ZHU Q,HU J,et al.Hypoxia-inducible factor prolyl-hydroxylase-2 mediates transforming growth factor beta 1-induced epithelial-mesenchymal transition in renal tubular cells〔J〕.Biochim Biophys Acta,2013,1833(6):1454.

〔13〕 OCANA O H,NIETO M A.A new regulatory loop in cancer-cell invasion〔J〕.EMBO Rep,2008,9(6):521.

〔14〕 KORPAL M,LEE E S,HU G,et al.The miR-200 family inhibits epithelial-mesenchymal transition and cancer cell migration by direct targeting of E-cadherin transcriptional repressors ZEB1 and ZEB2〔J〕.J Biol Chem, 2008,283(22):14910.

〔15〕 WELLNER U,SCHUBERT J,BURK U C,et al.The EMT-activator ZEB1 promotes tumorigenicity by repressing stemness-inhibiting microRNAs〔J〕.Nat Cell Biol, 2009,11(12):1487.

〔16〕 PERDIGAO-HENRIQUES R,PETROCCA F,ALTSCHULER G,et al.miR-200 promotes the mesenchymal to epithelial transition by suppressing multiple members of the Zeb2 and Snail1 transcriptional repressor complexes〔J〕.Oncogene, 2016,35(2):158.

 
赵亚亚,钟成,李悦,宋伟伟,赵卫红
《解放军预防医学杂志》2018年第04期文献

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