牙周炎是由菌斑微生物引起的齿龈及牙周组织慢性炎症，主要特征为牙周袋形成及袋壁的炎症，破坏牙槽骨吸收，导致牙齿出现松动倾向〔1〕。人参皂甙Rg-1在消炎、活血化瘀、免疫调节等多方面具有显著效果，还可有效促进牙周组织修复和重建〔2〕。笔者团队前期已在牙周炎大鼠模型中证实人参皂甙Rg-1可通过下调牙周组织中IL-6水平减缓炎性反应，抑制骨吸收并促进牙槽骨修复〔3-5〕。糖尿病并发症较多，而牙周炎作为其第6大并发症越来越得到该领域专家的重视。大量研究证实，糖尿病与牙周病之间的关系是相互的，即引起牙周病发生的危险因素之一是糖尿病，而牙周炎作为一种慢性炎性反应还可负面调控糖尿病代谢〔6〕。本研究中，笔者团队通过牙周局部结扎联合高糖喂养构建糖尿病牙周炎模型大鼠，深入研究人参皂甙Rg-1在糖尿病牙周炎大鼠模型中的疗效及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 人参皂甙Rg-1单体(芜湖甙尔塔医药科技有限公司，纯度>98%)；白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β)、前列腺素E2(prostaglandinE-2，PGE-2)一抗、ABC显色试剂盒(武汉博士德公司)、SABC即用型免疫组化试剂盒；100 g/L EDTA脱钙液(兰州大学口腔医学院病理室)；40 g/L多聚甲醛-0.1 mol/L PBS固定液；组织切片机、电热恒温孵箱(上海医疗器械)。

1.2 实验动物分组 Wistar 大鼠100只，体质量为160～200 g，雌雄各半，按照随机数字表法将其分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J共10组。A组为未经任何处理的正常对照组；B-D组为人参皂甙Rg-1治疗组；E-G组为甲硝唑治疗组；H-J组为糖尿病牙周炎对照组。动物分笼饲养，自由摄食摄水。

1.3 糖尿病牙周炎大鼠造模 B-J组大鼠给予高脂高糖饲料喂养8周，禁食18 h后大鼠腹腔一次性注射浓度25 mg/kg链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)，检测大鼠随机血糖浓度在16.7 mmol/L以上并维持1周后(继续给予高脂高糖饲料喂养)，腹腔注射氯胺酮全麻成功后，采用口腔正畸结扎钢丝(直径0.2 mm)在大鼠上颌第二磨牙颈部结扎，要求钢丝进入龈沟，6～8周后处死。

1.4 药物干预 B-D组大鼠每日一次腹腔注射5 mg/100 g人参皂甙Rg1，E-G组大鼠每日一次腹腔注射5 mg/100 g甲硝唑，I-J组大鼠注射同等剂量生理盐水。

1.5 实验动物的处理和取材 (1)处死方式：颈动脉放血法，迅速剪取包括右上颌骨、牙槽骨、牙及牙周组织在内的新鲜完整组织块，生理盐水洗涤后以多聚甲醛固定。接着加入100 g/L EDTA微波加热2周脱钙，制作上颌第二磨牙颊舌向水平石蜡切片，切片厚度为5μm。(2)处死时间：将H组大鼠在造模成功后与A组同时处死；B-D组于注射人参皂甙Rg1后分别在第1、2、3周处死；E-G组于注射甲硝唑后分别在第1、2、3周处死；I-J组于注射生理盐水后分别在第1、2周处死。

1.6 观察指标 (1)大鼠日常活动能力、食欲、被毛及粪便情况；(2)牙周炎及齿龈情况；(3)患牙牙槽骨吸收情况；(4)牙槽骨吸收及牙周袋形成情况；(5)采用免疫组织化学法检测大鼠患牙牙周组织切片细胞因子水平变化；(6)采集大鼠尾静脉血，监测血糖水平变化。

1.7 指标检测 (1)空腹血糖：注射STZ前后每周清晨于各组大鼠空腹状态下采尾血以检测血糖水平；(2)免疫组织化学染色：制作大鼠上颌第2磨牙颊舌向水平石蜡切片，行常规HE染色，观察牙周组织病理变化状况，并采用免疫组织化学法检测白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、前列腺素E2(prostaglandin E-2，PGE-2)水平变化。

1.8 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件对本研究数据进行分析处理，计量资料以均数±标准差表示，三个亚组或以上的组间比较采用单因素方差分析。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般观察 A组表现正常。造模后：B-J组被毛稀疏，体质量减轻，拱背蜷曲，活动较之前少，表现出倦怠现象；I-J组随时间延长症状加重，但B-D组以上症状明显减轻，活动能力和平时一样，毛色表现光亮，体质量逐渐恢复至造模前；E-G组以上症状也得到缓解，但与B-D组比较程度不大；在实验过程中I-J组死亡5只，B-D组死亡2只，其余至实验结束均存活。

2.2 口腔组织 A组口腔牙周组织状态正常。造模后，I-J组在所结扎牙的牙颈部有很多食物残渣菌斑堆积，齿龈组织出现红肿现象，轻触则易出血，同时组织糜烂溢脓，大量炎性细胞发生浸润，从牙面分离并结合上皮迁移至根方，从而形成牙周袋，牙槽骨吸收呈现陷窝状；B-D组以上症状得到明显改善，炎性细胞显著减少，较造模后牙周袋也变浅，吸收的牙槽骨也出现一定程度的新生。E-G组以上症状出现一定好转，较I-J组炎性细胞数目有所减少，牙周袋也变浅，但较B-D组吸收的牙槽骨无明显变化。

2.3 血糖变化 注射STZ后1周，糖尿病牙周炎组大鼠均达到糖尿病模型标准(血糖超16.7 mmol/L)，平均为(25.32±2.38)mmol/L。一直到实验结束后，糖尿病牙周炎组大鼠血糖始终保持在这一水平之上，提示糖尿病大鼠造模成功。见表1。

2.4 炎性因子水平 免疫组化结果显示细胞质IL-6阳性，呈棕黄色，采用平均吸光度值进行图象分析，免疫组化染色信号越强，平均吸光度值越高，呈正相关。B-D组和E-G组牙周组织中IL-1β、IL-6、PGE-2水平均显著低于I-J组(P<0.05)，同时B-J组各指标显著高于A组(P<0.05)，见表2。

 

表1 各组大鼠血糖变化情况

  

组别0周1周2周3周正常对照组(A组)5.76±1.125.52±0.395.41±0.525.96±0.41糖尿病牙周炎对照组(B-J组)5.30±0.5425.32±2.38∗26.61±4.30∗27.82±4.29∗

与正常对照组比较：*P<0.05

 

表2 各组大鼠牙周组织中IL-1β、IL-6、PGE-2的含量

  

组别只数IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)PGE-2(ng/ml)空白对照组10 A组(0周)26.87±0.39144.35±0.8233.2±17.3人参皂甙Rg-1治疗组30 B组(1周)38.65±1.21∗#△326.27±1.58∗#△79.2±13.6∗#△ C组(2周)32.09±1.34∗#△280.23±1.46∗#△60.3±16.7∗#△ D组(3周)25.74±1.53∗#△186.47±1.38∗#△42.6±14.2∗#△甲硝唑治疗组30 E组(1周)60.24±1.34∗#402.41±1.70∗#87.8±15.8∗# F组(2周)58.33±1.06∗#323.32±1.76∗#79.2±16.4∗# G组(3周)42.45±1.53∗#265.15±1.82∗#65.6±17.3∗#糖尿病牙周炎对照组20 I组(1周)89.36±1.60395.29±0.7598.2±16.7 J组(2周)89.54±1.53394.58±1.4298.6±17.5

与A组比较：*P<0.05；与I-J组比较：#P<0.05；与E-G组比较：△P<0.05

3 讨论

牙周炎是指在致病菌及宿主免疫反应紊乱的情况下导致的感染性疾病，严重影响患者的身心健康及生活质量〔1〕。糖尿病可使牙周炎的发病风险及严重程度增加，进而导致牙周炎骨丧失。然而，对于糖尿病加重牙周炎骨丧失的机制目前尚未完全明确。本实验通过将机体全身和局部因素结合起来，建立一个近似人类临床牙周炎的动物模型，同时应用免疫化学、组织化学等技术初步研究糖尿病加重牙周炎骨丧失的细胞学机制。

本研究观察了在局部刺激因素下糖尿病大鼠牙周组织的改变，与非糖尿病牙周炎大鼠相比，糖尿病牙周炎大鼠牙周组织被严重破坏，且破坏进展速度快。继而证实当合并有糖尿病这一全身疾病时牙周组织在局部因素作用下，破坏程度严重，破坏进展速度快,这与相关研究结果相符〔7-8〕。以上结果表明，糖尿病对牙周组织的破坏具有促进作用。另外，目前普遍认为，牙周组织破坏的主要原因是宿主对致病菌及其产物过度的炎性和免疫反应所造成的间接损伤〔9-11〕。牙周组织细胞在细菌内毒素激发下能产生如IL-1、IL-6、PGE-2等在内的致炎细胞因子和炎性化学介质，从而引起组织的炎性反应，主要表现为牙周袋形成及牙槽骨吸收〔12〕。

In figure 5， we can notice that changing the length L from 2.5 mm by 0.1 mm in each steps will change the position of the resonant. So from this parameters， we can control the position of the band．

人参皂甙 Rg-1可清除体内自由基，从而发挥抗脂质过氧化作用，另外，其还可调节内分泌与免疫，平衡机体新陈代谢等〔3〕。目前，根据临床及基础实验推测，Rg-1治疗牙周病的机制可能是：首先由于人参皂甙 Rg-1可能与减少谷胱甘肽浓度和降低超氧化物歧化酶活力，抗氧化应激有关，从而其具有抗炎性反应作用；其次人参皂甙 Rg-1可改变各种免疫功能低下，具有免疫调节作用〔9〕。研究表明，部分外源促肾上腺皮质激素引起的肾上腺肥大可被Rg-1抵消，导致皮质酮分泌增加，从而恢复NK细胞及T细胞活性〔3〕。本研究结果表明，糖尿病牙周炎组大鼠牙周组织中炎性因子(包括IL-1β、IL-6、PGE-2)表达水平均显著高于未经任何处理的正常对照组，提示造模成功；治疗第1周起，与糖尿病牙周炎对照组比较，人参皂甙 Rg-1治疗组和甲硝唑治疗组牙周组织中的IL-1β、IL-6、PGE-2水平均降低显著，提示治疗有效；但人参皂甙 Rg-1治疗组的效果优于甲硝唑治疗组。以上结果提示，采用人参皂甙 Rg-1治疗糖尿病牙周炎大鼠模型后，其牙周炎程度发生明显好转，结合以上结果推测，人参皂甙 Rg-1具有如抗炎、免疫调节及改善内分泌等诸多良好作用，还对炎性细胞因子在牙周炎过程中的表达起到抑制作用，减慢炎性反应进程，促进牙槽骨修复的同时抑制其吸收。

显效:无出现恶心、牵拉疼痛、低血压等并发症,肌松良好、术野显露好,生命体征循环指标麻醉前后稳定;有效:生命体征循环指标麻醉前后有一定波动,肌松较好,牵拉疼痛不明显;无效:生命体征循环指标麻醉前后明显波动。老年人腹部手术麻醉效果为显效、有效百分率之和[3]。

总之，人参皂甙 Rg1可降低糖尿病牙周炎大鼠牙周组织中的炎性细胞因子水平，改善大鼠的血糖状态，减轻牙周组织的炎症程度并改善其全身状况，为人参皂甙 Rg-1治疗糖尿病牙周炎的科学性及临床实用性提供了一定的依据。

参考文献：

〔1〕 TOMINARI T,HIRATA M,MATSUMOTO C,et al.Polymethoxy flavonoids, nobiletin and tangeretin, prevent lipopolysaccharide-induced inflammatory bone loss in an experimental model for periodontitis〔J〕.J Pharmacol Sci,2012,119(4):390.

〔2〕 安英龙.三七治疗牙周病的临床疗效观察〔J〕.现代中西医结合杂志,2007,16(18):2512.

〔3〕 杨倩,余占海,杜建东,等.人参皂甙Rg-1对大鼠牙周组织中白介素6、骨钙素水平的影响〔J〕.实用口腔医学杂志,2009,25(1):22.

〔4〕 杨倩.人参皂甙Rg1对人牙周膜细胞生物学活性及大鼠牙周组织相关细胞因子表达的影响〔D〕.兰州大学,2009.

〔5〕 赵玮,余占海,李秀兰,等.人参皂甙Rg-1对牙周炎大鼠牙周组织中TNF-α、IL-1β表达的影响〔J〕.口腔医学研究,2009,25(5):548.

〔6〕 杜娟,李淑娟,武明轩,等.超声龈下刮治同步药物冲洗对慢性牙周炎患者龈沟液中前列腺素E2水平影响的研究〔J〕.中国实用口腔科杂志,2010,3(6):348.

〔7〕 张勤,叶再元,杜卫东.人参皂甙对腹腔感染大鼠血清白蛋白及白介素-6影响的实验研究〔J〕.浙江中医学院学报,2003,27(4):66.

〔8〕 黄辉，黄炫赓，于大海，等.二甲双胍对实验性糖尿病牙周炎大鼠IL-1 IL-6 TNF-a的影响〔J〕.现代医药卫生，2018,34(3):358.

〔9〕 李晓峰,郭丽云,张孝华,等.六味地黄丸对糖尿病伴牙周炎大鼠牙周组织中OPG与RANKL的影响〔J〕.世界中西医结合杂志,2014,9(4)：354.

〔10〕 黄辉.罗格列酮对糖尿病牙周炎大鼠炎症反应的影响研究〔J〕.中国全科医学,2014,17(6):645.