更全的杂志信息网

黑龙江黑河口岸鼠类及蜱类携带巴尔通体的调查

更新时间:2009-03-28

黑河口岸是黑龙江对俄口岸中客运量最大口 岸之一,举足轻重的客运大口岸地位,决定了口岸稳定安全的公共卫生环境对其的重要性,巴尔通体具有传播广泛、感染迅速、致病性强等特点,通过家畜及宠物既可传染给人类,长期以来地方卫生检疫的盲点导致相关疾病的蔓延,对口岸卫生安全构成潜在的威胁,本研究对中俄边境黑河口岸地区的蜱类、鼠类进行本底调查,对该地区的蜱类、鼠类所携带的巴尔通体(Bartonella)进行监测及检测,目的在于明确中俄黑河口岸地区蜱及鼠类种群状况及其携带的病原体本底情况,该研究对于及时快速监测中俄边境口岸地区的蜱媒、鼠媒携带巴尔通体具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 蜱类样本采集

2012年至2013年每年4月16日至10月8日期间,每个月分别在上旬及下旬进行两次蜱虫采集,每次3人,采集1小时,采用布旗法(表1)进行蜱类采集,采集到的蜱类进行种属鉴定;鉴定后的蜱类进行病原体检测。

2.1.2 鼠类样本采集

然后利用软件Design-Expert 8.0对方程模型进行分析,得到的最佳参数条件为A=0.015 mg/g,B=0.008 mg/g,C=0.007 mg/g,即甘露聚糖酶为0.015 mg/g、β-葡聚糖酶为0.008 mg/g及木聚糖酶为0.007 mg/g的添加水平,在此条件下,预测酶解液还原糖含量121.68 mg/g。在此条件下进行3次重复实验,得到还原糖含量为120.43 mg,与理论值的误差为1.03%,表明所得模型能反映出各因素对还原糖的影响。

PCR 反应体系 50 μl,模板 DNA 加 5 μl,10 μmol/L 引物 1 μl,Premix Taq (TAKARA) 25 μl,加去离子水至50 μl,扩增枸橼酸合酶基因 (gltA)的379 bp片段以证实是否巴尔通体,反应用文献中所用引物[2]上游引物为 BhCS.781n 5′-GGG GAC CAG CTC ATG GTG G-3′, 下游引物为 BhCS.1137n 5′-AAT GCA AAAAGA ACA GTA AAC A-3′。 反应条件为94℃预变性3 min,然后进行35个循环;94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸 30 s,最后在72 ℃延伸 7 min。 取 5 μl扩增产物,加入 1 μl电泳载样液,1%琼脂糖电泳(4 V/cm)40 min,紫外灯下观察并拍照,出现目标带的菌株为巴尔通体。

 

表1 蜱类的采集地点及生境描述

  

地点 GPS定位 生境描述蜱类 50°16′N 122°22′E 小灌木林,草地牧区鼠类 127°32′E 50°15′N 货场127°31′E 50°14′N 农田127°32′E 50°14′N 落叶阔叶林

1.2 病原体检测

1.2.1 蜱类样品研磨

DNA序列测定由长春库美生物有限公司完成。应用DNA、MAN软件,对整理获得的序列,并同CNBI上的序列进行同源比对分析,比对后将得到的序列提交GenBank获得序列登录号。

根据业务经验,从通行记录中找出指定轴型的正常车辆的通行记录和疑似假轴车辆的通行记录,计算出各自对应的轴重载荷分布曲线,将其与参考曲线相比对和可视化展示之后,可看到3种曲线的一致性情况,从而证明本文采用的以轴重载荷分布曲线作为判别依据的方法具有一定的参考价值。以此为参考,对训练集(日常通行记录或历史通行记录)中的数据进行比较,标记偏离参考曲线的通行车辆(疑似假轴车辆),为高速公路收费稽查提供有力的数据支撑,对提高收费稽查工作的效率和准确度、打击偷逃费行为及增加通行费收益等都有一定的价值。

2.2.1 蜱媒病原体检测情况

在生物安全柜中进行鼠类脏器的采集,采集前,先用75%酒精擦拭鼠类腹部刀口处,采集鼠脾脏样本。将各样本放于2 ml无菌平底离心管中,放置在冰上编号标记。向管内加入1颗5 mm无菌不锈钢珠和200 μl生理盐水,用组织研磨器研磨60 s-90 s,使组织匀浆。直接取匀浆液200 μl于1.5 ml离心管中用于核酸DNA提取 [1],DNA提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒 (由天根试剂公司生产),具体步骤按照说明书进行操作。

1.3 病原体的PCR扩增检测

2.1.1 蜱类采集结果

我跳起来去关窗户,白丽筠却一副无动于衷的懒散样子。她坦然地面对刮进室内的狂风,一副砍头只当风吹帽的等闲姿态。窗户关上,风静止下来。我的眼泪却潸潸而下。我那颗坚硬的心,原不肯轻易软化,还想找寻逃避的借口,可是事实证明白丽筠为我付出的太多了。我匍匐在白丽筠的膝头上,忍不住嚎啕大哭起来。

2013年至2014年每年4月16日至10月8日期间,采用鼠夹昼夜法(见表1)进行鼠类动物的采集,每个月分别在上旬及下旬进行两次鼠类采集,每次不少于3个监测点,每个点100个鼠夹,一般傍晚放夹,零晨3点之前收夹。采集到的鼠类进行种属鉴定,鉴定后的鼠类进行病原体检测。

共获得鼠类8只,经鉴定分2科3属3种,鼠科姬鼠属黑线姬鼠6只(雌性2只,雄性4只)占总构成的75%,鼠科家鼠属褐家鼠1只(雄性)占总构成的12.5%;仓鼠科田鼠属东方田鼠1只(雄性)占总构成的12.5%。

蜱类的研磨,首先用75%乙醇浸泡10 min,无菌生理盐水洗涤风干后沿纵向中轴线割半只用于研磨提核酸,半只冻于-80℃冰箱保存。半蜱加入800 μL生理盐水中,加入2粒2mm钢珠研磨。Qiagen组织研磨器30次/s震荡2次,每次1.5 min;

2 结果

2.1 蜱类及鼠类采集结果

1.3.1 PCR检测

共获得蜱类640只,经鉴定分属3属3种,其中森林革蜱(Dermacentor Silvarum)583只(雌性382只,雄性201只)占总体构成91.09%,为优势蜱种、嗜群血蜱 (Haemaphysalis concinna)41只 (雌性22只,雄性19只)占总体构成6.41%、全沟硬蜱(Ixodes persulcatus)16 只(雌性 10 只,雄性 6 只)占总体构成2.50%。

2.1.2 鼠类采集结果

安徽沿淮地区属于淮河中游地区,是淮河流域河湖洼地集中分布区,地势平缓,河流、湖泊、洼地密布,湿地类型多样,湿地旅游资源十分丰富。沿淮地区分布有2个地级城市和12个县城,地理位置为跨淮河两岸幅宽50~80 km的地域范围。在沿淮河两侧有低洼地63万hm2,约占沿淮地区总面积的27.7%,是沿淮地区湿地的集中分布区。

1.3.2 序列测定及分析

3.EPC工程总承包项目结算和审计问题。《审计法》第二十二条、《审计法实施条例》第二十条规定,所有的以政府资金为主的项目都需要进行审计。在EPC工程总承包项目中,业主一般采用风险可控的固定总价合同模式,政策发文也提倡这种合同模式,这与目前的以项目竣工审计为依据的结算体系出现矛盾。更深一步讲,固定总价合同模式下,是否需要最终审计,如何进行审计,这是目前业主也无法给出答案却亟待解决的现实问题。

2.2 蜱媒病原体及鼠媒病原体检测情况

1.2.2 鼠类样本研磨

仅在黑河口岸的森林革蜱中检测到巴尔通体,阳性数为22只,在森林革蜱中的感染率为3.77%(22/583),通过巴尔通体引物Bart781与Bart1137扩增得到的379 bp阳性片段测序后进行同源比对发现与EF662053.1巴尔通体相似率达到了100%,提交genebank获登录号为kM115550(见图1)。

  

图1 巴尔通体(属)阳性样品PCR检测结果

2.2.2 鼠携带病原检测情况

氮素和水分添加对荒漠草原土壤理化性质及微生物量碳氮的影响………… 霍利霞,红 梅,赵巴音那木拉,高海燕,叶 贺(54)

在黑河口岸的黑线姬鼠中检测到巴尔通体阳性率为33.33%(2/6),阳性片段测序后进行同源比对,与巴尔通体序列JQ228398.1相似率达到100%,提交NCBI获得登录号为km044271,此外该片段经过比对后发现与黑河地区森林革蜱中发现的巴尔通体DNA片段相同(见图2)。

  

图2 巴尔通体(属)阳性样品PCR检测结果

3 讨论

中国黑河口岸地区土地广袤,原始生态环境保持良好且畜牧业较为发达,是蜱传鼠传疾病多发的地区,立克次体、汉坦病毒等人兽共患的病在黑河口岸地区广泛流行。巴尔通体(Bartonella)是一种革兰氏染色阴性菌,巴尔通体属于细菌域(Bacteria)、变形菌门 (Proteobacteria)、A-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、根瘤菌目 (Rhizobiales)、巴尔通体科(Bartonellaceae)、巴尔通体属(Bartonella)。巴尔通体属(Bartonella spp.)属于一组新发的人畜共患病原体,其普遍存在于各种脊椎动物中,引起成一系列临床症状[3]。巴尔通体呈世界性分布,超过33种巴尔通体已经被认知,并且这些病原体以广泛的哺乳动物为感染宿主,这其中就包括至少22种已知的啮齿类动物[4]。啮齿类动物和巴尔通体之间的关联是非常重要的,因为啮齿动物可表现为长达数月的隐性菌血症,而且很多不同种的啮齿动物可感染不同种的巴尔通体,并且存在世界性的变异[5]

自然疫源地是指在自然界中某些野生动物体内长期保存某种传染性病原体的地区。在自然疫源地内,某种疾病的病原体可以通过特殊媒介感染宿主,长期在自然界循环,不依赖人而延续其后代,并在一定条件下传染给人,在人与人之间流行。在黑河地区在以往的调查中并未有巴尔通体病的报道,此次是首次在黑河口岸蜱类和鼠类样本中检测到巴尔通体DNA片段,为证实巴尔通体在黑河口岸的存在,提供了分子生物学证据,推断黑河口岸地区可能存在着巴尔通体自然疫源地,因此开展巴尔通体自然疫源地调查是十分必要的。

巴尔通体通常以某种昆虫媒介传播给人,吸血节肢动物中起主要作用。巴尔通体通常通过吸血节肢动物传播,如跳蚤,虱子,白蛉、苍蝇和蜱等[6],宿主动物也非常广泛,除了猫、犬和牛等与人类关系密切的动物外,野生啮齿动物是巴尔通体的重要自然宿主,是巴尔通体最大的贮存宿主[7]。大量研究报告表明巴尔通体在鼠形动物中广泛分布,国内啮齿类动物巴尔通体感染情况的调查主要局限在福建[8]、浙江[9]、海南[10]、台湾[11]、黑龙江[12]、青海[13]等地,除此以外的其他地区几乎为零报道地区。左双燕[13]在对我国黑龙江林区鼠型动物巴尔通体感染调查中表示,黑线姬鼠和棕背?为东北林区巴尔通体的重要储存宿主,且姬鼠属带菌率较高。

另外,本研究在评价方法上选取灰色关联分析。此法不管对样本量的多少还是对数据的分布类型都没有要求,可以处理定性与定量相结合的数据,其核心是计算关联度系数且计算量小。本文研究野生钟花樱的观赏性综合评价,指标数据既有定性又有定量,因此选择灰色关联分析法是合适的,而且所得最终评价结果与实际观赏效果基本一致。最后在灰色关联度结果上,运用有序样品聚类法对55株野生钟花樱植株进行分级,并对分级结果进行差异性显著性检验,进一步说明所分等级的合理性。因此,本文使用Delphi法确定的权重值与灰色关联分析相结合的综合评价法具有科学性、可行性及推广性。

巴尔通体所引起的疾病谱广泛,临床表现复杂,主要引起的疾病有猫抓病(CSD)、五日热、奥罗亚热和秘鲁疣、杆菌性血管瘤(BA)与杆菌性紫癜(BP),目前在我国影响较为广泛的主要是猫抓病,猫抓病(CSD)分布具有全球性。本病在临床上以血液红细胞崩解、溶血和心血管内膜炎、淋巴结炎为特征,自然感染的急性病例临床表现为虚弱无弱无力,倦怠,食欲不振至丧失,消瘦,嗜睡,呼吸急促,体温升高,严重贫血,多数出现可视黏膜黄染,严重的出现呼吸困难等。 目前,已知15种巴尔通体B.bacilliformis、B.quintana、B.henselae 、B.elizabethae、B.grahamii、B.vinsonii subsp.berkhoffii、B.koehlerae、B.alsatica、B.vinsonii subsp.arupensis、B.washoensis、B.rochalimae、B.tamiae、B.melophagia、B.mayotimonensisa、B.volans、B.clarridgeiae 可导致人类的疾病[14],然而近期的一些研究支持,巴尔通体的啮齿类动物适应物种可能与更多的人类疾病有关[15-16],有研究表示,B.elizabethae 是已知的导致人类感染性心内膜炎与啮齿类动物相关的巴尔通体,另外还有一些与啮齿动物相关的巴尔通体B.tribocorum,B.vinsoniisubsp.Arupensis, 和 B.washoensis可引起人类一系列的临床症状,包括疲劳,肌肉和关节疼痛,和严重的并发症,如感染性心内膜炎和神经系统症状[15-16]

中俄边境黑河口岸巴尔通体自然疫源地的调查研究及检测方法的建立,对于口岸新发传染病的防控具有重要病原学意义,该项目的实施及完成,为正确评估巴尔通体病原体及相关疾病流行的风险程度、改善口岸卫生状况及时有效地预防和控制相关人畜共患病的暴发和流行,保障地方经济秩序的正常运行具有重要意义。

参考文献

[1]杨军,鞠文东,焦丹,等.黑龙江省逊克县火山熔岩地区啮齿动物携带病原体调查 [J].中国媒介生物学及控制杂志.2015,26(3)326-328.

[2]孙继民,鲁亮,刘起勇,等.浙江省蜱中巴尔通体感染的分子流行病学调查 [J].中国媒介生物学及控制杂志,2010,21(3):232-234.

[3] Breitschwerdt EB,Maggi R,Chomel BB,Lappin MR.Bartonellosis:an emerging infectious disease of zoonotic importance to animals and human beings [J].J Vet Emerg Crit Care.2010,20(1):8-30.

[ 3 ] AR Favacho,MN Andrade,RC de Oliveira,et al.Zoonotic Bartonella species in wild rodents in the state of Mato Grosso do Sul,Brazil [J].Microbes&Infection,2015,17(11-12):889-892.

[ 5 ] R Gutiérrez,B Krasnov,D Morick,et al.Bartonella Infection in Rodents and Their Flea Ectoparasites:An Overview[J].Vector Borne&Zoonotic Diseases,2015,15(1):27-39.

[6 ] ST Tay,AS Mokhtar,S Zain,KC Low.Short Report: Isolation and Molecular Identification of Bartonellae from Wild Rats (Rattus Species) in Malaysia[J].American Journal of Tropical Medicine&Hygiene,2014,90 (6):1039-1042.

[7]孙继民,宋秀平,傅桂明,鲁亮,刘起勇.浙江省鼠形动物巴尔通体的遗传进化分析 [J].中国人兽共患病学报,2010,26(6):532-534.

[8] 白瑛,M.Y Kosoy,G.O Maupin,等.首次证实巴尔通体在我国云南鼠群中流行 [J].中国人兽共患病学报,2002,18(3):5-9.

[9] Liu Q,Sun J,Lu L,et al.Detection of Bartonella species in small mammals from Zhejiang province, China[J].J Wildl Dis,2010,46(1):179-185.

[10]宋秀平,刘起勇,鲁亮,等.海南省小型兽类巴尔通体的分离培养和序列分析[J].中国媒介生物学及控制杂志,2010,21(2):131-133.

[11] JW Hsieh,KC Tung,WC Chen,et al.Epidemiology of Bartonella Infection in Rodents and Shrews in Taiwan[J].Zoonoses&Public Health,2010,57(6):439–446.

[12] HX Rao,YU Juan,P Guo,et al.Bartonella Species Detected in the Plateau Pikas (Ochotona curzoiae) from Qinghai Plateau in China [J].Biomedical&Environmental Sciences,2015,28(9):674–678.

[13]左双燕.我国黑龙江林区鼠型动物巴尔通体感染调查与分离鉴定[d].中南大学,2012.

[14] VD Gislaine,LHU Pitassi,S Stanley,et al.Bartonella clarridgeiae Bacteremia Detected in an Asymptomatic Blood Donor[J].Journal of Clinical Microbiology,2015,53(1):352-356.

[15] Kosoy M,Bai Y,Sheff K,Morway C,Baggett H,Maloney SA,et al.Identification of Bartonella infectious in febrile human patients fromThailand and their potential animal reservoirs[J].Am J Trop Med Hyg.2010,82(6):1140-5.

[16] Chomel BB,Kasten RW,Williams C,Wey AC,Henn JB,Maggi R,et al.Bartonella endocarditis: a pathology shared by animals reservoirs and patients [J].Ann N.Y Acad Sci,2009,1166:120-6.

 
鞠文东,王艳梅,徐宁,耿聪,韩茜宇,刘岩,程成,焦丹,黄洋
《口岸卫生控制》 2018年第02期
《口岸卫生控制》2018年第02期文献

服务严谨可靠 7×14小时在线支持 支持宝特邀商家 不满意退款

本站非杂志社官网,上千家国家级期刊、省级期刊、北大核心、南大核心、专业的职称论文发表网站。
职称论文发表、杂志论文发表、期刊征稿、期刊投稿,论文发表指导正规机构。是您首选最可靠,最快速的期刊论文发表网站。
免责声明:本网站部分资源、信息来源于网络,完全免费共享,仅供学习和研究使用,版权和著作权归原作者所有
如有不愿意被转载的情况,请通知我们删除已转载的信息 粤ICP备2023046998号