昆虫是地球上生物数量、种类以及生态习性最为丰富的生物体之一(Chapman et al.,2014)，这些特征在某种程度上是昆虫体内各种有益微生物的贡献(Engel & Moran，2013)。昆虫的共生微生物不仅能够为一些昆虫提供必需的营养物质、帮助消化食物，还可以抵御病原菌和寄生虫等的侵入与定殖，提高对天敌的防护，影响昆虫种间、种内的物质和信息交流，传播疾病，甚至可以调控交配和生殖系统(Dillon et al.，2005; Sharon et al.，2010; 鲁迎新等，2016)。昆虫的肠道系统伴随着取食、消化、排泄等活动，处于一个可变的动态环境中(鲁迎新等，2016)，这为某些共生微生物提供了一个特定的定殖环境，大部分的微生物主要以肠道菌群的形式聚集在消化道内。目前，昆虫肠道共生微生物的研究进展相对缓慢，其中研究较为详细的主要集中在社会性昆虫等翅目白蚁(Hongoh et al.，2005)和农作物害虫沙漠蝗Schistocerca gregaria(Dillon & Charnley，2002)，经济昆虫家蚕Bombyx mori、鳞翅目害虫棉铃虫Helicoverpa armigera、小菜蛾Plutella xylostella、地下害虫暗黑鳃金龟Holotrichia parallela以及烟粉虱Bemisia tabaci、蚜虫等也有不同程度的研究进展(赵秀芝等，2011; 鲁迎新等，2016)。

(5)《缁衣》简1：“好美如好缁衣，恶恶如恶巷伯，则民咸力而型不屯(蠢)。”(屯，定母文部；蠢，昌母文部。)

甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)属鳞翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，是一种世界性分布、间歇性暴发却具有极强破坏性的杂食性农业害虫(郑霞林等，2010; Golikhajeh et al.，2016)。自20世纪80年代以来，甜菜夜蛾由原来的偶发性害虫上升为主要害虫，尤其在我国南方蔬菜种植地区，危害更为严重(张彬等，2008; 江幸福和罗礼智，2010)。由于化学防治不当，导致甜菜夜蛾对多种杀虫剂快速产生了不同程度的抗药性且抗性极难消退(林珠凤等，2007)，因此，研究甜菜夜蛾的新型防治方法迫在眉睫。目前，甜菜夜蛾的新型防治研究主要集中在抗虫基因挖掘和生防病毒开发。张雅昆等(2016)筛选得到了对甜菜夜蛾具有高杀虫毒力的Bt菌株，从中克隆得到新的cry2A基因cry2Ah5基因；张小朋(2006)筛选获得了对甜菜夜蛾和棉铃虫均具有高毒力的苏云金芽孢杆菌D1-23菌株；冯振群等(2016)验证了甜菜夜蛾核型多角病毒生物杀虫剂对甜菜夜蛾具有较好的防治效果；Fang等(2016)为研究杆状病毒的潜伏感染和超感染免疫性提供了资料。昆虫共生微生物与昆虫的抗药性、抗病毒能力密切相关，但是对甜菜夜蛾共生微生物的研究却还很少。因此，通过研究甜菜夜蛾的共生微生物，可望建立起利用细菌、病毒等微生物资源来进行植物病虫害的防治，为“控菌防虫”新策略提供一定的理论支撑(冯利等，2008; 黄云等，2009; 李迁等，2016)。

本研究利用基因组DNA的16S rDNA文库的随机测序方法，调查了初孵和1日龄甜菜夜蛾整虫及3龄、5龄甜菜夜蛾中肠中细菌群落组成和相对丰度，为探讨甜菜夜蛾与其共生细菌的协同进化做前期基础研究，为了解甜菜夜蛾共生细菌群落结构信息，揭示共生菌与甜菜夜蛾抗性调控的作用机制提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料及主要生化试剂

1.1.1 试验材料

供试甜菜夜蛾样品由中国农业科学院棉花研究所植保室提供，为人工饲料室内饲养，饲养温度26℃±1℃；光周期14 h ∶10 h(光照/黑暗)；饲养湿度60%-75%。取甜菜夜蛾初孵幼虫、1日龄幼虫、3龄幼虫和5龄幼虫各20头用于共生菌16S rDNA文库的构建。

1.1.2 主要试剂

黑背心在沙发上坐下了，泰森在床上躺下了，我在原地继续站着，他们都没有想搭理我的意思。无趣中，我走过去打开了电视机，电视正播放中国足球队与巴西队的比赛录像。我说：“嗨，足球赛呢！”他们没有反应，也没有望我。我又说：“这是今年三月份国足与巴西队的一场友谊赛，中国队2:0赢了呢！”他们不约而同地扭头瞟了我一眼，都没有吭声。我感到很没有面子，忙自我解嘲地笑笑说：“是的，是的，中国足球的确让人伤心透了，这次不过是侥幸赢了！中国队怎么能战胜巴西队呢，人家有罗纳尔多、罗马里奥，是世界足坛的头号劲旅呢！”

1.2 16S rDNA文库的建立

1.2.1 甜菜夜蛾初孵幼虫和1日龄幼虫、3龄幼虫和5龄幼虫中肠总基因组DNA提取

用无菌的生理盐水将初孵幼虫和1日龄幼虫的甜菜夜蛾清洗2次后，在无菌条件下再清洗1次，放入离心管中研磨均匀，得到初孵和1日龄甜菜夜蛾总基因组DNA研磨液。将3龄和5龄的甜菜夜蛾幼虫分别放入无菌的生理盐水中清洗3次后使用75%酒精消毒，无菌条件下解剖，获得甜菜夜蛾的中肠。放入离心管中在无菌条件下研磨均匀，得到甜菜夜蛾 3龄幼虫和5龄幼虫中肠的总基因组DNA研磨液。接着在研磨液中各加入70 μL溶菌酶和110 μL来自“血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)”中的TE，放入37℃金属浴30 min。然后采用“血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)”提取样品的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000C微量分光光度计检测提取质量。

1.2.2 甜菜夜蛾共生菌16S rDNA序列扩增

参考Brown等(Brown & Wernegreen，2016)的研究，以基因组DNA为模板，采用细菌16S rDNA通用引物10F(5′-AGTTTGATCATGGCTCA GATTG-3′)和1507R(5′-TACCTTGTTACGACTT CACCCCAG-3′)扩增。50 μL扩增体系包括：dNTP·mix 4 μL，10×Ex-Taq Buffer 5 μL，正方向引物(10 μmol/L)各2 μL，DNA模板2 μL，exTaq酶0.4 μL，加无菌水至50 μL。PCR扩增程序为94℃ 2 min；然后35个循环(94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min)，最后72℃ 7 min。

1.2.3 目的产物的回收、连接和转化

将所得PCR产物放于1.2%琼脂糖凝胶上电泳分离，利用紫外凝胶成像仪切下目的条带，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收。4 μL纯化产物与1 μL Peasy-T3 Cloning Kit，混匀后放入25℃金属浴连接30 min。然后转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，在含氨苄的LB平板上37℃过夜培养。

Guo J, Wu J, Deng XY,et al. Advances in research on insect gut microbiota and their functions [J]. Chinese Journal of Applied Entomology, 2015 (6): 1345-1352. [郭军, 吴杰, 邓先余, 等. 昆虫肠道菌群的功能研究进展[J]. 应用昆虫学报, 2015 (6): 1345-1352]

在对高速公路进行改扩建过程中，可能会发生交通拥堵甚至车辆事故，所以，在管理区域内需设置紧急救援区。为了防止造成长时间的交通拥堵，必须要配置专门的负责人对交通事故进行管理，合理处理交通拥堵，保证车辆正常出行。

根据载体序列信息，使用M13F(GTAAAAC GACGGCCAGT)和M13R(CAGGAAACAGCT ATGAC)作为菌液PCR筛选阳性克隆的引物。随机挑选700个菌落，分别在含有氨苄的液体LB培养基中培养4 h。然后使用25 μL PCR扩增体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP·mix 2 μL，正反向引物M13F和M13R各1 μL，rTaq酶0.1 μL，菌液1 μL，加无菌水至25 μL。菌液PCR扩增程序为：94℃ 3 min；然后35个循环(94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min)，最后72℃ 7 min。将PCR产物放于1.2%的琼脂糖凝胶上电泳分离，利用紫外成像系统检测筛选阳性克隆子。筛选出来的阳性克隆子送至上海生工生物工程有限公司测序，得到有效克隆子571条。

将测序得到的核酸序列(片段长度约1.5 kb)在RDP数据库中(Maidak et al.，2001)比对后，挑选序列相似性最高且相似性大于95%的序列，作为构建系统发育树的参考序列。使用DNAMAN对测序结果进行比对，将两个及两个以上相同的测序基因挑选出来，用MEGA 4.0软件的NJ(Neighbor-joining)法构建系统发育树(Tamura et al.，2007)，采用Kimura 2-Parameter算法，并设定bootstrap为1000次重复。

2 结果与分析

2.1 细菌16S rDNA扩增产物

采用细菌16S rDNA通用引物10F(5′-AGTTTGATCATGGCTCAGATTG-3′)和1507R(5′-TACCTTGTTACGACTTCACCCCAG-3′)，以甜菜夜蛾基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果见图1，获得的目的条带约为1.5 kb，且无非特异性条带。得到的扩增产物经纯化后用于构建16S rDNA文库。

  

图1 甜菜夜蛾不同龄期共生菌的16S rDNA扩增图谱Fig.1 16S rDNA amplified fingerprints of symbiotic bacteria at different ages of Spodoptera exigua注：M, DNA ladder; CF, 甜菜夜蛾初孵幼虫共生菌16S rDNA扩增产物; 1 d, 甜菜夜蛾1 d龄幼虫共生菌16S rDNA扩增产物; 3L, 甜菜夜蛾3龄幼虫共生菌16S rDNA扩增产物; 5L, 甜菜夜蛾5龄幼虫共生菌16S rDNA扩增产物。Note: M, DNA ladder; CF, 16S rDNA amplification product of the symbiotic bacteria in the newly-hatched larva of S. exigua; 1 d, 16S rDNA amplification product of the symbiotic bacteria in the 1 day old of S. exigua; 3L, 16S rDNA amplification product of the symbiotic bacteria in the third of S. exigua; 5L, 16S rDNA amplification product of the symbiotic bacteria in the fifth of S. exigua.

2.2 甜菜夜蛾初孵幼虫和1 d龄幼虫细菌菌群组成分析

初孵幼虫中的共生菌分别属于相对丰度约占75.9%的优势共生菌不动杆菌属Acinetobacter、10.6%的噬酸菌属Acidovorax、8.5%的噬氢菌属Pelomonas、2.8%的埃希氏菌属Escherichia和2.1%的柠檬酸杆菌属Citrobacter；1日龄幼虫中的共生菌分别属于相对丰度较高，约占40.2%的噬氢菌属Pelomonas、其次是31.1%的不动杆菌属Acinetobacter、10.6%的噬酸菌属Acidovorax、4.5%的柠檬酸杆菌属Citrobacter、2.8%的埃希氏菌属Escherichia和5.3%只能分到目的伯克氏菌目Burkholderiales(表1)。

(3)通过计算得到不同叶片数搅拌桨的混合室中单位体积混合能，分析对比得到混合效率最高的为5叶片搅拌桨，其中3叶片和4叶片的搅拌桨混合效率相当。

2.3 甜菜夜蛾3龄幼虫和5龄幼虫中肠细菌菌群组成分析

3龄幼虫中肠中的共生菌可以分到属的分别是相对丰度最高占79.1%的不动杆菌属Acinetobacter、其次是相对丰度各占3.7%的噬氢菌属Pelomonas、肠球菌属Enterococcus和柠檬酸杆菌属Citrobacter、2.2%的噬酸菌属Acidovorax、各占0.7%的埃希氏菌属Escherichia、肠杆菌属Enterobacter和丛毛单胞菌属Cruvibacter；分到科的分别是相对丰度占1.5%的丛毛单胞菌科Comanonadaceae、0.7%的肠杆菌科Enterobacteria和0.7%的草酸杆菌科Massilia以及只能分到目的占2.2%的伯克氏菌目Burkholderiales；5龄幼虫中肠中的共生菌分别属于相对丰度约占97%的优势共生菌不动杆菌属Acinetobacter、1.8%的噬氢菌属Pelomonas和1.2%的噬酸菌属Acidovorax(表1)。

 

表1 甜菜夜蛾不同龄期细菌组成和相对丰度

 

Table 1 Bacteria composition and relative abundance of Spodoptera exigua at different ages

  

属名(或科名、目名)Genus(orFamily,Order)相对丰度(%)Relativeabudance整体Overall初孵Newly-hatchedlarva1d龄1dayold3龄3rdlarvae5龄5thlarvae伯克氏菌目Burkholderiales丛毛单胞菌科Comanonadaceae肠杆菌科Enterobacteria草酸杆菌科Massilia不动杆菌属Acinetobacter噬酸菌属Acidovorax噬氢菌属Pelomonas埃希氏菌属Escherichia柠檬酸杆菌属Citrobacter肠球菌属Enterococcus丛毛单胞菌属Cruvibacter肠杆菌属Enterobacter测序总数Totalsequences17.50.40.20.272.35.612.83.22.50.90.20.257175.910.68.52.82.15.331.19.140.29.84.52.21.50.70.779.12.23.70.73.73.71.50.797.01.21.8

将所有测序结果综合后发现，不动杆菌属Acinetobacter是优势共生菌，约占72.3%，其次为噬氢菌属Pelomonas约占12.8%，噬酸菌属Acidovorax占5.6%，埃希氏菌属Escherichia约占3.2%，柠檬酸杆菌属Citrobacter约占2.5%，伯克氏菌目Burkholderiales约占1.8%，肠球菌属Enterococcus约占0.9%，丛毛单胞菌科Comanonadaceae约占0.4%，剩余的丛毛单胞菌属Cruvibacter、肠杆菌属Enterobacter和肠杆菌科Enterobacteria、草酸杆菌科Massilia均占约0.2%。

2.4 系统发育树分析

从已有文献中(相辉等，2007; 相辉，2008; 刘莉等，2008; 李香香，2010; 王莉莉，2011; 戴阳等，2012)选择不动杆菌属Acinetobacter的不同宿主昆虫进行同源性比对(结果见图2)，由图2发现甜菜夜蛾中的不动杆菌属与番石榴果实蝇Bactrocera correcta中的同源性最高，约为96.5%；与贡嘎蝠蛾幼虫Hepialus gonggaensis的同源性最低，约为94.8%。整体来看不同宿主昆虫的不动杆菌属的同源性相对较高，说明不动杆菌属在其宿主昆虫的内环境均可以正常生存但影响不同。

 

接上图

  

图2 不同宿主昆虫的不动杆菌属同源性比对Fig.2 Homology comparison of Acinetobacter in different host insects

  

图3 基于16S rDNA序列的甜菜夜蛾不同生长时期细菌系统发育树Fig.3 Bacterial phylogenetic tree of different growth stages of Spodoptera exigua based on 16S rDNA sequence注：图中未标注GenBank数据库注册号的序列为本研究所获得的克隆序列。Note: The sequence out of the registration number in the Genbank database were the clone sequence obtained in this study.

从系统进化树(图3)可以看出甜菜夜蛾的4个不同时期鉴定的共生细菌均属于变形菌门Proteobacteria中的β变形菌纲Betaproteobacteria和γ变形菌纲Gammaproteobacteria。其中同属γ变形菌纲Gammaproteobacteria的假单胞菌目Pseudomonadales和肠杆菌目Enterobacteriales在同一支上，β变形菌纲Betaproteobacteria只有伯克氏菌目Burkholderiales。与其他昆虫(许刚等，2015; 张某等，2016)相比，室内饲养的甜菜夜蛾共生微生物种类相对较少。

3 结论与讨论

本研究采用16S rDNA文库法分析了甜菜夜蛾初孵幼虫、1日龄幼虫、3龄幼虫中肠和5龄幼虫中肠中的微生物种类。结果证实，甜菜夜蛾在3龄幼虫时微生物种类最多，共12类；在5龄幼虫时最少，只有3类；初孵幼虫和1日龄幼虫分别有5类和6类，其中不动杆菌属是优势共生菌，其相对丰度随着甜菜夜蛾龄期的改变呈现出先下降后上升的趋势，同时在5龄幼虫时相对丰度最大；噬氢菌属和噬酸菌属的相对丰度则随着甜菜夜蛾龄期的变化呈下降趋势。这些结果表明，室内饲养的甜菜夜蛾的多样性随甜菜夜蛾的生长发育呈动态变化。这与Huang和Zhang(2013)研究的暗黑齿爪鳃金龟Holotrichia parallela发现其肠道微生物在不同的发育时期存在明显的不同结果一致。说明昆虫的发育时期可以明显影响昆虫肠道菌群的组成。

昆虫的内共生细菌通常被分为两类：初级内共生菌和次级内共生菌(Dale & Moran, 2006)。初级内共生菌对昆虫来说是必需的，主要依靠垂直传播；而次级内共生菌则不受限制，既可以垂直传播，也可以水平传播(Oliver et al.，2010)。选用甜菜夜蛾初孵幼虫可以推测哪些共生细菌可能是垂直传播的，如不动杆菌属Acinetobacter；而研究1日龄的甜菜夜蛾中共生细菌的种类和相对丰度则可以推测在甜菜夜蛾适应外界环境时哪些共生细菌可能是通过食物来进行传播的，如伯克氏菌目Burkholderiales。因甜菜夜蛾初孵幼虫和1日龄幼虫太小，无法取其中肠，因此直接选用整个昆虫。3龄前的甜菜夜蛾食量小，群集生长危害，其后进入暴食期，分散危害。研究其共生细菌的种类可为甜菜夜蛾的生物防治提供理论基础。5龄的甜菜夜蛾开始储存大量能量，为化蛹做准备，此时甜菜夜蛾中的某些共生细菌可能通过释放相关激素来影响其生殖发育。

甜菜夜蛾的优势共生菌不动杆菌属是一种非发酵糖的革兰阴性球杆菌，它广泛分布于自然界。其中不动杆菌属的重要特征之一是对多种抗生素天然耐药，如氨苄西林、阿莫西林等(王辉，2005)。Kikuchi等(2012)发现椿象Riptortus pedestris能够迅速富集对杀螟松(fenitrothion)具有抗性的伯霍尔德杆菌Burkholderia并与之建立共生关系，从而利用伯霍尔德杆菌Burkholderia介导的杀虫剂抗性来提高自身对农药的抗性，并且由抗性伯霍尔德杆菌介导的农药抗性还能在其他昆虫中水平移动。Xia等(2013)发现农药处理后的抗性品系小菜蛾中肠细菌结构发生变化且其变化趋势和抗性品系与敏感品系之间的区别一致，认为小菜蛾的中肠细菌很可能参与了农药的抗性。因此笔者猜测甜菜夜蛾之所以可以快速产生抗药性与其体内不动杆菌属含量较高有关。相辉等(2008)认为野生昆虫取食的外界果实中含有次生代谢物质，具有一定的杀菌作用，可能会影响肠道共生菌的多样性。为验证这些猜测，需进一步研究室内和野生甜菜夜蛾产生耐药性的原理及其共生微生物作用。

解析：设此多肽链彻底水解可产生谷氨酸a个、苯丙氨酸b个、甘氨酸c个、丙氨酸d个，则根据C、H、O、N原子守恒可分别得①、②、③、④式：

血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)购自北京天根生化科技公司。10 × Taq Buffer(含15 mmol/L MgCl2)、2.5 mmol/L dNTPs、2.5 U/μL Taq DNA 聚合酶、50 mg/mL溶菌酶、D2000 DNA分子量标准均为大连宝生物公司产品，琼脂糖凝胶回收试剂盒购自普洛麦格(Promaga)生物技术有限公司，Peasy-T3 Cloning Kit和Trans1-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

近年来，人们对环境保护和生态安全愈发关注，推动了害虫生物防治方法和理论的研究。而新一代高通量测序技术的广泛应用，也为测定昆虫共生微生物多样性，研究其对昆虫的功能和影响提供了先进的技术平台(郭军等，2015)，这些都极大的促进了昆虫共生微生物的研究。研究昆虫的共生微生物不仅可以为揭示昆虫与微生物的协同进化、互作机制提供方法和数据，还可以为开发出以昆虫共生菌为靶标的新型害虫防治生物制剂，绿色保护有益昆虫提供新路径。

参考文献(References)

平均粒径(M)表示了沉积物粒度的平均及中心趋势的分布状况。本文采用由Folk等[17]提出的全面图解计算法。各粒度参数如表3所示。

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短暂性脑缺血发作是脑病科的常见疾病之一，是在颅内动脉病变的基础上，引起一过性的、短暂性的、局灶性的脑及视网膜功能障碍[1] ，其症状可在发病后1 h内缓解，但不超过24 h。本病好发生于中老年人群，尤以50～70岁之间为最高发年龄段，病情可反复发作，又被称为脑梗死的“第一预警信号”[2] ，更可威胁患者的生命安全，故而需要积极治疗。近年来笔者将疏血通注射液应用于短暂性脑缺血发作的治疗当中，取得了满意的效果，现报道如下。

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对于实数编码，算术杂交算子比离散重组算子应用要多许多。算术杂交算子也分为几种：整体算术杂交算子、线性杂交算子等。设两个长度为n的父代个体分别为P1=(P11，P12，…，P1n)，P2=(P21，P22，…，P2n)，经交叉操作后得到子代个体分别为C1=(C11，C12，…，C1n)，C2=(C21，C22，…，C2n)。则C1，C2定义为：

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1.2.4 序列验证与分析

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会议强调，要加快推进果菜茶有机肥替代化肥，提高化肥利用效率。加快推广绿色防控综合技术模式，打造高水平专业化统防统治服务队伍。加快研发和推广应用环保型农药制剂和高效药械，提高农药利用率。加快集成绿色高质高效技术模式，推进按标生产，严格质量监管，增加绿色优质果菜茶产品供给。加快打造一批高标准生产基地，创响一批档次高、影响力强的知名品牌，延长产业链、提升价值链。

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冯一余一气之下，又重新开车了。至于停车的问题，他已经有了办法，向领导提出申请，换了一个工作岗位，不需要每天晚上应酬，一下班就可以准时回家，可以保证停车万无一失了。

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程式语已成为英语教育工作者们所探讨的一个热点话题。学者们发现在传统的单词、短语和句子之间有一种语言单位程式语（formulaic speech）可以游走在这三者之间。程式语可以是短语、句子、句子的某部分等不同形式呈现，因此从某种意义上说程式语打破了传统意义上对语言单位的划分。程式语不以语言的长度为单位进行划分，而是以意义为单位进行连接，为语言学习者提供了一个新的切入点。

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2014年4月，创科源激光在新三板成功挂牌，股票名称：激光装备，股票代码：430710，同年11月，创科源激光并入江苏亚威机床股份有限公司（股票代码002559），成为亚威股份旗下专业从事激光三维加工和薄板二维切割的全资子公司。亚威股份将借此进一步完善在工业机器人领域的产业链并拓展市场应用领域，实现产品结构的战略布局，助推公司产品进入高端装备制造业。

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中国储运：请您介绍一下英特诺在中国市场上最受欢迎的产品类型主要有哪些？作为国际上最知名的设备制造和物流整体解决方案提供者，英特诺是在用产品解决方案为客户服务的过程中有哪些经验可以与大家分享？

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