组织蛋白酶cathepsins是溶酶体重要的水解酶类，包括若干亚家族，如L, B, H, O, S, T, K, V和F等(http:∥www.expasy.ch/enzyme/enzyme-byclass.html)，其以酶原形式被合成后，在内体或溶酶体的酸性环境中经蛋白水解而加工为活化的成熟酶(Nishimura et al., 1998)，参与蛋白质的降解，为机体提供可循环利用的氨基酸原料，并在各种生理和病理过程中发挥重要的作用(罗梅等, 2012)。昆虫组蛋白酶通过其蛋白降解活性和维持正常的细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)，即细胞凋亡，在昆虫生长发育和代谢过程中起着非常重要的作用。在外源营养缺乏的条件下，昆虫发育的胚胎必须从卵储存物中获取所需的营养，组织蛋白酶，尤其是组织蛋白酶L(cathepsin L, CatL)作为重要的消化蛋白酶(Cristofoletti et al., 2003)，在这一过程中通过分解氨基酸组分高度丰富的卵黄蛋白提供营养物质，从而参与胚胎发生过程(Zhao et al., 2005; 罗梅等, 2012)。许多研究证实CatL参与了昆虫胚前期卵子发生以及卵子发生过程中某些卵子细胞的退化，如玉米象Sitophilus zeamais体内CatL同源基因大量分布于卵母细胞和滋养细胞中，表明玉米象体内CatL参与了卵子的成熟过程(Matsumoto et al., 1997)。淡色库蚊Culex pipiens pallens产卵前的卵子细胞解体过程中，也出现CatL的活化(Uchida et al., 2001)。卵子退化是一种细胞凋亡(Uchida et al., 2004)，因此说明CatL等组织蛋白酶参与了卵子细胞的凋亡。

按照国家对稠油分类的标准，地层黏度大于50 mPa·s并且地面黏度小于10Pa·s的为普通稠油［1］。胜利油田普通稠油储量为10.5亿t，以注水开发为主，其中地下原油黏度大于100mPa·s的水驱储量为3.75亿t，预测采收率小于20%。有必要对提高水驱普通稠油采收率的开发方式及水驱后转热采的可行性进行研究。

(4) 本文计算中将混凝土视为线弹性进行分析，计算所得基岩面处廊道上游侧底部的最大拉应力为28.6 MPa，有相当区域已远远超过混凝土的抗拉强度，因此下一步拟采用非线性模型模拟混凝土开裂破坏行为，以更加真实地反映深厚覆盖层高土石坝坝基廊道的实际工作性态。

昆虫变态发育是一个存在大量组织降解与重建的关键发育过程。此期间，组织蛋白酶参与了幼虫组织的逐步分解，使成虫组织从成虫盘中重新发育分化形成。在麻蝇Sarcophaga由幼虫到蛹的变态过程中，发现组织蛋白酶B同源物参与了脂肪体的解体(Kurata et al., 1992)。地中海实蝇Ceratitia capitat幼虫变态过程中同样发现组织蛋白酶early meatmorphosis aspartyl proteinase (EMAP)参与脂肪体组织解体的现象，而且此过程中EMAP介导了脂肪体细胞的凋亡从而导致了脂肪体的解体(Rabossi et al., 2004)。这类过程中CatL也表现得极其活跃，家蚕Bombyx mori的丝腺变态发育中发生组织解体，CatL参与了这种变态过程的细胞凋亡(Shiba et al., 2001)。王政等(2015)研究也发现草地贪夜蛾Spodoptera exigua组织蛋白酶L(SfCatL)在印楝素诱导的Sf9细胞凋亡中起到重要促进作用，进一步证实CatL与昆虫细胞凋亡密切相关(Wang et al., 2015)。棉铃虫Helicoverpa armigera CatL还参与其幼虫的蜕皮和变态发育过程的脂肪体解离，而且用组织蛋白酶L抑制剂CUK148和E64d注射入棉铃虫体内，导致5-6龄幼虫蜕皮和发育延迟(刘建, 2006)。可见，以抑制剂抑制组织蛋白酶活性，会干扰昆虫正常发育，达到防治害虫的目的，组织蛋白酶可能成为害虫防治的重要靶标蛋白，尤其是CatL在昆虫体内含量丰富，功能多样，已在多种昆虫中被研究，包括双翅目、鞘翅目、半翅目和鳞翅目等，其基因序列被克隆和深入分析，如棉蚜Aphis gossypii(Deraison et al., 2004)，长虹猎蝽Rhodnius prolixus(Lopez-Ordoez et al., 2010)，棉铃虫(Wang et al., 2010)，家蚕(李懿等, 2015)等，这些研究为进一步探索CatL的功能奠定基础。综上所述，CatL作为昆虫生长发育过程的重要酶类，干扰或抑制CatL活性，会导致昆虫发育过程中正常的细胞凋亡或正常蜕皮以及营养供应发生异常，从而抑制昆虫的生长发育，达到害虫防治的目的，因此CatL可成为农业害虫防治的靶标。因此，研究各种农业害虫的组蛋白酶基因及其相关功能，对新农药开发有重要理论指导意义。本研究拟以草地贪夜蛾卵巢离体细胞系Sf9为材料，克隆其CatL基因并进行序列分析，研究其原核表达特性和制备特异性抗体，以期为深入研究该基因的功能，开发组织蛋白酶抑制剂类杀虫剂等提供理论依据。

本研究对比分析了有无参加中医执业医师实践技能考试培训的考试通过率与执证就业率，结果显示，观察组（参加中医执业医师实践技能考试培训）学生的考试通过率与执证就业率均高于对照组（未参加中医执业医师实践技能考试培训），由此提示，培训可以提高实习生的临床实践技能，提高学生技能训练的积极性，这就表明通过该考试可以提高学生社会职业素养和就业竞争力。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂、仪器和软件

以基因组DNA为模板，分别利用SCLP1和SCLP2引物进行PCR扩增。扩增产物在1 000 bp左右有条带(图6: A)，与基因克隆过程的PCR产物电泳检测结果一致，而且将PCR产物送测序，序列比对分析表明扩增产物序列与对应的SfCatL ORF序列一致，表明SfCatL编码区没有内含子。为了构建原核表达载体，以Sf9细胞总RNA反转所获得cDNA为模板，SCL-S和SCL-A为引物，扩增SfCatL编码区成熟肽序列片段，PCR产物与SfCatL大小相符合(图6: B)，表明获得了成熟肽序列片段。

基因工程菌大肠杆菌Escherichia coli trans1-T1感受态细胞和pEASY-T1克隆载体购自北京全式金生物技术有限公司；ExTaq DNA聚合酶(10 U/μL)、dNTPs(each 10 mmol/L)购自东盛生物公司；凝胶DNA回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、基因组DNA小样抽提试剂盒、MD底物显示试剂盒购自天根生化科技有限公司；AMV反转录酶(10 U/μL)、限制性内切酶BamHⅠ, NotⅠ, SalⅠ和NdeⅠ以及T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；RNA提取试剂Trizol 购自Invitrogen公司；Ni-NAT agarose购自Promega公司；蛋白质浓缩管(1 kD)购自Millipore公司；96孔酶标板购自Corning公司；蛋白透析袋、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG, TMB显色液OCT包埋剂和ELESA试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术责任有限公司；引物合成和测序均由上海英骏生物技术有限公司和北京华大基因研究院完成。其他常规试剂采用进口分装或国产分析纯。

主要仪器及分析软件：RC-2C高速低温离心机(Sorval公司)；DU-640核酸蛋白检测仪(Beckman公司)；PCR仪(Bio-Rad公司)；Power Pac1000电泳仪(Bio-Rad公司)；Tanon-4200凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；Discovery Studio 2.1分析软件购自创藤科技有限公司。

1.2 PCR引物的设计与合成

根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)公布的棉铃虫、烟夜蛾Helicoverpa assulta和甜菜夜蛾3种夜蛾科昆虫组织蛋白酶L基因cDNA序列，借助NCBI的BLAST程序以及DNAStar 软件PrimerSelect程序进行辅助分析，发现三者的ORF序列保守性很强，同源性在90%以上。同时，前人研究表明用棉铃虫组织蛋白酶B基因ORF序列两端直接设计引物能够克隆出同属夜蛾属的烟夜饿组织蛋白酶B基因ORF序列(赵艳艳等, 2008)。本研究Sf9细胞源于草地贪夜蛾，而草地贪夜蛾与甜菜夜蛾同属灰翅夜蛾属，所以本研究基于甜菜夜蛾组织蛋白酶L基因ORF序列两端设计引物：SexiCL P1: 5′-ATGAAGGGCGTAGCGGTTCTG-3′(正向引物)；SexiCL P2: 5′-CTACACGAGGGGGTAGGAGGC-3′(反向引物)。

1.3 总RNA和DNA的提取

Sf9细胞总RNA和基因组DNA的提取均参照对应的试剂盒说明和步骤进行。

1.4 cDNA合成

Shiba HJ, Uchida D, Kobayashi H, Natori M, 2001. Involvement of cathepsin B- and L-like proteinases in silk gland histolysis during metamorphosis of Bombyx mori. Arch. Biochem. Biophys., 390(1): 28-34.

1.5 草地贪夜蛾组织蛋白酶L基因ORF序列的克隆与分析

以1.4节反转录合成的cDNA为模板，利用所设计的引物SexiCLP1和SexiCLP2进行PCR扩增，反应体系(25 μL)： cDNA模板1 μL; ExTaq DNA聚合酶0.5 μL; 10×ExTaq Buffer 2.5μL; dNTPs(10 mmol/L) 2.5 μL; 正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL; ddH2O补至25 μL。反应条件： 95℃预变性5 min; 95℃变性1 min, 60℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 35个循环；最后72℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，出现一条1 000 bp左右的条带，DNA回收试剂盒纯化PCR产物，送上海英俊生物技术有限公司进行序列测定，测定结果用NCBI的BLAST程序与甜菜夜蛾的组织蛋白酶L基因序列进行比对分析，确定目的基因片段序列。将所获的PCR产物切胶回收克隆到pEASY-T1克隆载体上构建SfCatL-pEASY-T1重组质粒，将重组质粒转化到trans1-T1，挑取阳性克隆先进行菌落PCR鉴定，再提取质粒进行PCR，鉴定均能够扩增出1 000 bp左右条带的为含有重组质粒的真阳性克隆。把阳性克隆菌液送测序，测序结果用NCBI的BLAST程序和DNAStar软件比对分析，获得到目的基因ORF全长序列。对所测定的序列进行整理，采用NCBI的BLAST程序，SignalP 3.0，ClustalX2等生物信息学软件对目的基因ORF序列进行分析，采用DNAStar构建进化树。

1.6 同源模建草地贪夜蛾组织蛋白酶L三维结构

(1)SfCatL模板蛋白的确定：采用蛋白质多序列比对程序BLAST对草地贪夜蛾组织蛋白酶L氨基酸序列在PDB蛋白结构数据库中进行序列相似性搜索，与模板蛋白相似性达到30%以上可确定为同源蛋白，用于三维结构的建模。(2)序列联配：采用Discovery Studio/Homology中的ClustalW程序对目的蛋白与模板蛋白序列进行比对，然后根据晶体结构知识手动调整序列联配结构，以确定模建蛋白的结构保守区(structural conserved regions, SCRs)和Loop区，尽量避免在二级保护区引入Gap。(3)蛋白质三维结构的模建和动力学优化：在序列比对基础上，利用Discovery Studio软件中的Homology模块中的Modeler程序构建目的蛋白三维结构。每次Modeler计算构建10个模型。模建后对各模型以PDF total energy进行排序，选取能量最低的构象作为目的蛋白的初始三维结构。为了获得蛋白更接近其在溶液环境中的构象，利用Discovery Studio软件包的Standard Dynamics Cascade程序对目的蛋白的初始三维结构模型进行分子力学和分子动力学优化，以获得蛋白更接近其在溶液环境的构象。

1.7 草地贪夜蛾组织蛋白酶L基因编码区内含子的确定

Li Y, Zhou XY, Li ZL, Li JW, Chen SD, Guo C, Hou Y, Zhao P, 2015. Identification and expression pattern of cathepsin family in silkworm (Bombyx mori). Chin. J. Biotechnol., 31(12): 1728. [李懿, 周小英, 黎治浪, 李建伟, 陈世达, 郭超, 侯勇, 赵萍, 2015. 家蚕组织蛋白酶基因家族的鉴定及表达特征分析. 生物工程学报, 31(12): 1728]

1.8 草地贪夜蛾组织蛋白酶L基因的原核表达

在目的基因ORF的成熟肽序列的N和C两端设计一对特异性引物，上游引物5′端含有NdeⅠ酶切位点及保护碱基，下游引物5′端含SalⅠ酶切位点及保护碱基，SCL-S: 5′-gtacatatgATGTCCCTGCTC-GACCTCGTCCGG-3′; SCL-A: 5′-gtagtcgac CTACAC-GAGGGGGTAGGAGGC-3′。以1.4节合成的Sf9细胞cDNA为模板进行PCR扩增(反应体系和条件与1.5节一致)，目的片段经NdeⅠ和SalⅠ双酶切，切胶回收后，插入到同样经NdeⅠ和SalⅠ双酶切pET28a载体，构建重组表达质粒并转化感受态细胞BL21 (DE3)后，筛选阳性重组子，提取质粒进行酶切鉴定，正确的重组质粒命名为pET28a-SfCatL，送至华大基因进行测序。将阳性克隆在LB/Amp培养基中于37℃培养至OD600为0.6～1.0时，加入IPTG至1 mmol/L进行诱导表达。抽提菌体蛋白后，用15% SDS-PAGE电泳检测。蛋白纯化采用QIAGEN的Ni-NTA纯化试剂盒进行纯化。

1.9 草地贪夜蛾组织蛋白酶L原核表达蛋白的可溶性分析

从平板上挑取转化了阳性重组pET-28a(+)-SfCatL的BL21(DE3)单菌落，分别接种到5 mL LB培养基中，37℃ 200 r/min，过夜培养。次日以1∶100(v/v)将过夜菌接种到3瓶(10 mL/瓶) LB培养基中，37℃ 200 r/min，培养至A600=0.8时(约2 h)，做3种处理(不加IPTG诱导，加入终浓度0.2 mmol/L IPTG，加入终浓度0.6 mmol/L IPTG)，之后置于28℃ 170 r/min，培养4 h。同时接种空质粒pET-28a(+)转化的菌株，不做诱导，作为阴性对照。

将诱导表达的10 mL菌液，4 000 r/min离心15 min收集沉淀。微量量取450 μL Buster, 50 μL Tris-HCl(pH 8.0)和10 μL Lysozme，均匀混合后取200 μL加入到收集的SfCatL重组菌体沉淀中，重悬菌体，在脱色摇床上缓慢摇动15 min裂解菌体，取5 μL破碎后的菌液加入到50 μL Brardford中，根据蓝色深浅，快速目测菌体破碎效率，之后加入2 μL DNase(终浓度为10 μg/μL)， 1 μL 1 mol/L MgCl2，缓慢摇动5 min消化DNA， 14 000 r/min 离心10 min，分别收集上清和沉淀，沉淀用200 μL超纯水重悬待用。各取10 μL上清及沉淀溶液进行SDS-PAGE进行电泳，考马斯亮蓝G-250染色，脱色液体脱色，观察蛋白胶分析重组表达蛋白可溶性。

1.10 抗原的制备

(1)SfCatL重组菌体培养：从转化的平板上挑取单菌落接种到10 mL LB 培养基中，37℃培养16 h，次日以1∶100(v/v)转接到1 000 mL LB中，37℃培养到A600=0.6时加入终浓度为0.2 mmol/L IPTG， 28℃培养16 h。(2)细胞破碎：4 000 r/min离心20 min，收集诱导后的菌体，用20 mL菌体重悬液(pH 7.0, 0.05 mol/L PBS, 1 mmol/L EDTA, 0.05 mol/L NaCl)重悬菌体。75%强度工作10 s，间隔 5 s， 90 s破碎细菌，细胞匀浆用Bradford检测破碎效率， 50 μL Bradford加入5 μL匀浆，Bradford从棕褐色变为亮蓝色说明菌体破碎彻底。(3)电洗脱纯化SfCatL蛋白：收集到的细胞匀浆加入2×上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色30 min， 250 mmol/L KCl脱色去掉背景，将目标蛋白条带切割下来放置在10 kD透析袋中，放入电洗脱缓冲液洗脱至蛋白胶从蓝色变为白色为止。取出透析袋中的溶液，按照1∶10体积比加入预冷的丙酮，于-20℃沉淀2 h，在于4℃ 14 000 r/min，离心30 min，收集到的沉淀即为目标蛋白。(4)蛋白浓度测定。收集到的蛋白洗脱液，用Bradford试剂盒测定蛋白质浓度。

Kurata S, Saito H, Natori S, 1992. The 29-kDa hemocyte proteinase dissociates fatbody at metamorphosis of Sarcophaga. Dev. Biol., 153(1): 115-121.

1.11 抗血清制备与检测

把制备好的目的蛋白浓缩成0.5 mg/mL作为新西兰兔免疫抗原。从新西兰兔耳根取血制备阴性血清，然后将100 μg抗原/兔溶入1 mL磷酸缓冲溶液，在1 mL福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂，并加入1 mL抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化。准备两只成年新西兰大白兔，在4个不同部位分别各注射约500 μL抗原溶液，间隔4～6周注射抗原，并在注射后的7-10 d收集血液，与注射前收集的血液进行比较，检查是否产生抗体。待确定产生抗体后准备大量收集血液。将收集的血液于37℃恒温箱中放置30 min，再在4℃放置过夜。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4℃ 14 000 r/min离心10 min，收集上清液即为抗血清，-20℃保存。

1.12 酶联免疫吸附法(ELISA)测定多克隆抗体效价

以10 ng/mL的人IgG包被ELISA 板各孔，洗涤后每孔内加入酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，测每孔吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8左右，且单孔读数与平均值的偏差小于10%，确定ELISA 板的性能。目的蛋白(0.5 mg/mL)用50 mmol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.0)分别以1∶250, 1∶500和1∶1 000稀释后，包被于96孔酶标板，每孔上样量为100 μL，放置于4℃冰箱包被过夜。PBST洗涤3次，5 min/次。每孔加入50～100 μL含1% BSA的PBS缓冲液，室温放置2～3 h，PBST洗涤3次。将SfCatL抗血清(一抗)进行系列稀释，从1∶1 000～1∶320 000设定了7个稀释梯度(2倍递增)，每个梯度设定2个重复，上述酶标板上每孔加入100 μL对应的稀释血清, 37℃孵育1 h，PBST洗涤3次后，加入HRP酶标二抗(1∶2 000)，37℃孵育1～2 h。洗涤后加入底物显色剂，室温避光处理15 min。每孔加入2 mol/L的浓硫酸，终止反应，最后在酶标仪上，以492 nm波长检测OD值，收集并分析数据。

网络时代科技发展日新月异，读心成为可能，生物传感技术、情感交互技术、人工智能技术等在网络时代社会调查领域的应用尤其值得关注。采用这些高科技，省去了提问的环节，受测试者不说话，机器也可以直接读出受测试者的心理活动变化数据，不可谓不神奇。

1.13 Western bolt检验抗体特异性

以1.10节培养的SfCatL重组菌体10 mL提取总蛋白，同时以课题组正开展的印楝素诱导昆虫细胞自噬凋亡机理研究的实验样品，印楝素诱导48 h和空白对照(未作诱导处理)的Sf9细胞为材料，分别提取总蛋白，SDS-PAGE胶电泳，再将蛋白从SDS-PAGE 胶上转移到硝酸纤维素膜上，然后用封闭液(PBST+5%脱脂奶粉)封闭过夜, 再与所制备的兔抗血清室温反应1.5 h，用PBST洗膜3次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶500, v/v)，室温反应1.5 h后洗膜3次，最后将硝酸纤维素膜置于含有二氨基联苯胺(DAB)的显色液中显色至条带清晰, 将膜放入蒸馏水中终止显色反应。

2 结果

2.1 草地贪夜蛾的组织蛋白酶L基因克隆

本研究抽提Sf9细胞总RNA，凝胶电泳检测可见到清晰18S rRNA带型(图1: A)，结果表明RNA抽提质量较好，未发生明显降解；RT-PCR获得Sf9细胞总cDNA，以其为模板，利用SexiCLP1和SexiCLP2引物进行扩增，获得1 000 bp左右的片段序列(图1: B)，序列测定，并用NCBI的BLAST程序进行序列比对分析，发现所获的扩增片段分别与甜菜夜蛾CatL基因序列一致性高达90%，表明所得即为草地贪夜蛾组织蛋白酶L基因序列，并将其命名为SfCatL。

为了获得SfCatL基因ORF全长序列，将所获的PCR产物切胶回收克隆到pEASY-T1克隆载体上构建SfCatL-pEASY-T1重组质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌trans1-T1，挑取阳性克隆提取质粒进行PCR鉴定，扩增出1 000 bp左右条带(图2: A)，再对所提质粒以BamHⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定，理论上酶切后的产物由两部分构成，一部分是外源片段，另一部分约为4 kb大小的质粒线性片段。由酶切电泳图2(B)可知，质粒双酶切后出现1 000 bp和4 kb两部分序列片段，与预测的结果相一致。证明为含有重组质粒的真阳性克隆。把阳性克隆菌液送测序，序列比对分析表明与上述扩增的目的片段序列一致，即得到SfCatL基因ORF全长序列(GenBank登录号: HQ110065)，长1 035 bp，编码344个氨基酸。

 

 

2.2 SfCatL氨基酸序列同源性分析

运用DNAStar和ClustalX2软件对SfCatL与其他物种CatL氨基酸序列进行同源性比对分析，结果表明包括草地贪夜蛾在内的14个物种的组织蛋白酶L的氨基酸序列共有104个保守氨基酸残基位点，其中7个保守的半胱氨酸残基(Cys, C)位点，进一步说明作为半胱氨酸酶类的组织蛋白酶其半胱氨酸残基在物种进化中非常保守。14个物种的CatL中保守性最强的氨基酸残基为甘氨酸(Gly, G)，有22个保守位点，其次为酸性氨基酸(Asp, D)，有10个保守位点(图3)，Gly也是本研究中SfCatL氨基酸序列含量最丰富的氨基酸残基。遗传距离分析表明，SfCatL与甜菜夜蛾的CatL氨基酸序列一致性最高，达96.8%，其次是棉铃虫CatL(一致性为89.7%)，与棉蚜CatL的氨基酸序列一致性最低(58.7%)；14个物种中与鲤鱼Cyprinus carpio CatL的氨基酸序列一致性最低(53.7%)。系统进化树将14个物种的CatL氨基酸序列分为五大类(图4)：第1类主要为鳞翅目昆虫的CatL，本研究中的SfCatL也聚到这类，与同属的甜菜夜蛾CatL氨基酸序列一致性最高。膜翅目的丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis也聚到第1类。鳞翅目各昆虫间CatL相对距离根据科属的不同差异较大，同属距离最近，不同属或不同科距离较远。第2类为半翅目和鞘翅目；第3, 4和5类分别为棉蚜、对虾Litopenaeus vannamei和鲤鱼。

 

2.3 SfCatL三维结构特征

由图5可知，SfCatL三维结构共有Cys166-Cys208等3个二硫键。SfCatL三维结构亲疏水性氨基酸分析表明，SfCatL折叠成紧密而稳定的元宝状结构，中间呈现一个凹槽，SfCatL亲水性氨基酸主要包被在蛋白的表面(如图5固体状表面)，而疏水性氨基酸主要分布在蛋白三维结构的内部(白色网状表面)，形成一个疏水性空穴。

 

 

2.4 SfCatL编码区内含子分析及其成熟肽序列的PCR扩增

草地贪夜蛾S. frugiperda Sf9细胞系由中山大学生命科学学院生物防治重点实验室惠赠，本实验室传代培养和保存。

 

2.5 原核表达载体的构建和克隆鉴定

扩增获得SfCatL成熟肽核酸序列，构建pET-28a(+)-SfCatL，经PCR检测获得1 000 bp左右的条带(7: A)，与理论大小基本相符合。挑选的pET-28a(+)-SfCatL阳性转化子经质粒小提后分别用SalⅠ和NdeⅠ进行双酶切鉴定，出现1 000 bp和5 kb两部分序列片段(7: B)，与预测的结果相一致。将PCR和酶切鉴定正确的SfCatL转化子进行核酸测序和分析，结果表明SfCatL编码区成熟肽序列片段为987 bp，结果与克隆所得的核酸序列相吻合。核酸序列翻译结果显示，SfCatL成熟肽含有327个氨基酸，分子量为36.8 kD，等电点为6.69。

 

2.6 SfCatL基因在大肠杆菌中的诱导表达

Nishimura Y, Kawabata T, Kato K, 1998. Identification of latent procathepsins B and L in microsomal lumen: characterization of enzymatic activation and proteolytic processing in virto. Arch. Biochem. Biophys., 261(1): 64-71.

2.7 SfCatL原核表达蛋白的可溶性分析

蛋白质可溶性分析表明(图9)，SfCatL(约37 kD)蛋白在上清没有目标蛋白带，而沉淀中有明显目标蛋白带，说明SfCatL在大肠杆菌表达系统中主要以不可溶的包涵体形式存在，0.2 mmol/L IPTG诱导产生的靶蛋白显著多于0.6 mmol/L IPTG诱导产生的蛋白。

经专利权人同意而销售的某个产品，在某些情况下其上涉及的专利会发生权利用尽，在某些情况下不会用尽而可能最多被视为是默示许可给了买方，此即所谓的“权利用尽规则区别适用理论”。

医院发展因面临形势、政策、自身所处阶段和员工的需求而出现变化。秦环龙表示，首先，根据申康中心“转方式、调结构、转机制”的要求，他提出五个转型，但这个五个转型是有前提、有基础的，就是学科的基本实力、医院软硬件的程度、内部运行管理水平等条件成熟，转型方可开始。“如果基础很差，就转型不过去；如果拖延，就耽误时机。就是要恰到好处、恰逢其时才能顺利转型发展。”其次，“申康绩效考核就像是一个指挥棒，让院长有抓手，进而推动医院的建设和发展，绩效考核的主要内涵，落地的就是我们五个转型的内容。”再次，医院自身由原来的粗犷型发展逐步转向内涵建设发展需求。

2.8 抗原的制备

抗原制备过程中收集菌体采用超声波破碎法将细胞匀浆，得到的菌体总蛋白进行SDS-PAGE电泳，切胶获取目标条带，采用电洗脱法，在电场作用下，将带负电的目标蛋白从凝胶中纯化出来，纯化产物的电泳结果显示SfCatL蛋白在40 kD左右(图10)，回收效率较好，2 L LB培养的重组菌，收集到包涵体，纯化回收得到的SfCatL蛋白约为3 mg，能够满足用于动物免疫所需的抗原。

 

 

 

2.9 抗血清制备与特异性鉴定

制备的抗血清采用间接酶联免疫吸附法包被相应的抗原，测定抗原的包被浓度与血清的效价，测定值如表1所示，固定SfCatL抗血清稀释比，随着包被SfCatL抗原的浓度越低(稀释度从1∶250～1∶1 000)，测定的吸光值逐渐增加；SfCatL抗血清做40 000倍稀释后，吸光度大于0.1，说明SfCatL抗血清具有很高的效价。为了鉴定所制备SfCatL抗血清的特异性，以Western blot法检测抗血清对大肠杆菌pET28表达的重组SfCatL蛋白的识别，结果显示(图11: A): 重组菌体总蛋白样品中，出现40 kD左右的唯一条带，与His和SfCatL形成的融合蛋白基本一致。继而本研究以课题组正开展的印楝素诱导昆虫细胞自噬凋亡机理研究的样品为材料，取印楝素诱导48 h处理组和空白实验组(对照)Sf9细胞分别提取总蛋白，以所制备的兔抗SfCatL血清，运用Western blot技术分析样品中SfCatL蛋白的表达情况。结果(图11: B)显示，48 h和对照的Sf9细胞总蛋白经过兔抗SfCatL血清和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 孵育显色后，在理论大小(37 kD)处出现唯一且清晰的条带，而且随着印楝素诱导时间的增加Sf9细胞SfCatL蛋白呈增加趋势，符合预测结果，综合表明制备的抗体既能识别大肠杆菌重组表达的SfCatL融合蛋白，同时也能特异性识别天然草地贪夜蛾SCL蛋白，故所制备的抗血清可用于草地贪夜蛾SfCatL基因功能的相关研究。

 

表1 间接ELISA检测SfCatL抗体效价Table 1 Detection of the antibody titer of SfCatL using indirect ELISA method

  

抗血清稀释梯度Dilutiongradient ofantiserumOD492值OD492 value1∶250*1∶500*1∶1 000*1∶10000.224±0.0030.266±0.0030.331±0.0291∶10 0000.538±0.0290.547±0.0050.594±0.0181∶20 0000.587±0.0210.622±0.0330.64±0.0161∶40 0000.201±0.0110.199±0.0730.304±0.0081∶80 0000.052±0.0540.047±0.0170.087±0.001 1∶160 0000.02±0.002-0.001±0.0080.009±0.005 1∶320 0000-0.017±0.005-0.018±0.001

*SfCatL稀释比Dilution ratio of SfCatL.

 

3 讨论

CatL基因在物种内和物种间的保守性都非常强，其在棉铃虫、烟夜蛾和甜菜夜蛾3种夜蛾科昆虫中同源性达90%以上。有研究根据棉铃虫Cathepsin B基因ORF序列两端直接设计引物能够克隆出同属的烟夜饿Cathepsin B基因ORF序列(赵艳艳等, 2008)。本研究中的Sf9细胞是从草地贪夜蛾卵巢中分离获得的细胞系，而甜菜夜蛾与草地贪夜蛾同属灰翅夜蛾属，所以甜菜夜蛾与草地贪夜蛾CatL基因的同源性更高，利用甜菜夜蛾的CatL基因ORF序列两端设计引物很可能直接克隆出草地贪夜蛾的CatL基因ORF序列。本研究证明这种通过生物信息学知识查找高同源性昆虫物种基因序列来设计引物直接克隆目标昆虫的对应基因的方法有很大的可行性。这种方法与传统的运用3′和5′ RACE法分段获得目的基因cDNA序列的方法相比，更节省实验成本和时间。

纯化原核表达蛋白是成功制备抗血清的关键环节之一，是当前高效纯化原核表达可溶性His标签融合蛋白的常用Ni柱纯化方法，该方法容易得到高纯度蛋白，操作简便，然而原核表达蛋白经常存在包涵体, 即表达产物蛋白质分子不能正确折叠而相互凝集形成不溶性的多肽聚集微粒—包涵体(杨亚东等, 1994)。包涵体中的蛋白必须经过变性使其成为可溶物，再经过重折叠复性处理方可部分恢复生物活性(张庶民和祁自柏, 1995)，因此，原核表达中包涵体的存在虽然不影响蛋白用于制备特异性抗血清，但给蛋白纯化增加了不同程度的复杂性，研究者需要通过变性、复性等方法处理包涵体，获得可溶性融合蛋白，再用凝血酶裂解融合蛋白，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳或Ni+柱(Ni-NTA)层析分离才能得到目的蛋白(Zhao et al.,1998; 苏晶晶等, 2015)。本研究SfCatL基因在大肠杆菌中能够大量表达，蛋白可溶性分析表明SfCatL融合蛋白同样以不溶性包涵体形式存在为主。为了制备高纯度的免疫抗原SfCatL，本研究采用了SDS-PAGE结合透析袋电洗脱法纯化方案，首先运用SDS-PAGE电泳对原核表达产物进行包涵体初步分离纯化，把目的蛋白与大部分杂蛋白分离，切胶回收目的蛋白，进而采用透析袋电洗脱法对目的蛋白进一步除杂，纯化得到适用于动物免疫的高纯度蛋白。该方法操作简单、方便、耗费少经济实用，被广泛用于包涵体目的蛋白的纯化(黄轶等, 2003)。

区域的位置决定着空间使用的效果，读者学习空间与交流空间既要隔离又要相对连贯。但在现有图书馆空间设计上，图书馆此两类空间往往采用玻璃墙进行分隔，隔音效果普遍较差，使得在交流空间举行研讨或小型讲座等活动时，对周边需要安静的读者学习产生不同程度的干扰。

制备昆虫组织蛋白酶特异性抗体，有助于研究该酶在昆虫体内的合成部位、组织分布及其时空表达情况，深入研究该酶的作用功能。 研究者利用 DEAE-纤维素和DEAE-Toyopearl离子交换层析法直接从棉铃虫中纯化Cathepsin B作为动物免疫抗原，制备该酶的抗血清，尽管由于免疫原纯度有限，难以得到高特异性抗体，但基本能用于分析该酶在虫体组织的分布及合成部位(徐夏莲等, 2001)，为了获得其高特异性的抗体，通过构建Cathepsin B原核表达载体在大肠杆菌中高表达该酶，然后纯化免疫抗原制备抗血清，所得抗血清不仅可以识别重组表达的棉铃虫Cathepsin B，而且可以识别棉铃虫卵巢匀浆液中的棉铃虫Cathepsin B(安晓萌等, 2004)。杨晓梅等(2004)进一步制备了该酶的单克隆抗体，这些抗体制备研究有力推动了Cathepsin B在棉铃虫个体发育过程的功能研究，如胚胎发育和变态发育等(杨晓梅等, 2005)。苏晶晶等(2015)也通过研究家蚕Cathepsin O基因原核表达特征，制备该酶的高效价多克隆抗体并以免疫印迹检测证实该抗体能识别家蚕重组表达的Cathepsin O。本研究成功制备了草地贪夜蛾SfCatL特异性抗血清并以免疫印迹检测证实该抗体能特异性识别草地贪夜蛾细胞SfCatL，结果将有助于系统而深入研究该酶在昆虫生长发育、代谢及农药杀虫机理中的作用功能。

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在很长一段时间内，隐喻被看成言语修辞格，通常被看成在修辞文体中使用的修辞手段。古希腊时期的亚里士多德作为隐喻研究的先驱，认为所有人都用隐喻来交谈。随着认知语言学的发展，隐喻被认为既是语言的修辞手段，也是思维方法及“认知工具”。1980年，George Lakoff和Mark Johnson在其著作《我们赖以生存的隐喻》（Metaphors We Live by）一书中提出隐喻的本质是通过另一类事物来理解和表达某一类事物，隐喻普遍存在于我们的思维、行为之中，在人类语言中无所不在，隐喻使得大部分抽象思维的表达成为可能。

严以修身，常怀“谨慎之心”。自划“警戒线”，做到“慎初”，始终坚定马克思主义信仰、共产主义信念，走好第一步，把好第一关；自设“防火墙”，做到“慎独”，做到八小时内外一个样、人前人后一个样、有没有监督一个样；自套“紧箍咒”，做到“慎微”，正确看待小与大的辩证关系，从小事小节中涵养大境界。

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虽然当前我国非常重视农村财务管理工作，并且制定了诸多的规定和要求，确保财务管理工作能够顺利进行。但是实际上，由于农村经济、历史等各方面因素的影响，导致农村财务管理人员素质较低，并且没有建立专门的对财务管理人员进行专业培训的制度机构，对于农村财务管理人员技能水平的提升也缺乏足够的重视，从而导致农村财务管理人员不能有效地管理农村财务［1］。

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前不久召开的全国教育大会，谋划了我国教育改革发展的宏伟蓝图，开启了教育现代化建设的新征程。习近平总书记在大会上的重要讲话，为新时代教育改革发展提供了根本遵循。江苏教育系统将坚决按照习近平总书记重要讲话精神和大会部署要求，坚持改革创新，加快推进教育现代化，努力写好新时代教育改革发展的“奋进之笔”。

为了明确目的基因编码区内是否存在内含子，根据已获得的目的基因ORF cDNA序列两端设计对应的特异性引物，正向引物SCLP1: 5′-ATGAAGGGCGTAGCGGTTCTG-3′和反向引物SCLP2: 5′-CTACACGAGGGGGTAGGAGGC-3′，以Sf9细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系和反应条件与1.5节一致。PCR条带与基因克隆过程的PCR产物电泳检测结果比较，如结果一致，将PCR产物送测序，DNAStar软件比对分析，如扩增产物序列与对应目的基因ORF序列一致，表明目的基因编码区没有内含子。

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重组菌株经0.6 mmol/L IPTG 28℃诱导培养表达后，总蛋白样品中出现40 kD左右的蛋白条带(图8)，大小与预测相符，而对照的样品中未出现类似条带，表明IPTG 也能够有效诱导SfCatL重组蛋白在大肠杆菌内表达。

项目化管理是企业在面对复杂多变的市场环境下进行市场营销的一项重要管理策略。企业在日常的营销过程中，应该把项目化管理理念和营销技术有机结合运用，并不断增强企业营销管理过程的系统性与科学性，这样，企业的市场营销才会更加具有竞争力，从而有利于企业的不断发展壮大。

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根据TaKaRa公司AMV反转录酶使用说明，在PCR管中加入1.3节提取总RNA 3 μL, Oligo(dT) 20 (50 μmol/L) 1 μL, dNTPs (each 10 mmol/L) 1 μL, RNase free H2O，补加到10 μL，置于PCR仪中65℃保持 5 min，取出于冰上急冷3 min，再在PCR管中加入5×Reverse Transcriptase Buffer 4 μL, RNase inhibitor (40 U/μL) 0.5 μL, PrimeScriptTM RTase (10 U/μL) 1 μL, RNase free H2O补加到20 μL，置于PCR仪中42℃保持 60 min, 70℃保持15 min，返回4℃停止，完成后直接用于PCR扩增或-20℃保存。

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树种的应用频率可以反映一个地区园林绿化树种资源应用情况,以及群落中的主要物种组成[10]。在本次调查的123种树种中,乔木占45.8%,灌木占32.2%,地被占22.0%。

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