蜜蜂是自然界最重要的授粉昆虫之一，也是一种高度结构化社会化的群体昆虫。近几十年来，随着环境的恶化以及农药的过量使用，蜜蜂的生存条件受到较大的影响。中华蜜蜂Apis cerana cerana作为我国的本土蜂种，有抗寒、抗病能力强，善于利用零星蜜源的特点(曾志将, 2003)，研究中华蜜蜂的抗逆生物学，对于保护中华蜜蜂种质资源有着深远的意义。活性蛋白AP-1属于核内二聚体转录因子，它可以通过介导或者抑制细胞的增殖与分化来决定细胞发育的命运(Morgan and Curran, 1991; Vojtek and Der, 1998; Kardassis et al., 1999)，1987年，其被命名为转录因子。AP-1转录因子是由原癌基因jun和fos以及转录因子亚基基因atf分别编码的Jun(c-Jun, JunB, JunD), Fos(c-Fos Fra1, Fra2, FosB)和Atf蛋白嵌合而成的二聚体复合物(Karin and Shaulian, 2001)，包括同源或异源Jun-Jun、Jun-Fos或者Jun-Atf(Foletta et al., 1998; Vesely et al., 2009; Shaulian, 2010; De Zoysa et al., 2010)。AP-1在胞内正常条件下活性很低，常以Jun同源二聚体形式存在，受刺激后迅速转变为 c-Fos/c-Jun异源二聚体形式，其诱导转录和结合DNA的能力也随之增加(Kristof and Marks-Konczalik, 2001; Guha and Mackhan, 2001; 李斌, 2011)。在细胞信号通路研究中，AP-1作为细胞内信号转导的枢纽，将细胞外刺激传入细胞核(Wisdom, 1999)。另外，AP-1转录因子作为c-Jun末端激酶(c-Jun N-terminal kinases, JNK)信号通路的重要组成部分，在JNK途径响应细胞各种压力，包括热休克、氧化应激和紫外线照射等外界刺激中发挥不可替代的作用(Shaulian, 2010)。目前，关于JNK途径，尤其AP-1在生殖发育中的作用机制的报道主要集中在哺乳动物上，在昆虫上的相关报道还较少。有研究表明，AP-1参与果蝇唾液腺程序性细胞死亡过程；在鳞翅目昆虫家蚕中也有报道AP-1参与丝腺程序性细胞死亡以及参与调控成虫眼睛和子代卵的发育(Yarza et al., 2016)。东方蜜蜂Apis cerana的基因组序列虽然已公布(Park et al., 2015)，但其对许多基因功能的研究仍然以预测为主，而基因克隆作为基因功能研究的必要基础，为研究基因功能提供了必要手段，也为以后研究AP-1信号通路奠定了基础。目前关于中华蜜蜂活性蛋白AP-1的研究基本处于空白阶段，有关AP-1基因在胁迫条件下的表达尚属空白。本研究通过克隆得到中华蜜蜂AP-1基因的序列，利用定量PCR技术对其时空表达以及各种胁迫处理条件下其表达量变化进行分析，进一步推测其功能，以期为该蛋白及其相关通路的深入研究提供理论依据。

假定x0=L/2处的裂纹为上表面裂纹,其他参数同上,图8给出了当Q∗=q=0.484 4时,不同CFRP布加固含量H2下,CFRP布加固简支上表面裂纹DF梁和无裂纹完整DF梁无量纲跨中挠度W(0.5,t∗)随无量纲时间t∗的响应,其中实线为完整DF梁,虚线为上表面裂纹DF梁.为比较方便,图中亦由点虚线给出了下表面裂纹DF梁的无量纲跨中挠度.可见,未加固和CFRP布加固完整/裂纹DF梁的无量纲跨中挠度W(0.5,t∗)随无量纲时间t∗增加而增大,并最终趋于定值.

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

实验用中华蜜蜂工蜂样本于2016年8月采集自山东农业大学试验蜂场，供试蜂群均为群势较强无病健康的蜂群。将中华蜜蜂工蜂按照日龄和蛹期眼的颜色分为11个时期(Robinson, 1992)，分别为1-6日龄幼虫期、预蛹、白眼蛹、红眼蛹、褐眼蛹、1日龄成蜂和15日龄成蜂。取15日龄成年工蜂，将其肌肉、表皮、毒腺、中肠、直肠和头部解剖分离，作为不同组织样品。所有样品取样之后立即置于液氮中冰冻，-80℃保存备用。

使用无毒无味的记号笔标记羽化出房的新蜂，在第15日龄时进行采样，将采集样本随机分组，每组40头，置于相对湿度70%、温度34℃的恒温恒湿培养箱中，并饲喂50%的蔗糖溶液(Alaux et al., 2010)。温度处理组蜜蜂分别置于4, 16和44℃条件下0(对照), 0.25, 0.5, 1, 2, 3和4 h(Liu et al., 2015)，并在处理过程中取样，取样在3 min内完成，取样后立即将剩余蜜蜂放回原处理条件下；农药处理组中，取0.1 μL百草枯(0.01 mL/L)置于10 mL 50%的蔗糖溶液中，进行饲喂，分别于饲喂后0(对照), 1, 2, 3, 4, 5和6 h内进行取样；重金属处理组中，称取适量CdCl2于50%蔗糖溶液中，配制成CdCl2浓度为1 mg/mL的蔗糖溶液，进行饲喂，分别在饲喂后0(对照), 1.5, 3, 4.5, 6, 12和24 h内进行取样。10头工蜂为一组进行解剖分离取不同组织。各处理均进行5次生物学重复。

1.2 总RNA的提取以及cDNA第1链的合成

各处理组中华蜜蜂蜂体以及各组织总RNA的提取均按照Total RNA Kit II试剂盒(购自OMEGA公司)的说明书进行，测定RNA浓度和纯度之后，按照Transcript First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Roche公司)说明书反转录合成cDNA第1链，-20℃保存备用。

1.3 基因克隆和测序

根据西方蜜蜂Apis mellifera转录因子AP-1基因(AmAP-1)mRNA的序列(GenBank登录号: XM_003250988)，利用Oligo和Primer 5.0 软件设计PCR引物(表1)，经NCBI Blast确定引物特异性，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR扩增反应体系(25 μL)：上下游引物各1 μL, cDNA 1 μL, dNTP 1 μL, Easy-Taq DNA polymerase 0.25 μL, Easy-Taq Buffer 2.5 μL, 双蒸水18.25 μL。PCR反应条件： 94℃预变性10 min； 94℃变性40 s, 50℃退火40 s, 72℃延伸1 min, 35个循环；72℃终延伸10 min。采用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收和纯化PCR产物，用pEASY-T3 Cloning Vector进行连接反应，将连接产物加入50 μL感受态细胞中进行转化，转化后的菌液在含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上倒置培养12～14 h。取白色单菌落于750 μL加有氨苄青霉素的LB培养基中培养，37℃ 200 r/min摇荡培养3 h。经菌液PCR验证后选取3个阳性克隆，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

Morgan JI, Curran T, 1991. Stimulus-transcription coupling in the nervous system: involvement of the inducible protooncogenes Fos and Jun. Annu. Rev. Neurosci., 14: 421-451.

1.4 生物信息学分析

将所得序列在NCBI中用Blastn(http:∥blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工具进行核酸序列的同源性分析，使用DNAMAN工具翻译其编码的氨基酸序列。利用在线工具NCBI Conserved Domains(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析保守结构域；ProtParam(http:∥www.expasy.ch/tools/protparam/html)预测蛋白的分子量、等电点等理化性质；利用DNAMAN软件进行氨基酸的多序列比对，采用MEGA5.2软件的邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统发育树；利用SWISS-MODEL(http:∥swissmodel.expasy.org/)进行蛋白质三级结构的预测。

技术人员、业务管理人员等都负有一定的成本控制责任，同时还享有成本控制的权力，对各部门在成本控制中的业绩进行定期的检查和考证，并与工资分配紧密挂钩，实行有奖有罚，才能达到预期的效果，实现对成本的控制.

1.5 荧光定量PCR反应

引物设计参照得到的中华蜜蜂AP-1的mRNA序列，用 Primer 5.0 软件设计引物序列，经过Blast确定引物特异性，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并以β-actin作为内参基因，内参基因可以稳定表达(表1)(Lourenço et al., 2008; Scharlaken et al., 2008; Li et al., 2012; Umasuthan et al., 2012)。反应体系 (20 μL)：上下游引物各0.5 μL, 灭菌双蒸水7 μL, SYBR 10 μL, cDNA 2 μL，混匀，离心，放入荧光定量PCR仪中进行扩增。反应条件：50℃ 2 min; 95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 60℃ 1 min， 40个循环。每个生物学重复每个基因设3个PCR反应。通过荧光定量PCR仪导出实验结果，得到目的基因与内参基因的Ct值。

 

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in the study

  

引物Primers 引物序列(5'-3') Primer sequence 引物用途Use of primersAccAP-1 FTTCAATCGTCACGCAGTGAGTC扩增CDS序列AccAP-1 RATATACGTCGGAGAGTCCCGCCDS amplificationAccAP-1 qFATTGCTAAAGGGCGAGAACAAccAP-1 qRGCCATGATCTGACAACCAGA实时荧光定量PCRβ-actin-qFTTATATGCCAACACCTGTCCTTTRT-qPCRβ-actin-qRAGAATTGATCCCACCAATCCA

1.6 数据分析

根据实验所得各样品的目的基因和β-actin的Ct值，利用 2-ΔΔCt方法(Michael, 2001)进行计算。采用SAS软件进行单因素方差分析，并选用Duncan氏多重比较法进行显著性差异分析。所得结果均以平均数±标准误(mean±SE)表示，并利用OriginPro 9.0软件进行图像处理。

2 结果

2.1 中华蜜蜂转录因子AP-1基因的克隆与序列分析

以中华蜜蜂全组织cDNA为模板进行扩增，得到开放阅读框(ORF)的序列，该序列大小为813 bp(GenBank登录号: MF994311)(图1)。将该序列在NCBI中进行BLASTN比对，与西方蜜蜂AmAP-1(GenBank登录号: XM_003250988)核苷酸序列一致性为97%，因此命名为AccAP-1。

621 慢性肾脏病患者冠状动脉钙化影响因素分析 易 扬，路建饶，吴 好，马 骏，赵颖丹，宣 怡，刘文瑞

 

利用DNAMAN对AccAP-1基因序列进行氨基酸翻译，推测碱基共编码270个氨基酸(图2)。预测分子量大小为30.24 kD，理论等电点为8.31。在组成AccAP-1蛋白的19种氨基酸中，丝氨酸(Ser)所占比例最高，达10.4%。总平均疏水系数(GRAVY)为-0.591，不稳定系数为49.43，脂溶系数为81.19。利用 NCBI的Conserved Domains对AccAP-1的氨基酸序列进行分析，结果表明，AccAP-1编码氨基酸产物的第7-137位氨基酸之间存在1个Jun超家族的保守结构域;在195-255位氨基酸之间存在1个bZIP_Jun超家族的保守结构域。

 

2.2 中华蜜蜂转录因子AP-1基因的序列比对与进化树分析

推动式压电驱动器结构如图2所示[3]，基本步进原理与行走式类似，但区别在于行走式压电驱动器中压电驱动机构是动子，而推动式压电驱动器中压电驱动机构是定子，驱动机构推动一根输出杆(主轴)输出位移。

2.3 中华蜜蜂转录因子AccAP-1 mRNA时空表达分析

为了进一步探明AccAP-1基因在蜜蜂生长发育过程中的作用，我们研究了AccAP-1在中华蜜蜂不同发育时期与不同组织中mRNA的表达情况。结果表明，AccAP-1在不同发育时期的表达量差异显著(P<0.05)，其中在幼虫期以1日龄幼虫表达量最高，并且在幼虫期，其表达量随着日龄的增加而降低；在预蛹、白眼蛹与红眼蛹期时，表达量无差异，然而从黑眼期，表达量迅速提高，在15日龄成蜂表达量达到最高(图5: A)。成蜂不同组织中AccAP-1基因的表达分析结果表明，AccAP-1基因在肌肉中的表达量显著高于在其他组织中(P<0.05)，而在头部、中肠、直肠、表皮和毒腺中的表达量并无差异(图5: B)。

2.4 中华蜜蜂转录因子AP-1基因在不同非生物应激条件下的表达分析

为了研究AccAP-1基因在中华蜜蜂抗逆生物学上的作用，我们研究了中华蜜蜂在极端温度、重金属(CdCl2)和百草枯处理下AccAP-1的表达量变化。结果表明，在4℃条件下，AccAP-1基因的表达量在不同处理时间点差异显著，随着处理时间增加，表达量迅速升高，在2 h时表达量达到最高(图6: A)。在16℃处理时，AccAP-1基因表达量随着处理时间增加，出现一个先升高后降低的趋势，在处理后1-2 h表达量达到峰值，2 h后表达量逐渐下降，5 h时表达量与对照组无差异(图6: B)。在44℃处理时，在0.25 h时，AccAP-1表达量显著降低，随后表达量升高，但在0.5-4 h表达量差异不显著(图6: C)。

 

 

 

重金属处理结果表明，饲喂中华蜜蜂含有CdCl2的蔗糖溶液后，其表达量随着时间的推移，在0-12 h出现一个逐渐上升的趋势(图6: D)。对于农药处理，在饲喂含有百草枯农药的蔗糖溶液后，我们可以看出其表达量呈现下降的趋势(图6: E)。

3 讨论

本研究克隆得到了AccAP-1 ORF序列，利用多种工具进行氨基酸序列的翻译与比对，氨基酸序列比对结果表明，中华蜜蜂与西方蜜蜂A. mellifera和东方蜜蜂A. cerana的一致性最高，达99%；进化树分析也表明中华蜜蜂先与东方蜜蜂聚在一起，然后与西方蜜蜂聚在一起，聚类结果与物种分类一致。利用NCBI对其保守结构域进行分析，表明氨基酸第195-255位为bZIP_Jun超家族的保守结构域，该结构域为类Jun或Jun蛋白碱性亮氨酸拉链的基本结构区域，主要发挥DNA结合与二聚化的作用，且转录因子AP-1是一种由Jun和Fos两大类蛋白家族及活性转录因子亚基ATF组成的复合物。

为了进一步研究AccAP-1基因的功能，对中华蜜蜂不同组织与不同发育时期AccAP-1的表达量进行了分析。结果表明，AccAP-1在幼虫期的表达量是高于蛹期的表达量，在幼虫期随着日龄的增加，其表达量也出现一个下降的趋势，但在由幼虫期转变成蛹期和由蛹期转变成成蜂时，其表达量会有一个升高的趋势，这可能是由于幼虫及不同时期转变时其细胞活力大的原因(Liu et al., 2015)。而在成蜂期，其表达量又出现一个上升的趋势，我们推测这是由于其生存环境发生了改变，受到了自然条件下紫外、冷热刺激和其他一些条件的影响(Kottuparambil et al., 2012)。成蜂不同组织中的表达分析结果表明，AccAP-1在肌肉中的表达量是远远高于在其他中，原因可能是由于肌肉是消耗氧气的最重要的组织，其受到的氧化应激也是最严重的，肌肉作为抵抗氧化应激的最重要的组织发挥了巨大的作用。

温度被认为是可以造成机体生理变化的一个重要因素(Liu et al., 2015)。蜜蜂在极端温度下AccAP-1基因表达量的变化的结果表明，在低温4℃条件下，AccAP-1基因的表达量出现一个明显的升高趋势，在同样对于中华蜜蜂来说为低温的16℃，其表达量也出现一个明显升高的趋势，然而随后又逐渐降低，这说明蜜蜂在可能会上调AccAP-1基因的表达量来应对低温刺激，对于相对温和的16℃，其反应也相对温和，而16℃处理2 h后出现表达量降低的原因可能是由于蛋白与基因表达不同步造成的；在44℃高温条件下，其表达量先出现一个下降趋势，而后基本维持稳定的状态，与对照差异不显著，这表明AccAP-1基因对低温刺激的反应要比高温刺激更加敏感，我们推测该基因在中华蜜蜂抗寒上发挥重要作用。在自然界中汞和镉作为最具毒性的重金属(Liu et al., 2015)，它们可以直接与酶的金属离子结合位点结合从而使蛋白失活(Li et al.,2016)。随着环境污染的加剧，蜜蜂在采集过程中不可避免地会受到其影响。在本研究中，我们通过给蜜蜂饲喂含有CdCl2的蔗糖溶液，来探究重金属对蜜蜂的影响，结果表明：蜜蜂采食了含有CdCl2的蔗糖溶液之后，AccAP-1基因的表达量随着时间的推移逐渐升高，在12 h时表达量最高，说明该基因或许存在抵御重金属侵害的作用。农药的过量使用是环境污染的一个重要因素。有研究表明，农药可以损害淋巴细胞和红细胞的生理生化功能，导致生物膜损伤(Narendra et al., 2007)。在给中华蜜蜂饲喂含有百草枯的蔗糖溶液后，AccAP-1基因的表达量迅速降低，说明该基因在受到农药侵害时或许也发挥着作用。AP-1参与多条信号传导通路，还调控着大量免疫相关基因的表达(Fan et al., 2004)，本研究通过研究AP-1基因在中华蜜蜂不同发育时期和组织以及胁迫条件的表达，为深入探讨该基因在胁迫过程中的作用机制奠定了理论基础，为相关通路的研究提供理论依据。

 

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将克隆所得AccAP-1核酸序列在NCBI核酸数据库中进行BlastX分析，找到与目的基因有同源性的其他昆虫的氨基酸序列，利用DNAMAN对其氨基酸序列进行同源性比对。结果显示，中华蜜蜂AccAP-1与已报道的东方蜜蜂Apis cerana及其他昆虫的转录因子AP-1的氨基酸序列相似性较高，其中与西方蜜蜂Apis mellifera和东方蜜蜂的AP-1氨基酸序列一致性高达99%，其次是与墨西哥兰花蜂Eufriesea mexicana AP-1，氨基酸序列一致性达95%(图3)。采用MAGA 5.2软件构建进化树，结果表明，中华蜜蜂与东方蜜蜂的转录因子AP-1基因聚成一支，该支进一步与西方蜜蜂聚成一支，聚类结果与传统物种分类一致(图4)。

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中华人民共和国宪法中有对人格权做了一定的规定，宪法第38条规定：“中华人民共和国公民的人格尊严不受侵犯。”第39条规定：“中华人民共和国公民的住宅不受侵犯。”第40条规定：“中华人民共和国公民的通信自由和通信秘密受法律的保护。”人格权中包括隐私权，且住宅、通讯等都属于个人的隐私信息。宪法是一个国家的根本大法，宪法作为根本大法不可能细致到调整人身权中具体人格权的地步,而且我国也没有所谓的宪法法庭，它对人格权（包括隐私权）的保护属于形式保护,并不具备实质保护的条件。

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上林路站是16号线和1号线二期车站的换乘站，位于世纪大道与沣泾大道交汇处。1号线二期上林路站为地下二层、宽11 m的岛式站台标准站，沿世纪大道东西向敷设。该站在设计时，未考虑与其它线换乘，未预留换乘节点，因此需后期接入改造。目前,该站的围护桩、冠梁、挡墙已施工完成,一、二段底板已浇筑。世纪大道与沣泾大道的十字路口四个象限均有在建楼盘，十字路口北侧约300 m处有上林大桥。

管理并非空话。这17所小寺小庙规模小，而且大多是最近十来年内新建的，既没有出家僧人住持，也没有成熟的管理团队，当然，与宗教有关的法律法规的知识、观念和意识也十分薄弱。这些状况，让民族团结、宗教和谐存在很大隐患。

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测试结果显示，根据陀螺奇偶输出的相关性进行零偏抵消之后，其零偏及稳定性得到改善.相比于同等条件下的传统陀螺，本实验中光程倍增光纤陀螺本身已经有较好的精度，并根据其奇偶输出表现出的负相关性，进一步进行零偏抵消，能够进一步把零偏稳定性控制在0.005°/h内.

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Why does toothpaste look like cosmetic products ? 7 4

3．借款人提供信息不实。P2P网络借贷平台在互联网上进行，部分不法分子以虚假身份在多家借贷公司发布信息。如果经营者没有核实好贷款者信息或者没能及时发现并处理这一问题，虚假信息就出现在平台中，贷款者可能利用非法资金投资房地产、股票、债权、期货等行业。部分平台还与虚假贷款者合作，获取中间利益。

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党的十八大以来，以习近平同志为总书记的党中央站在战略和全局的高度，对生态文明建设提出一系列新思想、新论断、新要求，为努力建设美丽中国、实现中华民族永续发展、走向社会主义生态文明新时代指明了前进方向和实现路径。生态文明建设被提到中国发展的重要日程，成为今后一个时期党和各级政府的工作重心。我国有2800个县（市），县域生活着大部分人口，是国家最基本的经济社会单元；县域涵盖城镇与乡村，是承上启下、沟通条块、结合城乡的枢纽。以县域为基础开展生态文明建设有着非常重要的意义，将对中国生态文明建设的宏观进程和总体效果产生积极影响。

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因此，作为一种地域文化，峨眉武术必须在继承过程中整合该地区的文化资源和文化特色，“打造地域特色文化符号象征，使武术在不同地区的发展过程中逐渐融入当地文化，形成统一的整体区域文化形态。”[11]

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