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人参皂苷Rg1对NAFLD动物模型中同型半胱氨酸的调控机制

更新时间:2009-03-28

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是全世界最常见的肝脏疾病,主要包括单纯性非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、以及部分转变生成的肝硬化和肝癌等[1-2],其病理改变主要表现为肝小叶出现弥漫性肝细胞脂肪变性.临床表现上轻度无明显症状,中度和重度患者可出现肝区隐痛、全身乏力、腹泻等症状[3].研究证实,动脉粥样硬化的独立危险因子同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平与NAFLD相关,NAFLD患者血清的Hcy含量明显高于正常水平[4];NAFLD中Hcy的增加与转化Hcy的关键酶MTHFR和CBS的表达和活性密切相关[5-7].因此,寻找促进MTHFR和CBS表达的相关药物,将有助于NAFLD中Hcy的降低,从而预防和治疗NAFLD所引起的心血管并发症.

人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1)是人参和三七中含量较多的活性物质,具有抗炎症和抗氧化等特点.然而,在NAFLD中,人参皂苷Rg1是否降低Hcy及其机制未见系统报道.因此,本研究通过建立NAFLD动物模型,探讨人参皂苷Rg1对Hcy的调控及相关的分子机制,为人参皂苷Rg1治疗NAFLD的心血管并发症提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠由昆明医科大学实验动物中心提供,实验动物饲养条件:恒温(22±2)℃,恒湿(55±5)%,光照明暗各12 h.

1.1.2 主要试剂 人参皂苷Rg1(昆明医科大学药学院);大鼠Hcy测试试剂盒(Bio-Swamp Life Science Lab);MTHFR、CBS 一 抗(Santa Cruz);二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司);ECL增强发光液(Millipore Corporation)等.

本文通过加载幅流风机和改变送风温度,设计了3种不同工况,建立了1∶1的实车模型和人体模型,借助计算流体动力学(CFD)数值模拟方法研究送风速度和温度对满载地铁车厢乘客舒适度的影响。研究结论有助于合理调整空调出风温度和速度,进而达到既舒适又节能的效果。

2.1.3 NAFLD动物模型的油红“O”染色 为了进一步确定模型对照组中的空泡是否为脂肪,对正常对照组和模型对照组进行油红“O”染色,结果显示:正常对照组未出现油红“O”的沉淀(图2A),模型对照组存在大量的油红“O”的累积(图2B).

1.1.3 主要设备 冰冻切片机Leica CM 1950(Leica BiosystemsNussloch GmbH);直流电泳仪(北京六一仪器厂);全波段酶标仪(Thermo Fisher Scientific);免疫印迹组件及垂直电泳转印系统(Bio-Rad Laboratories Inc);X光胶片暗匣(汕头市粤华医疗仪器厂)等.

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 180~220 g的雄性SD大鼠40只,适应性喂养2周后,随机分为:(1)正常对照组;(2)模型对照组;(3)人参皂苷Rg1低剂量治疗组;(4)人参皂苷Rg1高剂量治疗组.每组10只.正常对照组给予正常饮食饲养,模型对照组、人参皂苷Rg1低剂量治疗组和人参皂苷Rg1高剂量治疗组给予高糖高脂饮食14周后,人参皂苷Rg1低剂量治疗组和人参皂苷Rg1高剂量治疗组分别采用30 mg/(kg·d)、60 mg/(kg·d)的人参皂苷Rg1灌胃治疗8周,治疗期间,模型对照组、人参皂苷Rg1低剂量治疗组和人参皂苷Rg1高剂量继续给予高糖高脂饮食.治疗完成后,各组空腹12 h后分别麻醉,心脏取血,4 000 r/min,离心5 min获得血清;肝脏组织-80℃保存.

1.2.2 正常对照组和模型对照组的TG和TC测定正常对照组和模型对照组取血清利用全制动生化分析仪测定TG和TC的含量,操作严格按说明书进行.

1.2.3 正常对照组和模型对照组的肝脏组织HE染色 取一块肝脏组织放入10%多聚甲醛中固定24 h,自来水冲洗30 min,后经过脱水透明、石蜡包埋、切片等一系列操作,进行HE染色.用光学显微镜观察肝脏组织的形态学结构及其各组的改变.

1.2.4 正常对照组和模型对照组的肝脏组织油红染色 冰冻切片干燥后放入50%乙醇稍洗,油红“O”乙醇染液染色8 min,50%乙醇分化,自来水终止分化,苏木素复染核,自来水返蓝,甘油明胶封片,在光学显微镜下观察.

Western blot的结果显示,与正常对照组相比,模型对照组中的MTHFR、CBS的蛋白表达下调(P<0.05),结果表明,在NAFLD动物模型中,Hcy的浓度上调可能是因为MTHFR和CBS 2种酶的蛋白质表达下降,从而导致Hcy的转化降低.与模型对照组相比,人参皂苷Rg1治疗组的MTHFR和CBS的蛋白表达上调(P<0.05).结果表明,在NAFLD中,人参皂苷Rg1降低Hcy的作用可能与促进MTHFR和CBS两种酶的蛋白质表达升高有关,见图5.

桡骨远端骨折容易引起腕关节不稳定情况,当桡骨远端关节内骨折时,患者骨关节面完整性受到破坏,再加上倾斜角发生很大改变,而患者的腕关节骨性结构也发生异常。这都是由于腕关节不稳定造成。所以,骨折致腕部损伤,而腕骨结构发生异常都会导致腕关节不稳定。

1.2.6 各组肝脏组织免疫组织化学检测 冰冻切片柠檬酸抗原修复,PBS冲洗3次,每张切片各自滴加一抗(MTHFR 1:100;CBS 1:100),4℃孵育过夜;PBS冲洗3次后滴加即用型快捷免疫组化酶标羊抗鼠/兔IgG抗体,38℃孵育15 min;PBS冲洗3次后新鲜配制的DAB溶液显色,10~30 min后用自来水冲洗终止显色;苏木素复染1 min、盐酸酒精分化约15 s后自来水冲洗15 min;酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固,在光学显微镜下观察.

2.1.1 TG和TC的含量 在采用高糖高脂饮食饲养SD大鼠14周后,与正常对照组比较,模型对照组TG、TC浓度增加(P<0.05),见表1.

1.3 统计学处理

2.1.2 NAFLD动物模型的HE染色 正常对照组肝细胞形态排列正常,肝小叶结构清晰、整齐,细胞核大而圆并整齐排列在细胞中央,细胞质均匀(图1A);模型组对照组肝细胞排列异常、紊乱,部分细胞出现大小不等的空泡,脂肪细胞的数目明显增多,呈现一定程度的脂肪变性,但未发现有纤维化改变(图1B).

免疫组化的结果显示,MTHFR、CBS在肝细胞胞浆内表达,呈现棕色.与正常对照组结果相比较,模型对照组中MTHFR和CBS的蛋白质表达下降,光密度降低(P<0.05);人参皂苷Rg1治疗组MTHFR、CBS的蛋白质表达增多,光密度增加(P<0.05),且存在剂量依赖性,见图4.

2 结果

2.1 NAFLD动物模型的建立

1.2.7 各组肝脏组织Western blot检测 剪取100 mg肝脏组织加RIPA裂解液1 mL,PMSF10 μL磨碎组织提取蛋白,采用BCA定量法测定蛋白浓度,取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳后,根据目的因子分子量大小进行切胶,半干转移法转至PVDF膜,5%牛奶封闭液常温摇床封闭2 h,后分别加一抗MTHFR、CBS(1:500)4℃过夜.用适量TBST缓冲溶液漂洗3次后加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠的二抗(1:10 000),常温摇床慢摇2 h后洗膜3次,加ECL发光试剂,曝光.以β-actin为内参,计算MTHFR、CBS的蛋白相对表达量.每组重复次数至少为3次.

所有数据采用SPSS软件进行统计分析,计量资料数据经正态检验均为正态分布(P>0.05),用均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),如果有差别用q检验进一步进行组间两两比较,2组间比较用成组t检验,P<0.05,为差异有统计学意义.

 

表1 TG和TC的浓度(±s)Tab.1 Concentration of TG and TC(±s)

  

与正常对照组比较,*P<0.05.

 

组别 组别甘油三酯(mmol/L)总胆固醇(mmol/L)正常对照组 1.208±0.1047 1.380±0.0510模型对照组 1.920±0.09267* 1.890±0.09267*

  

图1 肝脏HE染色(×40)Fig.1 HE staining in liver tissue(×40)

 

A:正常对照组肝组织HE染色;B:模型对照组的肝组织HE染色.

4)沿填筑好的砾石外侧坡面填筑一层粗砂反滤层,粗砂反滤层高度与砾石反滤层齐平,顶宽0.5 m,外侧边坡为1∶2,要求粗砂粒径d=2~8 mm。

  

图2 肝脏油红“O”染色(×40)Fig.2 Oil red"O"staining in liver(× 40)

 

A:正常对照组油红“O”染色;B:模型对照组油红“O”染色.

2.2 Hcy浓度

与正常对照组比较,模型对照组的Hcy浓度增加(P<0.05),与模型对照组比较,人参皂苷Rg1治疗组的Hcy浓度降低.结果提示,在NAFLD条件下,Hcy的含量增加,人参皂苷Rg1治疗可降低Hcy浓度,见图3.

  

图3 血液中Hcy的浓度Fig.3 Concentration of Hcy in the blood

 

与正常对照组比较,#P<0.05;与模型对照组比较,*P<0.05.

2.3 MTHFR、CBS蛋白质在肝细胞内的表达

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2.4 MTHFR、CBS蛋白质的表达

1.2.5 各组Hcy测定 取血清采用ELISA的方法测定Hcy的浓度,操作严格按说明书进行.

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3 讨论

NAFLD已成为严重的全球健康问题,据估计世界25%的成年人口受到影响[8].NAFLD病因复杂,目前,其发病机理尚不能以单一的机制来解释,最令人接受的理论为Day CP等提出的“二次打击学说”[9].研究表明,在NAFLD中,其重要特点是TG在肝脏中的积累,导致出现的肝代谢紊乱,从而由单纯性脂肪变性过渡到脂肪性肝炎和肝硬化.因此,采用高糖高脂饮食是诱导NAFLD发生和发展的主要方式.本实验通过给予SD大鼠高糖高脂饮食14周,检测NAFLD显示,与正常对照组比较,模型对照组TG、TC浓度升高,肝脏的结构紊乱,出现大量的空泡,油红“O”染色脂质沉积明显,结果表明NAFLD模型建立成功.这与大多数研究的NAFLD造模结果一致[10-11].

(4)在方案实施过程中,由于复杂的工程地质和水文地质的情况,当设计支护参数和实际的地质状况有差异时,需及时调整支护参数,并采取必要的工程措施。

  

图4 肝脏细胞中CBS、MTHFR蛋白的表达(×40)Fig.4 Protein expressions of CBS and MTHFR in liver cell(×40)

 

A:正常对照组CBS的表达;B:模型对照组CBS的表达;C:人参皂苷Rg1低剂量治疗组CBS的表达;D:人参皂苷Rg1高剂量治疗组CBS的表达;E:正常对照组MTHFR的表达;F:模型对照组MTHFR的表达;G:人参皂苷Rg1低剂量治疗组MTHFR的表达;H:人参皂苷Rg1高剂量治疗组MTHFR的表达.与正常对照组比较,#P<0.05;与模型对照组比较,*P<0.05.

  

图5 肝脏组织中CBS、MTHFR蛋白的表达Fig.5 Protein expressions of CBS and MTHFR in liver tissue

 

与正常对照组比较,#P<0.05;与模型对照组比较,*P<0.05.

在NAFLD中,动脉粥样硬化导致的心血管并发症是其晚期的主要表现之一,Hcy作为动脉粥样硬化独立的危险因子与NAFLD发生和发展密切相关,研究表明,在NAFLD中,Hcy的含量明显增加[4],Hcy的升高与Hcy转化的酶MTHFR、CBS和CSE等表达和活性相关[6,12-13],在本实验研究中,NAFLD模型对照组的Hcy浓度升高,MTHFR与CBS蛋白在肝脏细胞的表达降低,这与上述报道是一致的.

在NAFLD伴随Hcy增加的研究中,通过调节相关转化酶降低Hcy报道较少,笔者的前期研究发现,在高同型半胱氨酸血症中,存在肝脏的脂肪变性[14];利拉鲁肽可通过增加CBS表达,降低NAFLD中的Hcy[6].所以,寻找增加Hcy转化酶的表达和活性的物质,将有助于预防和治疗NAFLD所引起的心血管并发症.来源于人参和三七的人参皂苷Rg1具有抗炎症反应和抗氧化应激等作用[15-16],同时在NAFLD的模型中,人参皂苷Rg1也可以通过调节脂质代谢的酶,降低TC和TG含量[17].然而,人参皂苷Rg1能否降低NAFLD中Hcy含量及机制未见报告.因此,本实验中对NAFLD的动物模型给予人参皂苷Rg1治疗,检测Hcy含量和转化的关键酶MTHFR、CBS的表达.结果发现,人参皂苷Rg1治疗后Hcy浓度降低,MTHFR与CBS的蛋白表达上调.结果表明,人参皂苷Rg1可能通过增加MTHFR和CBS的蛋白表达,降低NAFLD中Hcy含量.

总之,在NAFLD中存在Hcy含量增加,其机制可能与MTHFR和CBS的表达下调有关;人参皂苷Rg1降低NAFLD的Hcy含量可能是通过增加MTHFR和CBS的蛋白质表达.

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侯云鹤,张皓鑫,王依雨,苏艳梅,顾丹珊,林少芳,杨世昆,李树德
《昆明医科大学学报》2018年第04期文献

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