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过氧化氢诱导HUVECs氧化应激模型的构建

更新时间:2009-03-28

冠心病在全世界范围内具有高发病率和高死亡率,发生的首要原因是动脉粥样硬化,内皮细胞损伤是动脉粥样硬化的始发事件,常与内皮功能紊乱相关,而氧化应激是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)发展的重要原因[1].氧化应激是指机体在遭受各种刺激时,促氧化剂和抗氧化剂间的平衡被打破,活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)过度表达诱导凋亡,导致内皮细胞受损[2].过氧化氢(H2O2)极易透过细胞膜,与细胞内铁离子形成高活性的自由基,是引起血管损伤的主要成分,H2O2易于获得,性质稳定,是研究氧化损伤的重要工具[3].

既往有研究利用H2O2成功构建心肌细胞、肝细胞等氧化应激模型,但作用浓度均较低、作用时间均较短[4-5],本研究应用不同浓度过氧化氢作用不同时间,诱导HUVECs构建体外氧化应激细胞模型,筛选出理想H2O2浓度和时间,为相关研究提供可靠的细胞模型.

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

30%过氧化氢(分析纯,广东西陇化工公司)、Tunel试剂盒(Roche公司,美国)、CCK-8检测试剂盒(南京凯基公司)、ROS检测试剂盒(北京普利莱公司)、EA-hy926细胞株(中国科学院上海细胞库)、流式细胞仪(Beckman Coulter公司,美国)、酶标仪(ThermoScientific公司,美国).

1.2 细胞株复苏

常温复苏EA-hy926脐静脉内皮细胞株,含FBS 20%、1%青/链霉素、1%谷氨酰胺的DMEM完全培养基、37℃、5%CO2培养箱培养,每2~3 d换液,对数生长期细胞用于实验.

1.3 模型构建-细胞分组及干预

实验细胞随机分为对照组和实验组.

根据远期快车及慢车客流预计,远期早高峰快车客流最高断面约1.25万人次/h,慢车客流最高断面约3.83万人次/h。13号线列车采用8节编组的A型车,其列车定员为2 136人/列,因此远期高峰小时行车量需按照快车6对/h、慢车18对/h开行(其中,12对/h的慢车在深莞边界的公明北站折返),交路图如图3所示。

1.3.2 时间效应干预 通过剂量效应筛选出H2O2最佳作用浓度,与HUVECs共同培养6 h、12 h、24 h、48 h,筛选最佳作用时间.

1.4 倒置相差显微镜下观察各组H2O2处理后的细胞形态

1.4.2 流式细胞仪TUNEL法检测细胞凋亡 细胞(1×106/mL)500 r/min室温离心2 min,加入200 μL 4%PFA,4℃放置30 min,700 r/min室温离心3 min,加入70%酒精200 μL,-20℃放置30 min,700 r/min室温离心3 min,同一样品分为2管,分别加入TDT反应液及阴性对照液各30 μL,37℃孵育1 h,含0.2%BSA的PBS洗涤,700 r/min室温离心 3 min,加入 10 mg/mLRANse 20 μL、0.1%Triton 200 μL,37℃孵育 15 min,加入 100 μg/mLPI染液1 mL,避光15~30 min,24h内上机检测.

1.4.1 CCK-8法检测细胞的存活率 细胞接种于96孔板(1×102/孔),每孔 100 μL,共设6组,每组3个重复孔,常规培养,80%融合时加不同浓度H2O2分别处理;吸去上清液,加入 10 μL CCK-8试剂,继续孵育2 h,酶标仪于450 nm波长处测定各孔吸光度,用该值代表细胞活性.

1.4.3 细胞内ROS检测 2×104细胞接种于6孔培养板中,加H2O2分组处理后,弃原培养基,原位装载探针37℃、5%CO2培养箱内孵育60 min;阳性对照组加入试剂盒阳性对照试剂37℃孵育60 min;PBS洗涤2次,胰酶消化,1 000 r/min离心3 min,加入3 mLPBS重悬细胞,流式细胞仪检测.

1.5 统计学处理

使用SPSS软件进行统计分析,计量资料用(±s)表示,各组差异比较采用 One-Way ANOVA方差分析,有统计学意义时,进一步用LSD法做两两比较.P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 H2O2对HUVECs形态的影响

正常HUVECs呈单层鹅卵石镶嵌状紧密排列,边界清楚,胞核位于细胞中央,核仁1~2个(见图1A);实验组细胞缩小、胞膜皱缩、间隙增大、胞核增大,大多数胞浆有暗色颗粒,部分细胞上浮,典型排列受到不同程度的破坏,球形或椭圆形细胞数量随H2O2作用时间和浓度增加而增多,表明H2O2对HUVECs具有损伤作用(图1B、图1C、图1D).

1.3.1 剂量效应干预 实验组分为6个浓度梯度:100 μmol/L、 200 μmol/L、 400 μmol/L、 600 μmol/L、800 μmol/L、1 000 μmol/L,对照组不加任何药物.

  

图1 H2O2对HUVECs形态的影响(40×)Fig.1 The effect of H2O2on morphology of HUVECs(40×)

 

A:正常对照组;B:H2O2400 μmol/L处理 24h;C:H2O2800 μmol/L处理 24 h;D:H2O21 000 μmol/L处理 24 h.

2.2 不同浓度H2O2对HUVECs存活率的影响

安和庄所属下意识地向魔刀投去一瞥,因为“魔刀落花鬼王魂,玉面催心煞手恨,铁旗高风无回掌,纤手神指离梦人”魔刀在十二高手榜排名第一,天问大师排名第九,所以萧飞羽点头出手非魔刀莫属。

氧化还原平衡的功能紊乱在2型糖尿病及其并发症过程中发挥着重要作用,糖尿病患者体内ROS及ROS诱导的DNA损伤在细胞水平也明显升高.氧化应激引起的胰岛素抵抗和氧自由基对胰岛β细胞的损伤是2型糖尿病的发病机理之一.随着ROS的聚集,4条生化通道被激活:多元醇、糖基化末端产物、蛋白激酶C活化及氨基已糖通道[9].ROS作为细胞内信使激活许多氧化还原敏感性信号通路,导致胰岛素抵抗,临床上表现为胰岛素敏感组织葡萄糖摄取减少,抑制肝葡萄糖输出作用减弱,机体对胰岛素的反应降低,糖代谢紊乱,糖尿病持续进展与恶化[10].

2.2.1 剂量效应实验 100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L、800 μmol/L、1000 μmol/L H2O2分别作用HUVECs 24 h,当H2O2浓度≤200 μmol/L时,细胞存活率具有下降趋势,但与正常对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05).H2O2浓度≥400 μmol/L时,HUVECs细胞存活率显著降低,经两两比较,任意2组间差异有统计学意义(P<0.05),H2O2浓度≥1 000 μmol/L时,细胞存活率显著下降,残存细胞数过少,无法满足实验需求(图2).

陈小华:10个O2O大败,9个是因为充值,至少有十几二十家来找过58到家。最近有一个主流的基金投资公司,我曾经劝他,今年你正好是0的时候,把公司卖了还有机会,但他跟我说,有投资人的压力,要撑下去。可是O2O别看公司很强大,很多公司规模很大,但其实非常脆弱,只要给提供服务的人开不出工资,无论你原来有多少单,都瞬间没了。

2.3 H2O2对HUVECs细胞凋亡的影响

  

图2 不同浓度H2O2对HUVECs存活率的影响(±s)Fig.2 The effect of different concentration of H2O2on the survival rate of HUVECs(±s)

 

与正常对照组比较,aP<0.05;与100 μM组比较,bP<0.05;与200 μM组比较,cP<0.05;与400 μM组比较,dP<0.05;与600 μM组比较,eP<0.05;与800μM组比较,fP<0.05.

  

图3 800 μmol/L H2O2作用不同时间对HUVECs细胞存活率的影响(±s)Fig.3 The effect of 800 μmol/L H2O2acting time on the survival rate of HUVECs(±s)

 

与6 h组相比,aP<0.05;与12h组相比,bP<0.05.

2.3.1 剂量效应 不同浓度H2O2处理HUVECs 24 h,细胞凋亡率逐渐增加,各个浓度组HUVECs细胞凋亡率较正常对照组升高,差异均有统计学意义(P<0.05).不同浓度H2O2组的HUVECs细胞坏死率逐渐增加,各个浓度组(除100 μmol/L组外)HUVECs细胞坏死率较正常对照组升高,差异均有统计学意义(P<0.05).结果示一定浓度的H2O2诱导的内皮细胞损伤表现为细胞凋亡与继发性坏死,100 μmol/L H2O2作用使细胞凋亡率增高,继发性死亡率增加不明显,H2O2浓度增加到200 μmol/L~800 μmol/L,细胞凋亡率递增,但继发性死亡率也相应增加,当H2O2浓度≥1 000 μmol/L,细胞存活率下降,细胞形态受损严重,细胞坏死率显著增加(图4).

2.2.2 时间效应实验 800 μmol/L H2O2分别作用HUVECs 6 h、12 h、24 h,随作用时间延长,HUVECs存活率逐渐降低(P<0.05),两两比较差异有统计学意义(P<0.05),见图3.

  

图4 不同浓度H2O2处理细胞24 h对细胞凋亡和坏死的影响(±s)Fig.4 The effect of different concentration of H2O2treating cells for 24 hrs.on cell apoptosis and necrosis(±s)

 

与0 μM组比较,aP<0.05;与100 μM组比较比,bP<0.05;与200 μM组比较,cP<0.05;与400 μM组比较,dP<0.05;与600 μM组比较,eP<0.05;与800 μM组比较,fP<0.05.

2.3.2 时间效应 800 μmol/L H2O2处理 HUVECs不同时间,随着作用时间延长,细胞凋亡率逐渐增加,24 h时达到最高(P<0.05),细胞坏死率亦随作用时间延长逐渐增加,48 h时达到最高(P<0.05),见图5.

  

图5 800 μmol/L H2O2处理HUVECs不同时间对细胞凋亡和坏死的影响(±s)Fig.5 The effect of 800 μmol/L H2O2treating cells for different times on cell apoptosis and necrosis(±s)

 

与0 h组比较,aP<0.05;与6 h组比较,bP<0.05;与12 h组比较,cP<0.05;与24 h组比较,dP<0.05.

2.4 H2O2对HUVECs ROS水平的影响

2.4.1 剂量效应 H2O2造成细胞氧化应激,使细胞内活性氧水平明显增加,各组H2O2作用HUVECs 24 h,H2O2浓度≤400μmol/L 时,随着H2O2浓度增加,胞内ROS水平逐渐增加(P<0.001),400 μmol/L 时达到最高,H2O2浓度再增加,ROS水平差异无统计学意义(P>0.05),见图6.

CCK-8实验分为2部分,剂量效应和时间效应。结果显示H2O2可呈剂量及时间依赖性地引起HUVECs存活率降低.

2.4.2 时间效应 800 μmol/L H2O2作用细胞不同时间均使胞内ROS水平逐渐增加,不同组间差异有统计学意义,且随着时间延长而递增,任意2个时间点间差异均有统计学意义(P<0.05),见图7.

  

图6 不同浓度H2O2作用HUVECs 24 h对ROS水平的影响(±s)Fig.6 The effect of different concentration of H2O2 treating cells for 24 hrs.on ROS levels(±s)

 

与正常对照组比较,aP<0.05;与200 μM组比较,bP<0.05;与400 μM组比较,cP<0.05.

  

图7 800 μmol/L H2O2作用HUVECs不同时间对ROS水平的影响(±s)Fig.7 The effect of 800 μmol/L H2O2treating cells for different times on ROS levels(±s)

 

与正常对照组比较,aP<0.05;与6 h组比较,bP<0.05;与12 h组比较,cP<0.05.

3 讨论

3.1 氧化应激与动脉粥样硬化(AS)

研究表明由氧化应激所致的内皮细胞凋亡和损伤在动脉粥样硬化的病理过程中广泛存在,血管内皮损伤或功能失调是AS及相关心血管疾病发生发展的始发事件及病理基础[6].

目前认为AS过程中引发氧化应激的原因可能有:(1)炎症:炎症和氧化应激是AS早期阶段促进血管生成的主要原因,是AS的重要标志,促进AS的发生发展.炎症过程通过ROS与氧化应激直接相关的主要因子包括:NADPH-氧化酶4(NOX-4)、氧化型 HDL(ox-HDL)、NLRP3炎症体等.(2)自噬:自噬是一种细胞质和受损细胞器的溶酶体依赖性降解,包括线粒体、内质网、过氧化物酶等,同时还有细胞内病原体的清除,以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新.自噬由低氧、炎症、内质网应激、氧化应激等激活,这些因素都包含在AS过程中.自噬能引起氧化应激的因子主要有轻链3(LC3)、凝集素样ox-LDL受体 1(LOX-1)、自噬相关基因 7(ATG7)等,可以促进AS的形成.(3)凋亡:已知的氧化应激和凋亡诱导的AS包括:粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、蛋白激酶Cβ(PKCβ)、结合珠蛋白2-2斑块、B-细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、过氧化物歧化酶(SOD)等.(4)线粒体诱导AS过程的氧化应激:动物和人体疾病模型实验均证明线粒体功能障碍能促进AS的发生发展.参与线粒体性氧化损伤并促进AS进展的包括:视黄醇结合蛋白4(RBP4)、巨噬细胞线粒体氧化(mitoOS)、线粒体基因组(mtDNA)、同型半胱氨酸、血管紧张素II等[7-8].

3.2 氧化应激与糖尿病及其并发症

“互联网+”行动计划为改变传统农业发展模式提供了新思路,是实现农业大发展的必由之路。农业发展不仅需要精准扶贫,也是发展南充经济、打造美丽南充的需要。现在,我国正处于全面建成小康社会决胜期,南充市“塌陷”地带的发展亟需采取超常规的举措来实现精准脱贫,“互联网+”的提出为南充市广大农村贫困地区的精准扶贫工作提供了新思路和新途径。通过互联网思维和技术的导入,形成了“互联网+农业”的新模式,使农业产、供、销产业链条体系和模式得到创新,休闲农业等农业新业态的产业链得到拓展。

(2)路由表膨胀等问题:当有大量的BGP被更新或注入,边界AS将会变得异常不稳定,进而导致整个路由系统的瘫痪BGP的更新搅动致使路由计算和转发表下发频繁,极大程度上破坏到路由的收敛。

2型糖尿病患者的持续高糖血症产生的ROS和RNS是糖尿病大血管和微血管并发症的主要原因.随着ROS和RNS的累积,抗氧化酶活性降低,从而导致内皮功能紊乱、胰岛素抵抗和并发症的出现.ROS还诱导解耦联蛋白2(UCP-2)表达上调,降低葡萄糖刺激的胰岛素分泌,最终导致β细胞功能损伤[11-12].

3.3 氧化应激细胞模型的构建

氧化应激模型主要有2种:动物模型和细胞模型,其中细胞模型具有完善的代谢功能及电生理特性,避免了全身不同细胞间的互相影响,特异性及可控性强,易于重复,目前应用最广泛的是过氧化氢氧化损伤模型[13].

本实验以HUVECs为研究对象,采用不同浓度梯度H2O2,与细胞培养不同时间,以筛选最佳作用浓度和时间.实验结果发现,不同浓度的H2O2作用不同时间,均可对HUVECs细胞造成损伤.笔者的研究还发现细胞损伤与H2O2,存在剂量和时间依赖性,一定浓度的H2O2,诱导的内皮损伤表现为细胞凋亡与继发性坏死,与Xu等[14]的研究结果一致.H2O2,浓度为100 μmol/L时细胞凋亡率增加,但继发性死亡率增加不明显,浓度增大到400~800 μmol/L,细胞凋亡明显增加,但继发性死亡率也明显增加,可见内皮细胞排列紊乱,细胞变形、皱缩,细胞间隙增宽,胞内颗粒增多,随着浓度增加,细胞变形、皱缩的程度越来越明显,呈半贴壁半悬浮状态;当H2O2,浓度≥1 000 μmol/L,刺激时间≥48 h,细胞形态受损严重,呈完全悬浮状态,细胞存活率显著下降,残存细胞量难以满足后续实验要求,与Lin[15]、Chen[16]等的研究结果一致.

①字段信息抽取:利用WOS导出HTML格式的题录数据,抽取题录中指定的字段信息并可选择存储为文本文档(包括:关键词、作者、期刊名等字段)。

本实验发现 800 μmol/L H2O2,作用24 h,不仅出现细胞凋亡形态和氧化标记物的变化,且可以保证一定凋亡率和不显著增加的继发性坏死率,结果证实800 μmol/L H2O2,作用24 h可以成功构建HUVECs细胞体外氧化应激模型.

基于大数据挖掘技术的智能变电站故障追踪架构//王磊,陈青,高洪雨,马志广,张艳杰,何登森//(3):84

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戴青里,孙贵虎,闫斌,郭涛,戴青原
《昆明医科大学学报》2018年第04期文献

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