片形吸虫病（Fascioliasis）是吸虫纲Trematoda，片形属Fasciola中片形吸虫寄生于哺乳动物肝脏、胆管，以肝损伤为主要表现的蠕虫病.该病呈世界性分布，为人兽共患寄生虫病[1-2].片形吸虫病常发生于牛、羊等反刍动物，引起动物消瘦、发育障碍、甚至死亡等，给畜牧业造成严重的经济损失[1-2].人类也是片形吸虫的终末宿主之一，片形吸虫病患者肝脏常损伤严重，临床上易与肝癌混淆，导致长期误诊[3].据估计，全球有60多个国家和地区约240多万人感染片形吸虫，同时，超过1.8亿人口面临感染风险[4-7].我国18个省、市、自治区累计报道片形吸虫病200余例，感染率为0.002%～0.171%[8-9]，有时呈区域流行，如2011年至2012年期间，云南省大理州宾川县累计报道感染巨片吸虫（Fasciola gigantica）28例[10-11].

根据形态学、生物学、生态学、流行病学特征等，寄生于哺乳动物的常见片形吸虫主要包括2种：肝片吸虫（F.hepatica）和巨片吸虫（F.gigantica）[12-17].过去，鉴别片形吸虫的主要形态学指标包括成虫的体长、体宽、体长/体宽等[18].但是成虫形态容易发生变异，难以通过形态学鉴定某些非典型的片形吸虫[19].随着分子生物学技术的发展，应用线粒体DNA序列和细胞核rDNA序列鉴定F.hepatica和F.gigantica，克服了许多传统形态学的弊端[20-22].尤其是细胞核DNA序列，如rDNA的ITS1和ITS2，在鉴定F.hepatica和F.gigantica时，具有较小的种内变异和显著的种间变异，成为鉴定Fasciola属内物种的有效遗传标记.有时把F.hepatica、F.gigantica的ITS1或ITS2基因分别称为该基因的Fh型、Fg型[14，23-26].随着研究的深入，日本[27]、西班牙[28]、中国[7]、伊朗[29]、韩国[27]等陆续发现了形态介于F.hepatica和F.gigantica之间的中间型片形吸虫，有学者认为其在遗传上更接近F.gigantica[30]，形态学却无法给予明确的解释[19].细胞核ITS1和ITS2序列在中间型个体为Fg型和Fh型的杂合，即Fg/Fh型[20-21].所以，许多研究者认为中间型片形吸虫是F.hepatica和F.gigantica杂交生成的杂合型后代[25，31-32].

云南省是片形吸虫的流行区域，大理宾川2011年至2012年期间发生巨片吸虫病的爆发.目前云南省主要报道存在F.hepatica和F.gigantica2种片形吸虫[10，33-34].本研究通过线粒体nad1基因和细胞核rDNA基因ITS1序列，对云南省玉溪市地区片形吸虫病患者体内获得的片形吸虫进行虫种鉴定，利于今后片形吸虫病的防治.

从制作最初始的量角器到尝试度量角的大小碰到量角的不方便，基于量角的需求，到最后完整量角器的诞生，学生一直在探索，这样的学习充分激活了学生自主学习的主动性，在不断的创造过程中不但体会到一种新的度量工具产生的全过程，还在矛盾冲突中学会了灵活量角的方法。

1 材料与方法

1.1 标本来源

本研究的2条Fasciola sp.成虫标本（标本编号为YXGD01、YXGD02），取自云南省玉溪市地区本地生活的1名女性片形吸虫病患者（47岁）的肝胆管，2015年由云南省玉溪市人民医院肝胆外科手术取出，所取成虫用75%乙醇常温固定保存，固定初期24 h换乙醇固定液1次.

1.2 主要试剂和设备

“互联网+”教育深入融合的当今时代，微课等形式作为新的教学模式在教学课堂中如火如荼进行着。为解决成人继续教育学员的工学时间矛盾的突出问题，提高教学效果和学员的学习质量为教学目标，我们将微课理念融入继续教育课程建设中，我们尝试在“C语言程序设计”这门课的继续教育中引入微课为基础的翻转课堂教学，探究其在“C语言程序设计”中的应用效果。

1.3 DNA提取、PCR扩增、测序

线粒体nad1基因片段NJ系统发育树明显分为两个类群：A类群和B类群.B类群包含全部F.hepatica，而且分支自展值达到99%.A类群包含全部F.gigantica，除AB983833聚在一起的自展值稍低外，其它F.gigantica聚在一起的自展值达到91%.所以，nad1基因片段系统发育分析支持形态学上这两个种.杂合型片形吸虫在A、B类群中均有分布，但主要分布在A类群中.在B类群中，AB207169（日本）、AB207155（澳大利亚）与AB477360（中国）是同一单倍型，日本、澳大利亚和中国的样本都有ITS1的Fg类型，但是AB477360还包含ITS1杂合型标本.A类群包含核DNA序列ITS1的Fg型和Fg/Fh杂合型，所有ITS1杂合型个体的nad1单倍型都聚为分支A1，自展值61%.分支A1包含了来自中国、韩国、缅甸、日本、尼泊尔、印度、泰国的ITS1杂合型片形吸虫.其中，KF687892单倍型对应ITS1的杂合型和Fg型个体.本研究的两个标本YXGD01和YXGD02的nad1为同一单倍型，在nad1系统发育树中位于A1分支中，但其ITS1类型分别属于Fg型和Fh型，见图1.

本实验主要研究应用于低、多层建筑的装配式节点，不须考虑重力二阶效应。采用柱两端固定梁自由端加载，水平荷载由往复作动器提供，H型不等宽翼缘钢梁通过加载头夹紧，与杭州邦威100 t液压伺服作动器连接，垂直于方钢管柱，在锚固钢梁前，通过激光测距提前画好定位线，保证钢梁、加载头，反力墙对中，用水平靠尺使钢梁垂直于地面。

0.02 mm精确度的千分尺（上海精密仪器仪表有限公司），全基因组DNA提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（日本TAKARA BIO INC.），PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司），Takara Ex Taq酶（日本TAKARA BIO INC.），dNTPs（日本TAKARA BIO INC.），Bio-Rad T100热循环仪（美国Bio-Red），GELDOC XR凝胶成像仪（美国Bio-Red）.

展望未来，正如习近平总书记在庆祝改革开放40周年大会上重要讲话所指出的那样：建成社会主义现代化强国，实现中华民族伟大复兴，是一场接力跑，我们要一棒接着一棒跑下去，每一代人都要为下一代人跑出一个好成绩。全党全国各族人民要更加紧密地团结在党中央周围，高举中国特色社会主义伟大旗帜，不忘初心，牢记使命，将改革开放进行到底，不断实现人民对美好生活的向往，在新时代创造中华民族新的更大奇迹！创造让世界刮目相看的新的更大奇迹！

1.4 序列分析和系统发育树构建

引物对ITS-1F和ITS-1R扩增出约660 bp的DNA片段，包含ITS1全长、18S和5.8S部分片段.ITS1序列全长422 bp，与GeneBank中Fasciola属该序列的长度相等.目前，Fasciola属ITS1共发现5个主要多态位点，分为3种类型.第1种出现在典型的F.gigantica（Fg型）中，包含采自中国广西、贵州，以及埃及、韩国、日本、泰国、印度尼西亚、赞比亚等的F.gigantica标本.第2种出现在典型的F.hepatica（Fh型）中，包含采自中国甘肃，以及北美洲、韩国、日本、澳大利亚、乌拉圭、新西兰等的标本.第3种是杂合型，ITS1中这5个多态位点是F.gigantica和F.hepatica的杂合（Fg/Fh型），包括采自中国甘肃、贵州、江苏、四川、黑龙江，以及来自韩国、日本的标本.本研究标本YXGD01、YXGD02的ITS1序列均为纯合子，突变位点与现有文献报道相同.但是YXGD01标本 ITS1序列（MH101465）属于 F.gigantica（Fg型），YXGD02标本ITS1序列（MH101464）属于F.hepatica（Fh型），表1.

线粒体nad1基因片段的扩增引物是Ita2和I-ta10，细胞核rDNA转录间隔区ITS1的扩增引物是ITS1-F和ITF1-R[27].所有PCR反应均采用Takara Ex Taq酶，配制25 μL反应体系，包含10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP（各 0.2 mM），模板 DNA 1～2 μL，正、反引物（100 μM）各 0.5 μL，DNA Taq聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，加去离子水补至 25 μL.Bio-Rad T100热循环仪反应程序为：94℃预变性3 min，然后运行30个循环（每个循环包括93℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min），最后72℃延伸7 min.

2 结果

2.1 ITS1序列的PCR扩增和序列分析

双向测序获得的DNA序列用软件Bioedit（Version 7.0.9.0）进行比对[35]，人工去除两端引物序列.利用在线工具BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对所测序列进行同源性初步确认，然后将所测序列送至GenBank，获取基因登录号.检索GenBank登记的Fasciola属中其它同源序列.选择相关序列与本次所测序列分别组成ITS1、nad1序列DNA数据集.对ITS1序列的标本采集点、单倍型进行统计.nad1序列尽量保留国内和东南亚地区的标本，以及通过文献确认的ITS1杂合型标本.nad1数据集中相同单倍型的序列，只选择其中1条序列保留于DNA数据集进行后续分析 .外群 选 择 F.jacksoni（EF612497）[17]，用MEGA（Version 7.0.26）内建的Clustal W默认参数对DNA数据集进行比对，再人工调整.用Mega构建线粒体nad1基因的NJ系统发育树，选择K-2参数DNA替换模型，Bootstrap值设为1000进行NJ系统发育树可靠性分析[36].

 

表1 来自不同地域的片形吸虫ITS1序列中5个多态核苷酸位点的比较Tab.1 Comparison of nucleotides at 5 variable sites in the ITS1 sequence of Fasciolaspecimens from different locations

  

ITS1突变位点和碱基 标本采集点 备注18 108 202 280 300 F.gigantica Fg T T T A T 中国（广西，贵州）、埃及、韩国、日本、泰国、印度尼西亚、赞比亚F.hepatica Fh C A C T C 中国（甘肃）、北美洲、韩国、日本、澳大利亚、乌拉圭、新西兰Fasciola sp.Fg/FhC/T A/T C/T T/A C/T 中国（甘肃，贵州，江苏，四川，黑龙江）、韩国、日本 中间型YXGD01 Fg T T T A T 云南省玉溪市 本研究YXGD02 Fh C A C T C 云南省玉溪市 本研究种名 ITS1类型

2.2 nad1基因片段的PCR扩增和序列分析

引物对Ita2和Ita10扩增的nad1基因片段长约600 bp，去除两端引物后DNA序列长 542 bp（MH106557，MH106558），与 GenBank 下载的Fasciola属相关同源nad1序列组成DNA序列数据集.ITS1杂合型片形吸虫根据文献核实，包括中国（AB207168、 KF543343、 AB477360、 AB477366、AB477367、 AB477368、 AB604941）、 韩 国（AB211240、AB211241）、日本（AB604942）、缅甸（AB604042）、越南（AB385619）、尼泊尔（AB894347、AB894348）、印度（LC012896）、泰国（KF687892、AB603740）.经Clustal W比对后进行单倍型归类，ITS1杂合型片形吸虫nad1序列中的 AB477366（中国）、AB604020（缅甸）、AB894347（尼泊尔）、AB603740（泰国）、AB385619（越 南）、AB211240（韩 国）和AB207168（日本）是同一单倍型，以AB477366代表此单倍型.AB477360（中国）、AB207169（日本）、AB207155（澳大利亚）是同一单倍型，以AB477360代表此单倍型，在参考文献中，AB207169和 AB207155的标本是 F.hepatica，AB477360在中国有2个标本，分别是对应rDNA序列的Fh型和Fg/Fh杂合型。AB477367（中国）和AB211241（韩国）是同一单倍型，对应的个体都是ITS1的Fg/Fh杂合型，以AB477367代表此种nad1单倍型.

◎对乙酰氨基酚 百服咛、泰诺林，别名扑热息痛，也是可以用的，WHO也是推荐使用，但这个药经肝脏代谢，中国乙肝高发，所以在中国建议1岁以下慎用，父母明确无乙肝病史的可以放心用。

剪取20 mg虫体标本组织，按照全基因组DNA提取试剂盒说明书中的操作方法提取总DNA，保存于-20℃备用.

取2 mL PCR产物进行1%琼脂糖电泳检测，将阳性PCR产物送至上海生工，用PCR正、反引物进行双向测序.

2.3 标本鉴定

本研究从患者体内取出的片形吸虫为成虫，经75%乙醇固定，其形态大小与固定前有所差异，所测虫体的长、宽、长/宽为参考值.YXGD01虫体长25.54 mm，宽14.28 mm，长/宽1.78，前部无明显的“肩”，尾段呈“U”，形态上与F.gigan-tica相似，其核DNA片段ITS1和线粒体nad1基因片段都对应Fg型.标本YXGD02形态较YXGD01稍小，虫体长16.70 mm，宽12.72 mm，长/宽1.31，前部有明显的“肩部”，尾呈“V”型，形态上接近F.hepatica，其核基因片段ITS属于Fh型，但是线粒体nad1对应Fg类型.

3 讨论

在虫种鉴定中，标本YXGD01的形态、线粒体nad1片段和核DNA序列ITS1都显示该标本为F.gigantica.标本YXGD02的ITS1序列显示该标本为F.hepatica（Fh型）.但是，线粒体nad1基因片段属于A类群（Fg型）.显然，标本YXGD02的细胞核和线粒体DNA序列给出了不同的鉴定结果.nad1序列数据集中KF687892单倍型对应的个体也存在类似的矛盾现象，其线粒体nad1属于Fg型，但其核DNA片段ITS1属于Fg型或Fg/Fh杂合型.目前，核DNA序列ITS1或ITS2出现Fg/Fh杂合的片形吸虫标本被鉴定为典型的Fg/Fh杂合型.显然，本研究的标本YXGD02不是属于典型的杂合型，但是，细胞核与线粒体DNA序列的不一致性强烈暗示该标本为某种杂合型个体.线粒体遗传为母系遗传，难以出现杂合现象，已被大量实验证实.二倍体生物的核基因组来自父系和母系.所以，在研究生物杂交实验时，核基因标记具有明显的优势.细胞核rDNA序列具有多个拷贝，常被用于分子进化研究，但是该区域不稳定，容易发生重组.所以，除rDNA间隔区ITS1或ITS2外，还应该寻找更理想的细胞核DNA遗传标记研究个体间杂交.虽然在大多数ITS1或ITS2序列的Fg/Fh杂合型片形吸虫中没有观察到精子，有人将其归为无精子类型，但是也有观察到少量精子的报道[30].所以，不能排除杂合型片形吸虫能形成少量的生殖细胞，并产生后代.这些因素可能导致YXGD02特殊中间型片形吸虫的产生.

统计ITS1序列Fg/Fh杂合型片形吸虫，除了AB477360单倍型个体外，大多数杂合型片形吸虫聚合在nad1系统发育树中A类群，并形成相对独立的A1分支（Fg/Fh型），自展值为63%.显然，相对于F.hepatica，细胞核杂合型片形吸虫与F.gigantica亲缘关系更密切，其母本可能起源于F.gigantica某类群，该类群中母本F.gigantica更容易与父本F.hepatica杂交，形成具有较低生殖能力的杂合型后代.另外，A1分支中Fg/Fh杂合型片形吸虫的nad1基因序列差异较小，分支短，内部分支结构的自展值低，暗示这类杂合型片形吸虫发生时间较短.该杂合型类群主要分布于中亚、东亚、南亚，如中国、韩国、日本、缅甸、越南、泰国、尼泊尔、印度等.

  

图1 基于nad1序列构建的片形吸虫（Fasciola spp.）NJ系统发育树Fig.1 The phologenetic tree ofFasciola spp.inferred from partial mitochondrialnad1sequences using the Neighbor-Joining method

 

节点处仅显示大于50%的自展值，分析中设置Bootstrap值为1000，K-2参数核苷酸替换模型.

另外，有一ITS1序列的Fg/Fh杂合型片形吸虫标本的nad1序列AB477360未聚合在系统发育树A类群，而是聚合在B类群.推测片形吸虫中具有近缘种间杂交能力的母本，主要出现在线粒体Fg类型的A类群，但也有少部分出现在线粒体Fh类型的B类群.人工杂交实验也证实Fasciola属F.gigantica和F.hepatica为近缘种，它们可以杂交形成正常的F1代和F2代[37].在自然界中，这2个近缘种存在生殖隔离，可能由于突变或进化的原因，某些类群的个体容易发生种间杂交，形成杂合型个体.

如果某片形吸虫检测到细胞核ITS1序列存在Fg/Fh杂合，可以直接证明F.gigantica和F.hepatica发生了种间杂交.本研究标本YXGD02的线粒体nad1、细胞核ITS1序列均为纯合子，但是，其ITS1和nad1序列所对应的类型不一致，笔者把标本YXGD02归为杂合型个体，该结论还有待进一步、更直接的实验证据.Fasciola属的F.gigantica和F.hepatica是感染哺乳动物和人体最主要的两种片形吸虫，如果这2种片形吸虫通过杂交获得某些优势，提高对环境的适应能力或对药物的抗性，那么，片形吸虫病的防治将更加艰巨[38].Fasciola属需要更深入的研究，尤其是F.gigantica和F.hepatica在自然界杂交形成杂合型个体的机制、进化趋势等[38].

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