牙周炎主要是由局部因素引起的牙周支持组织(牙周膜、牙槽骨、牙骨质)的慢性炎症，临床上常导致明显的牙周骨缺损。而人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)通常认为可以分化为成骨细胞、成牙骨质细胞和牙周膜成纤维细胞[1]，是牙周骨缺损修复的细胞学基础，又因其获取简便且易于分离培养，是牙周骨再生最可靠的种子细胞以及研究热点之一[2-4]，在再生医学领域有广阔的应用前景。但是hPDLSCs成骨能力有限，如何提高其成骨能力，更好地应用于骨再生领域也是目前转化医学研究方向之一。

Notch信号通路广泛存在于人体内，在进化上高度保守，相邻细胞间通过Notch受体与配体相互作用转导细胞信号，对细胞的增殖、分化及凋亡发挥重要调控作用[5-6]。γ-分泌酶是Notch信号转导过程中释放Notch受体胞内段(notch intracellular domain，NICD)这一关键步骤的关键酶。多种研究表明应用γ-分泌酶抑制剂可有效抑制其活性，阻断其激活下游基因的表达，从而影响细胞的一系列生命活动[7-8]。目前研究较多的γ-分泌酶抑制剂DAPT现已较多应用于Notch信号通路的研究中[9-10]。然而，目前尚未见DAPT作用于hPDLSCs细胞的相关研究。本实验拟通过在正常培养基中加入DAPT，观察其对hPDLSCs的增殖及成骨分化能力的作用。

在初中语文课堂中，正确运用多媒体辅助教学，有助于改变沿袭多年的“粉笔加黑板，教师一言堂”的传统模式，使课堂内容由静态的灌输变为图文声像并茂的动态传播，有利于丰富课堂信息含量，拓展学生知识面，从而大大激发学生学习的热情，提高课堂教学效率，促进学生素质的全面发展。然而，使用多媒体辅助语文教学还存在许多认识上的误区，如“唯多媒体”的思想、忽视教师的引导作用和师生的互动与交流、课件展示代替课堂教学的板书等，这些问题影响了多媒体综合效能的发挥和教学质量的提高。

1　材料与方法

1.1　主要试剂和仪器

α-MEM培养基、FBS、胰蛋白酶(0.25%EDTA-Trypsin)(Gibco，美国)，青-链霉素、PBS(Hyclone，美国)，磷酸二氢钾、维生素C、地塞米松、茜素红(Sigma，美国)，DAPT(Selleckchem，美国)，流式抗体FITC-CD73、FITC-CD90、PE-Cy7-CD34、PE-Cy7-CD45、FITC-isotype、PE-Cy7-isotype(Miltenyi，德国)，Trizol(Invitrogen，美国)，逆转录试剂盒(Takara，日本)，CCK8(碧云天，中国)，SYBR-Green试剂盒(KAPA Bionsystems，美国)，氯仿、异丙醇、乙醇(南京化学试剂公司)。超净工作台、恒温孵箱、离心机、酶标仪(MD SpectraMax，美国)，倒置显微镜(Leica，德国)，流式细胞仪(BD FACSCalibur，美国)，Q-PCR仪(Applied Biosystems，美国)。

1.2　方法

1.2.1　hPDLSCs体外培养　收集临床上正畸减数拔牙患者拔除的牙齿，用刀片刮下根中1/3牙周膜组织并用含有双抗(链霉素-青霉素)的培养基浸泡20 min，用无菌小弯剪充分剪碎，接种于直径100 mm的培养皿中，加入少量间充质干细胞培养基(15% FBS、1%链霉素-青霉素、1%维生素C)，于37 ℃、5% CO2孵箱中进行培养。每隔3 d更换1次培养基，待细胞生长汇合后，胰蛋白酶消化收集细胞，并1∶4进行传代培养。

在全面提升服务的同时，黑龙江销售还紧盯油品质量不松懈。“油品出库时有铅封、编号，保证无其他油品混入。经化验的油品到达油库后，将进行再次检测并且留样。在油品配送过程中，各分公司实行统一配送、全程监控、规定路线、规定时间的方式，确保秋收农业用油品质。”张文兴告诉记者。

1.2.2　流式细胞术检测　取第2代生长良好的hPDLSCs，胰酶消化，2%多聚甲醛固定后，用FITC标记的CD73及CD90流式抗体和PE-Cy7标记的CD34及CD45孵育30 min，用流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志物CD73、CD90及造血干细胞表面标志物CD34、CD45的表达。

1.2.3　CCK8法检测　取第2代hPDLSCs以5×103个/孔的密度接种于96孔板，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养24 h，弃去原培养基，将细胞随机分为2组：实验组加入含1 μmol/L DAPT的间充质干细胞常规培养基100 μL，对照组加入不含DAPT的培养基100 μL。分别于培养1、2、3、4、5、6 d时，避光条件下每孔中各加入10 μL CCK8继续孵育1 h后，用酶标仪测定各孔450 nm波长处的光密度(OD)值，实验重复3次。然后以培养天数为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.4　成骨诱导培养　 取第2代hPDLSCs以1×105个/孔的密度接种于6孔板，常规培养至细胞生长达80%汇合时，弃原培养基，并将细胞随机分为2组；实验组加入含有1 μmol/L的DAPT的成骨诱导培养基(含15% FBS、50 mg/L维生素C、10 nmol/L地塞米松、1.8 mmol/L磷酸二氢钾的α-MEM)，对照组加入不含DAPT的成骨诱导培养基继续培养，空白组加入间充质干细胞培养基培养。每3 d换液1次，进行后续实验。

建立企业国际化绩效评价体系的出发点，是使人们能够更加准确地把握企业国际化经营发展的变化，能够确定企业目前所处的国际化阶段和国际化发展趋势。通过构建新形势下中国企业国际化绩效评价指标体系，能够让我国企业更加清晰地认识到自身国际化发展的现状，扬长避短，找到未来发展的方向。下一步的研究应对所提出的国际化绩效评价指标体系进行实证检验，不断加以完善。

1.2.5　实时定量RT-PCR　取成骨诱导培养1周的各组细胞，用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，并用逆转录酶将其合成cDNA。然后以cDNA为模板，18S为内参照，进行PCR反应，分别检测各组细胞中成骨相关基因碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨钙素(osteocalcin，OCN)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、(collagen type Ⅰ，COL-Ⅰ)、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor-2，Runx2)及Notch信号通路下游基因Hes-1、Hey-1和Notch信号通路配体JAG1等基因的表达水平，利用GraphPad Prism 7软件进行数据分析。PCR反应体系及反应条件均严格按照产品说明书，所用引物由南京金斯瑞公司合成，具体引物序列见表1。

第二,回答了为什么建设生态文明。生态环境是一个国家和地区综合竞争力的重要组成部分,也是民众基本生存条件和生活质量的保障与体现。生态环境保护,事关民生,事关发展,事关民众的基本发展机会、能力和权益,惠及当代,亦造福子孙。建设生态文明,增加优质生态产品的供给,也是增强民众获得感和幸福感的关键。

1.2.6　茜素红染色　取成骨诱导培养21 d的各组细胞，经茜素红染色后，倒置显微镜下观察其矿化结节形成情况，拍照，Image-Pro Plus图像处理软件进行矿化结节定量分析。

1.3　统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，实验组与对照组比较用两独立样本t检验，检验水准α= 0.05。

按：“悖與”字，涵芬楼、三家本原作“荐興”。“悖與”形近误录。《尔雅》：“荐，再也。”“荐興”谓再兴盛也。

 

表1　引物序列Tab.1　Sequences of primers

  

基因名称引物序列(5'→3')ALPF:GGACATGCAGTACGAGCTGAR:GCAGTGAAGGGCTTCTTGTCCOL-ⅠF:GTGCGATGACGTGATCTGTGAR:TGGTCGGTGGGTGACTCTGOCNF:TGCAGAGTCCAGCAAAGGR:CCCAGCCATTGATACAGGTAGOPNF:CCGAGGTGATAGTGTGGTTTATGR:CTTTCCATGTGTGAGGTGATGTRunx2F:CGCATTCCTCATCCCAGTATR:GACTGGCGGGGTGTAAGTAAHes1F:GGCCAATTTGCCTTTCTCATCR:ACTGCGTTAGGACCCACCGAHey1F:CACGCCCTGGCTATGGACTAR:TGCGTAGTTGTTGAGATGGGAGJAG1F:AAAACACAACCAATCGGCAAGTCACR:GGCAACCTCAGCATCACATAGAACA18SF:CAGCCACCCGAGATTGAGCAR:TAGTAGCGACGGGCGGTGTG

2　结　果

2.1　hPDLSCs的分离培养结果

组织块联合酶消化法获得的hPDLSCs呈典型的成纤维细胞状态(图1A)，并具有克隆形成能力(图1B)；传代后多数细胞呈长梭形或短梭形，生长快慢不等，传至5～6代时其形态均无明显改变，具有成体干细胞的特征(图1C)。

 

A：hPDLSCs原代培养组织块；B：原代培养4 d后，可见克隆集落；C：1～2代hPDLSCs，细胞大小、形成形态均一，单个细胞呈梭形

图1　hPDLSCs的原代培养(×100)

Fig.1　Primary culture of hPDLSCs

2.2　hPDLSCs表面标志物的表达

流式细胞术结果显示，间充质干细胞表面标志物CD73(94.49%)、CD90(98.74%)阳性表达，造血干细胞表面标志物CD34(2.07%)、CD45(0.62%) 阴性表达(图2)。

 

A：CD34-+ CD73+；B：CD45-+CD90+；C：ISOTYPE FITC+PE

图2　流式细胞术检测hPDLSCs表面标记物

Fig.2　hPDLSCs examined by flow cytometry forthedetection of stem cell markers

2.3　DAPT对hPDLSCs增殖能力的影响

CCK8检测结果显示，实验组加入1 μmol/L DAPT的hPDLSCs培养后，在所有时间点的细胞增殖能力与对照组之间无明显差别(P>0.05)(图3)。

1.2 方法 以专家座谈、书面邮件和电子邮件函询的方式，向咨询专家发放咨询表，主要咨询评估框架中分娩时综合评估指标及内容的合理性、正确性和全面性。

  

图3　DAPT对hPDLSCs增殖能力的影响Fig.3　Effects of DAPT on the proliferation of hPDLSCs

2.4　DAPT对hPDLSCs成骨分化能力的影响

空白组使用人间充质干细胞培养基，对照组使用人间充质干细胞成骨诱导培养基，实验组使用含1 μmol/L DAPT的人间充质干细胞成骨诱导培养基，对hPDLSCs进行诱导培养1周。实时定量RT-PCR检测结果显示，加入DAPT后，实验组中ALP、OCN、OPN等各成骨相关基因的表达水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)(图4)；Notch信号通路下游基因Hes1、Hey1的表达显著降低，与对照组的比值分别为0.22、0.31，Notch信号通路配体JAG1表达高于对照组，是对照组的2.56倍，差异有统计学意义(P<0.05)(图5)。茜素红染色结果显示，实验组细胞的矿化结节形成量高于对照组及空白组(图6)。以上结果提示，1 μmol/L DAPT对hPDLSCs的成骨分化具有促进作用。

 

*：与空白组比较，P<0.05；#：与对照组比较，P<0.05

图4　DAPT对hPDLSCs成骨相关基因表达的影响

Fig.4　Effects of DAPT onosteogenic differentiationrelated genes of hPDLSCs

  

图5　DAPT对Notch信号通路相关基因表达的影响Fig.5　Effects of DAPT on Notch signal pathwayrelated genes

 

A～C：依次为空白组、对照组、实验组；D：矿化结节定量分析结果；*：与空白组比较，P<0.05；#：与对照组比较，P<0.05

图6　DAPT对hPDLSCs成骨分化的影响(茜素红染色)

Fig.6　Effects of DAPT on the osteogenic differentiationof hPDLSCs (alizarin red staining)

3　讨　论

牙周炎是一种常见病、多发病，因其对牙周支持组织的破坏，常常导致严重的牙周骨缺损，如何恢复由此导致的大面积骨缺损，是目前临床面临的巨大挑战。目前，组织工程骨为骨再生带来了新的希望，其中作为种子细胞之一的牙周膜间充质干细胞，因具有取材方便及多向分化潜能，自分离培养成功以来，国内外大量研究应用牙周膜干细胞进行牙周组织再生并已成为干细胞新的研究热点[10-12]。由于牙周膜干细胞传代次数限制，传代后有限的成骨能力而限制了其临床应用。在基于干细胞的再生医学研究中，利用合适浓度的生长因子调控干细胞的增殖和分化也是是研究者们关注的焦点[13-14]。

Notch信号通路由Notch受体、Notch配体(DSL蛋白)及细胞内效应器分子(CSL-DNA结合蛋白)等组成，广泛存在于人体内，在进化上高度保守，是相邻细胞之间通讯进而调控细胞发育的重要通路[15]。Notch信号的产生是通过相邻细胞的Notch配体与受体相互作用转导细胞信号，Notch蛋白经过三次剪切，由胞内段(NICD)释放入胞质，并进入细胞核与转录因子CSL结合，形成NICD/CSL转录激活复合体，从而激活靶基因，调节细胞的分化、凋亡、增殖等。γ-分泌酶是Notch信号转导过程中的关键酶，其抑制剂DAPT可有效抑制γ-分泌酶活性，从而抑制Notch信号通路的活化[16]。然而，目前尚未见DAPT作用于hPDLSCs的相关研究。本研究通过在正常培养基中加入DAPT，探讨其对hPDLSCs Notch信号通路的作用，以及对hPDLSCs的增殖活性和成骨能力的影响，并初步探讨其作用机制。

本实验体外培养扩增hPDLSCs，流式细胞术检测其间充质干细胞特异性标记物CD73、CD90和造血干细胞特异性标记物CD34、CD45的表达，结果显示CD73、CD90阳性表达，CD34、CD45阴性表达，结合细胞形态学结果，证实其为人牙周膜干细胞(hPDLSCs)。本研究预实验结果显示不同浓度的DAPT对hPDLSCs的增殖影响无明显不同，而1 μmol/L DAPT成骨效果最好。体外研究发现实验组hPDLSCs与对照组hPDLSCs的增殖能力无明显差别，提示DAPT对hPDLSCs的增殖没有明显影响。为了证明DAPT对于Notch信号通路的抑制作用，我们利用RT-PCR方法检测了成骨相关基因的表达，发现添加1 μmol/L DAPT的实验组成骨相关基因表达水平明显升高，Notch信号通路下游基因Hes1、Hey1的表达显著低于对照组，Notch信号通路配体JAG1表达高于对照组，由此说明DAPT能有效抑制hPDLSCs的Notch信号通路。茜素红染色结果亦证明DAPT对hPDLSCs的成骨分化具有促进作用。相关研究表明，特定浓度的Notch信号通路配体可降低牙周膜干细胞和成骨细胞成骨分化过程中的矿化结节的形成量，并抑制其成骨相关基因的表达水平[17-20]，与本研究结果相互印证，进一步证实了抑制Notch信号对于hPDLSCs的成骨分化具有一定的调节作用。

[7]　Li R, Zhang Q. HtrA1 may regulate the osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells by TGF-β1[J/OL]. J Mol Histol，2015，46(2)：137-144[2018-02-01]. http://dx.doi.org/10.1007/s10735-015-9612-9.

[参　考　文　献]

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任何一个理论的传播都离不开大众媒介，“人类有了某种媒介才有可能从事与之相适应的传播和其他社会活动。”麦克卢汉说：“正是传播媒介在形式上的特性——它在多种多样的物质条件下一再重现——而不是特定的讯息内容，构成了传播媒介的历史行为功效。”［1］148“媒介是理论传播的助推器和重要载体。传播媒介大致有两种含义：第一，它指信息传递的载体、渠道、中介物、工具或技术手段；第二，它指从事信息的采集、加工制作或传播的社会组织。”［1］147

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传统的教学多以教师讲授为主，以教师为主体，易于控制教学的进程，逻辑性和系统性相对较强，学生遵循教师的讲解，易于快速形成知识结构和体系．然而，这种教学方法不利于调动学生的积极性和主动性，学生的参与意识不强，因此需要改变授课方式．

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Notch信号通路对人体内成骨的调控作用是极其复杂的。本研究只是从一个角度来研究了抑制Notch信号通路对hPDLSCs的影响，发现1 μmol/L DAPT可以通过抑制Notch信号通路从而提高hPDLSCs体外成骨能力，hPDLSCs的成骨能力在转录水平上起到提高作用。在今后的体内实验中将进行更加深入细致的研究，以期更好的掌握Notch信号对hPDLSCs细胞增殖分化的调控作用，为PDLSCs的临床转化研究提供参考。

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返乡创业农民工是壮大非遗文化产业的重要主体。由于返乡创业农民工了解外面的市场需求，当家乡的乡村旅游、文化休闲、观光农业等产业发展起来时，具有历史记忆、地域特点、民族风情的特色文化产品逐渐被人接受与熟识，因此返乡创业农民工能够参与市场竞争，做大做强非物质文化遗产的产业项目，推动非物质文化遗产的产业化发展。同时农民工返乡创业集群多渠道引进资金、人力来实现中小非遗文化企业的培育，有利于壮大非遗文化产业发展队伍，提升非遗文化产业的整体实力。

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其实，在科学研究领域，像覃重军这样的“异想天开”不妨多一些。科技史一再证明，一些“异想天开”往往是科学探索的起点，不少科学发现来源于此。150多年前，法国科幻作家儒勒·凡尔纳曾在自己描述宇航生活的作品《从地球到月球》中写道：3位探险家乘坐一枚大炮弹飞上了月球。后来，有科学家受“乘炮弹飞上月球”的启发，写成了世界上第一部研究以火箭解决星际飞行问题的科学著作。

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数码相机的缺点是拍摄到的星星实在太多，包括那些肉眼不可见的星星。Alyn使用雾化滤镜创造柔焦效果，让最亮的星星发光，同时让亮度较弱的星星不受影响，这有助于让星座在他的照片中更加明显，例如这张大北斗星的照片。Alyn正在筹备自己的星光滤镜，很快就会上市。我

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