随着科学技术和社会的发展，新化学物质日益增多，尤其以“减少、优化、替代”为核心的“3R”理论的提出，使传统的毒理学评价方法面临着新的挑战[1]。发展有效的体外毒理学替代方法代替动物试验，以及对现有体外检测方法的改进已成为现代毒理学研究的热点[2，3]。细胞电化学是化学、生物、材料等多学科交叉的新兴领域，它采用电化学方法检测细胞生理活动过程中的电荷转移变化，近年来已被用于细胞毒性、雌激素效应等毒理学检测中[4～8]。体外哺乳动物细胞基因突变试验是检测化学品致突性的传统方法之一，然而此方法存在检测周期长、结果主观性强等问题。中国仓鼠V79细胞是体外哺乳动物细胞基因突变试验经典模型细胞，本文首次研究了中国仓鼠V79细胞的电化学行为，并对细胞的电化学信号进行了归属，为以此细胞为模型的体外哺乳动物细胞基因突变电化学试验新方法的建立奠定理论和实验基础。

1　材料与方法

1.1　仪器与试剂

电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；HH.CP-T型二氧化碳培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；Olympus倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；VS-1300U超洁净工作台(苏州华宇净化设备有限公司)；安捷伦1100高效液相色谱仪系统(美国沃特世(Waters)公司)；Ag/AgCl电极、铂丝电极、玻碳电极(3mm)(武汉高仕睿联科技有限公司)；V79细胞购于上海细胞库；DMEM培养基、优级胎牛血清、链霉素和青霉素等购于美国Gibco公司；黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿酸、离子液体([BMIMP]F6 )等购于美国Sigma公司；多壁碳纳米管(MWNTS)购于深圳纳米港有限公司；其它试剂均为分析纯。

1.2　方法

1.2.1　MWNTs-IL/GCE电极的制备及电化学检测

将多壁碳纳米管与离子液体按照1:20的比例混合均匀，将其均匀涂于抛光处理过的玻碳电极表面，室温下干燥，即得多壁碳纳米管/离子液体修饰玻碳电极(MWNTs-IL/GCE)。实验采用三电极系统，MWNTs-IL/GC为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，Pt丝为辅助电极。循环伏安扫描范围为0.0～1.1V，扫速为0.05V·s-1。除特殊说明，测定均在室温条件下进行，检测前溶液需先富集360s。检测后电极需在pH值为7.4的PBS溶液中扫描5圈，以更新电极。

大多数设计咨询企业成本核算以企业内设部门为归集对象，企业预算及考核也以部门为单位。虽然部分项目直接投入成本和部分人工成本可归集到项目中，但因项目人员构成比较复杂，独立人员投入单一项目少，大多设计咨询人员一人负责多个项目。这为人工费用的分劈带来困难，人工成本无法准确归集到项目，致使无法核算出单个项目真实成本。

积极落实最严格水资源管理制度。制订实施了《海委推动落实最严格水资源管理制度重点工作任务分工》，积极推进“三条红线”指标向市县一级分解。完成清漳河等4条流域省界河流水量分配成果及滹沱河、北运河水量分配技术方案，滦河、卫河水量分配工作相继启动。编制完成《海河流域重要江河湖泊水功能区纳污能力核定和分阶段限制排污总量控制方案》。完成“海河流域三条红线控制指标细化”“年度指标评价方法”等技术成果和水资源监控能力建设任务，为流域最严格水资源管理考核工作奠定坚实基础。

1.2.2　V79细胞的培养、收集和处理

高角度裂缝的电阻率在致密高阻背景下略有降低，曲线形状平缓，深、浅侧向一般呈正差异。裂缝内充满泥浆时，在给定条件下，双侧向测井响应的电导率与裂缝的张开度成正比。张开度越大，深、浅侧向测井响应电阻率降低越明显。一般情况下，浅侧向降得更快，使得深、浅侧向测井响应幅度差异增大。

图1为MWNTs-IL/GCE 在pH 7.4 PBS和V79细胞裂解液中的循环伏安行为。由图1a可知，MWNTs-IL/GCE在pH 7.4的PBS缓冲溶液中，没有检测到信号峰；而在V79细胞裂解液中检测到三个明显的信号峰，峰电位分别为0.32V、0.69V和1.03V(见图1b)。为了确定三个电化学信号峰的归属，将其与腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和尿酸标准品的电化学信号进行了比对，发现信号I与尿酸标准品(0.33V)、信号II与黄嘌呤和鸟嘌呤标准品(分别为0.69V和0.72V)、信号III与腺嘌呤和次黄嘌呤标准品(分别为0.98V和1.02V)相接近(见图1嵌图)。因此，信号I可能为尿酸峰、信号II可能为黄嘌呤与鸟嘌呤的混合信号峰、信号III可能为腺嘌呤和次黄嘌呤混合信号峰。

将上述裂解后的V79细胞高速离心(14000 r·min-1，10 min)，0.22μm滤膜过滤以除去蛋白质后进行高效液相检测，检测条件为Ascenis RP-Amide 柱(250mm×4.0mm ID，5.0μm)，DAD检测器，检测波长254nm，流速1.0 mL·min-1，进样量20μL，流动相为pH值4.0的KH2PO4溶液。

1.2.3　V79细胞的高效液相检测

V79细胞按常规培养于含有10%体积初生胎牛血清、1%体积非必需氨基酸，谷氨酰胺和双抗的完全培养基中，37℃的温度下、CO2浓度5%、在100%饱和湿度的细胞培养箱中培养。取对数生长期细胞，用pH值为7.4的PBS清洗2次，胰酶消化后加入适量pH值为7.4的PBS，50℃恒温水浴加热裂解30min后，按照1.2中方法进行电化学检测。

2　结果

2.1　V79细胞裂解液电化学行为

绝缘子涂层缺陷检测研 究 …………………………………………………………………… 刘 雨，田立国（34）

  

图1　V79细胞裂解液循环伏安行为

 

(a)MWNTs-IL/GCE在pH 7.4 PBS中，(b)MWNTs-IL/GCE在V79细胞裂解液中。V79细胞浓度：1×106 mL-1

 

嵌图：尿酸(UA)、黄嘌呤(X)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和次黄嘌呤(HX)标准品的电化学行为

2.2　V79细胞裂解液高效液相色谱分析

为了进一步确定3个信号峰的来源，进行了高效液相色谱检测，见图2。V79细胞裂解液保留时间分别为12.32, 13.57, 15.38, 17.48 and 27.78min的色谱峰(图2b)，在加入尿酸、次黄嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤5种标准品后，色谱峰均明显增大，说明这5个保留时间出现的色谱峰分别是细胞中的尿酸、次黄嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤。细胞中存在尿酸、次黄嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤5种电活性物质。

  

图2　V79细胞裂解液与四种嘌呤标准品混合物高效液相色谱图

(a )V79细胞裂解液中加入四种嘌呤和尿酸标准品混合液 (b )V79细胞裂解液

2.3　黄嘌呤氧化酶对V79细胞裂解液的影响

黄嘌呤氧化酶是嘌呤分解代谢过程中的一种很重要的酶，专项催化由黄嘌呤形成尿酸以及次黄嘌呤形成黄嘌呤的过程。由图3a可见，V79细胞裂解液在MWNTs-IL/GCE上呈现三个电化学信号峰，加入黄嘌呤氧化酶后，信号Ⅲ几乎消失，信号II明显减小而信号I增大(见图3b)。此结果表明信号III为次黄嘌呤和腺嘌呤混合信号峰，而且以次黄嘌呤对信号的贡献为主，在黄嘌呤氧化酶的作用下，次黄嘌呤转化为黄嘌呤进而转化为尿酸，使信号Ⅲ大大下降。信号II明显减小说明信号II中的黄嘌呤转化为尿酸，仅剩下鸟嘌呤对电化学信号II的贡献。信号I明显增大说明系统中次黄嘌呤和黄嘌呤最终均转化为尿酸。通过黄嘌呤氧化酶的催化作用，进一步验证了V79细胞裂解液的三个电化学信号峰分别为尿酸信号峰、黄嘌呤和鸟嘌呤混合信号峰以及次黄嘌呤和腺嘌呤混合信号峰。

  

图3　V79细胞裂解液循环伏安图

 

(a)加入黄嘌呤氧化酶前，(b)加入黄嘌呤氧化酶后

3　讨论

本文以MWNTs-IL/GCE为工作电极，采用循环伏安法研究了V79细胞的电化学行为。检测到细胞的三个电化学信号，分别为0.32V的尿酸、0.69V的鸟嘌呤和黄嘌呤混合信号峰以及1.03V的腺嘌呤和次黄嘌呤混合信号峰。本课题组在前期MCF-7、PC12等细胞的电化学行为研究中，已检测出了细胞的位于0.7V和1.0V左右的两个信号峰，分别归属于黄嘌呤和鸟嘌呤混合信号峰以及腺嘌呤和次黄嘌呤混合信号峰[9,10]。本研究首次在细胞中同时检测到了三个电化学信号峰。这可能与V79细胞比较强的嘌呤代谢能力有关。然而，由于黄嘌呤与鸟嘌呤、腺嘌呤与次黄嘌呤结构相近，出峰位置相近，以目前工作电极仍然很难将它们区分，因此信号II和信号III仍然为黄嘌呤和鸟嘌呤以及腺嘌呤和次黄嘌呤的混合信号峰。V79细胞三个信号峰的检测，为以嘌呤为指标，建立哺乳动物体外致突变电化学检测方法奠定了基础，也为细胞电化学的应用开辟了新的方向。

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[4]高体玉, 冯军, 慈云祥. 细胞电化学的研究进展[J]. 化学进展, 1998, 10(3): 305-311

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[8]Jinlian Li, Jia Song, Sheng Bi, et al.. Electrochemical estrogen screen method based on the electrochemical behavior of MCF-7 cells[J]. Journal of Hazardous Materials, 2016, 313:238-243

[9]Jingtao Wang, Liya Ge, Xing Yuan, et al. Detection of the cell viability and proliferation using two-signal electrochemical method[J]. Analyst, 2012, 137(14): 3230-3233

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